專利名稱：檢測SLC26A4基因c.232T＞C突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測基因突變的試劑盒，尤其涉及檢測SLC26A4基因c. 232T > C(p.Y78H)突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且發(fā)現(xiàn)該基因突變可以導(dǎo) 致一種常染色體隱性遺傳性疾病=Pendred綜合征，臨床表現(xiàn)為甲狀腺腫，及合并前庭導(dǎo)水 管擴大或Mondini畸形(前庭導(dǎo)水管擴大合并耳蝸發(fā)育不全)的感音神經(jīng)性耳聾。后來， Usami等對6例單純前庭導(dǎo)水管擴大家系的SLC26A4基因的篩查結(jié)果表明，該基因的突變還 可以導(dǎo)致單純前庭導(dǎo)水管擴大，其遺傳模式也是隱性遺傳。由此可見，SLC26A4基因突變可 以導(dǎo)致前庭導(dǎo)水管擴大——單純性前庭導(dǎo)水管擴大或者是合并耳蝸畸形的前庭導(dǎo)水管擴 大。前庭導(dǎo)水管擴大是內(nèi)耳最常見的畸形，其在遺傳性耳聾中占到1 8%。臨床上主要 表現(xiàn)為高頻聽力損失為主的感音神經(jīng)性耳聾，聽力損失程度多表現(xiàn)為重度或者是極重度耳 聾，發(fā)病多在兒童時期，其發(fā)病前常有感冒、發(fā)燒、外傷等使顱內(nèi)壓增高的誘因。與前庭導(dǎo)水管擴大相關(guān)的SLC26A4基因mRNA全長4930bp，含21個外顯子，開放 閱讀框架2343bp，貫穿外顯子2和外顯子21。該基因編碼的蛋白——Pendrin是一個分子 量為86kD，含780個氨基酸的跨膜蛋白，屬于離子轉(zhuǎn)運子家族。Scott和Bidart等的研究 發(fā)現(xiàn)，Pendrin主要表達于甲狀腺濾泡細胞的頂膜及內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊的主細胞，介導(dǎo)碘 離子和氯離子的轉(zhuǎn)運，在維持甲狀腺組織和內(nèi)淋巴的離子平衡上發(fā)揮作用。在甲狀腺，當(dāng) Pendrin功能障礙時，其不能把碘離子及時轉(zhuǎn)運到濾泡膠質(zhì)，使碘離子在濾泡細胞內(nèi)積聚， 從而不能有效有機化并與甲狀腺球蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致Pendred綜合征中甲狀腺腫的發(fā) 生。Qvortrup等認為，大鼠的內(nèi)淋巴囊類似甲狀腺濾泡，有平衡膠狀物質(zhì)填塞囊腔，內(nèi)淋巴 囊主細胞的功能類似于甲狀腺濾泡細胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白質(zhì)。氯離子轉(zhuǎn)運障 礙使內(nèi)淋巴液的成分改變，從而損傷感覺上皮細胞，導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾，并且由于滲透壓 改變和成分改變的毒性機制導(dǎo)致膜迷路結(jié)構(gòu)改變。由于內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊到4歲時才停 止發(fā)育，因此它們的擴大可以導(dǎo)致周圍骨性結(jié)構(gòu)的改變，例如前庭導(dǎo)水管或耳蝸結(jié)構(gòu)的改 變。對于前庭導(dǎo)水管擴大患者SLC26A4基因突變的篩查，國外已經(jīng)廣泛開展，報道的 致病突變位點超過200個，包括錯義突變、框移突變、無義突變及剪接位點突變，分布于各 個外顯子。SLC26A4基因具有明顯的異質(zhì)性，不同種族其突變形式不完全相同。該基因突變 后其編碼的蛋白不能準(zhǔn)確定位到細胞膜上，而是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者是高爾基體內(nèi)，影響離 子轉(zhuǎn)運。但目前尚無c.232T>C突變的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種判定待測個體的樣本是否存在SLC26A4 基因突變的檢測SLC26A4基因c. 232T > C突變的試劑盒。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供該試劑盒在檢測前庭導(dǎo)水管擴大相關(guān) 的位于SLC26A4基因的232位突變中的應(yīng)用。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種檢測SLC26A4基因c. 232T > C突變的試劑 盒，包括——針對SLC26A4基因或SLC26A4基因編碼區(qū)第232位堿基附近設(shè)計的PCR弓丨 物；——PCR反應(yīng)試劑；——檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑。 所述PCR引物為15 30個堿基，GC含量為45 50%。所述PCR引物中上游引物為SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，；下游引物為SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，。所述PCR 反應(yīng)試劑為 2. 5μ 1、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 緩沖液，2. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP，0. 3μ 1、5υ/μ 1 的耐熱聚合酶，0. 25 μ 1 熒光染料(Big-Dye mix)。所述檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑為測序檢測試劑、限制性內(nèi)切酶酶切檢測試劑、限 制性長度多態(tài)性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑或雜交探針檢測試劑中的任意一種。如上所述的檢測SLC26A4基因c. 232T > C突變的試劑盒在檢測前庭導(dǎo)水管擴大 相關(guān)的位于SLC26A4基因的232位突變中的應(yīng)用，包括以下步驟(1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取基因組DNA ；(2)以所述DNA為模板，采用所述PCR引物進行PCR反應(yīng)，得到PCR擴增產(chǎn)物SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，；(3)將所述PCR擴增產(chǎn)物純化后進行直接測序，并將測序結(jié)果與SLC26A4基因標(biāo)準(zhǔn) 序列進行比較，確定是否存在SLC26A4基因的c. 232T > C突變位點；(4)判斷待測個體是否為SLC26A4基因突變c. 232T > C導(dǎo)致的前庭導(dǎo)水管擴大。該應(yīng)用還包括按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c. 232T > C突變，使得位于 Pendrin氨基端的第78位極性中性酪氨酸變?yōu)閴A性組氨酸。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、由于本發(fā)明中設(shè)有針對SLC26A4基因或SLC26A4基因編碼區(qū)第232位堿基附近 設(shè)計的PCR引物，因此，利用該引物并配合PCR反應(yīng)試劑和檢測試劑，可有效地判斷來自于 患者的待測樣本中是否存在SLC26A4基因c. 232T > C突變，從而為判斷該患者前庭導(dǎo)水管 擴大發(fā)生原因提供依據(jù)。2、由于本發(fā)明在實際應(yīng)用時，以基因組DNA為模板，利用針對SLC26A4基因或 SLC26A4基因編碼區(qū)第232位堿基附近設(shè)計的PCR引物進行擴增、檢測，因此，本發(fā)明具有快 速、靈敏度高、特異性強的特點。
具體實施例方式檢測SLC26A4基因c. 232T > C突變的試劑盒，包括——針對SLC26A4基因或SLC26A4基因編碼區(qū)第232位堿基附近設(shè)計的PCR引物； ——PCR反應(yīng)試劑； ——檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑。 其中PCR引物依據(jù)已知的核苷酸序列設(shè)計為15 30個堿基，GC含量為45 50%。本 發(fā)明應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件primer 3. 0設(shè)計了一對PCR引物，其序列為上游引物SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，(Nt2898_Nt2917)；下游引物SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，(Nt3277_Nt3297)。所述PCR 反應(yīng)試劑為 2. 5μ 1、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 緩沖液，2. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP，0. 3μ 1、5υ/μ 1 的耐熱聚合酶，0. 25 μ 1 熒光染料(Big-Dye mix)。檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑為測序檢測試劑、限制性內(nèi)切酶酶切檢測試劑、限制性 長度多態(tài)性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑或探針雜交檢測試劑中的任意一種。檢測SLC26A4基因c. 232T > C突變的試劑盒在檢測前庭導(dǎo)水管擴大相關(guān)的位于 SLC26A4基因的232位突變中的應(yīng)用時，可采用本領(lǐng)域的任何檢測點突變的方法來進行，例 如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))_測序法、采用標(biāo)記的SLC26A4基因DNA雜交探針法或用限制性片 段長度多態(tài)性方法或序列特異性引物的方法等。檢測SLC26A4基因c. 232T > C突變的試劑盒在檢測前庭導(dǎo)水管擴大相關(guān)的位于 SLC26A4基因的232位突變中的應(yīng)用時，采用PCR擴增-直接測序法，該法包括以下步驟(1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取基因組DNA ；(2)以DNA為模板，采用PCR引物進行PCR反應(yīng)，得到PCR擴增產(chǎn)物SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3‘SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3‘；(3)將PCR擴增產(chǎn)物純化后應(yīng)用ABI公司3730DNA測序儀進行直接測序，正反 向測序，并將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上的SLC26A4基因標(biāo)準(zhǔn)序列 (NT_007933)進行比較，確定是否存在SLC26A4基因的c. 232T > C突變位點；(4)判斷待測個體是否為SLC26A4基因突變c. 232T > C導(dǎo)致的前庭導(dǎo)水管擴大。進一步地，該應(yīng)用可以選擇性地包括按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c. 232T > C突變，使得位于Pendrin氨基端的第78位極性中性酪氨酸變?yōu)閴A性組氨酸(參見核苷 酸或氨基酸序列表)，該突變使位于SLC26A4基因編碼區(qū)的第232位堿基由T變成C，使得 編碼的蛋白Pendrin氨基端的第78位極性中性酪氨酸(Y)變?yōu)閴A性組氨酸(H)。實施例1待測血樣提取與SLC26A4基因編碼區(qū)的PCR擴增一、待測對象血樣DNA的制備1、研究對象對8例散發(fā)非綜合征型前庭導(dǎo)水管擴大患者和150名無家族史的聽力正常對照， 按照下述方法進行SLC26A4基因的篩查。8例患者中，1例患者表現(xiàn)為前庭導(dǎo)水管擴大的 異常聽功能特征，顳骨CT掃描證實雙側(cè)前庭導(dǎo)水管擴大。對這例前庭導(dǎo)水管擴大患者的 SLC26A4基因檢測發(fā)現(xiàn)患者為c. 232T > C突變和另外一種突變的復(fù)合雜合子?；颊叩哪赣H為單純C. 232T > C突變的攜帶者，父親為另一種突變的攜帶者。對150名聽力正常者的篩 查中未發(fā)現(xiàn)c. 232T > C突變者。對所有參加者詳細調(diào)查其病史以及家族史，并對其進行體格檢查，耳科檢查包括 耳鏡檢查、聽力學(xué)評估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5 10ml。2、基因組DNA提取 采用鹽析法提取DNA。第一天1)取檸檬酸鈉或EDTANa2抗凝全血3 5ml，置于50ml有蓋離心管。2)按全血體積的5 8倍加入(將離心管加滿即可)冷蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，在 4°C下以3600rpm的速率離心20min。3)緩慢傾倒上清液，在沉淀中加入預(yù)冷的體積濃度為0. 的聚乙二醇辛基苯基 醚(Triton-X 100)，將離心管加滿即可；輕柔混勻沉淀，在4°C下以3600rpm的速率離心 20min，棄上清，得到沉淀物。4)在沉淀物中加入2.0ml裂解液，徹底打碎沉淀，然后加入體積濃度為10%的 十二烷基硫酸鈉(SDS) 150 μ 1 (至終濃度為0. 5% )，混勻。5)加入10mg/ml蛋白酶K 50 μ 1，混勻，50 55°C加熱3小時；或36. 5 37. 5°C 加熱，過夜消化。第二天6)加入 6. OMNaCl 750ml，劇烈振蕩。7)在4°C下以3600rpm的速率離心40min，將上清液移至另一有蓋離心管中。8)加入上清液2倍體積的無水乙醇或體積濃度為95%的乙醇，反復(fù)顛倒混勻至出 現(xiàn)絮狀DNA沉淀，挑出DNA至一艾本德管(Eppendorf管)中。9)用體積濃度為80 %的乙醇洗滌DNA 2遍。將DNA保存在體積濃度為80 %的乙 醇中，放置于冰箱中備用。10)若需要請置于真空抽干或在空氣中晾干，注意不要過于干燥。11)加入TE緩沖液溶解DNA (需要3 4天)，放于冰箱冷藏中存放。二、SLC26A4基因編碼區(qū)的PCR擴增1、引物序列應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件primer 3. O設(shè)計了一對PCR引物，其序列為上游引物SLC26A4-3F 5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，下游引物SLC26A4-3R:5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，；SLC26A4正?；虻臉?biāo)準(zhǔn)序列可以參考例如NCBI :ID:NT_007933。2、PCR反應(yīng)體系的建立(參見表1)表1SLC26A4基因的PCR反應(yīng)體系 其中緩沖液、普通Taq酶從寶生物基因公司購得，dNTP從寶生物公司購得，引物 invitrogen反應(yīng)過程PCR反應(yīng)在ABI公司9700熱循環(huán)儀上進行，95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變 性45秒，61V退火45秒，72 0C延伸45秒，16個循環(huán)，每循環(huán)下降0. 5 °C，再95 °C變性45秒， 54°C退火45秒，72°C延伸45秒，進行28個循環(huán)，再72°C延伸10分鐘，4°C保存。實施例2SLC26A4基因編碼區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的純化和定量
一、PCR產(chǎn)物的純化——96孔板法1、向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入50 μ 1無菌水，混勻。2、將其轉(zhuǎn)移到Millipore純化板中，放到真空泵上抽濾3 4分鐘，看到純化板中 沒有水即可。3、向純化板中再次加入50 μ 1的去離子水，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒有水為止。4、將純化板從真空泵上取下，向板中加入20 μ 1的去離子水，靜止15分鐘，再震蕩 15分鐘，然后吸到一新96孔板內(nèi)。5、保存在-20 V冰箱中。二、電泳定量1、樣品準(zhǔn)備取一 96孔點樣板，每孔先加上樣緩沖液6 μ 1，在從裝有PCR產(chǎn)物的腔板中，每孔用 排槍移出PCR產(chǎn)物(2μ 1)，轉(zhuǎn)移到點樣板上、混勻、離心(腔板孔號要與96孔點樣板一一對 應(yīng))。2、流程1)配膠(0. 8%瓊脂糖)稱取2. 4g瓊脂糖，懸浮于300ml 0. 5 X TBE中(500ml錐
形瓶)。2)溶膠微波爐中高火加熱至沸，持續(xù)沸騰數(shù)分鐘，注意不要沸出，其間取出混 勻。3)涼膠待膠完全溶解，從微波爐中取出，涼至60°C，加入10 μ 1 (10mg/ml)溴化乙 錠(EB)，搖勻。4)鋪膠平板兩端用膠布封嚴(yán)，把250ml膠液全部倒入平板，插入梳尺。5)上膠將平板放入已盛有電泳液(0. 5 X TBE,液面距膠面1至2mm)的電泳槽中， 拔下梳尺。
6)加樣用排槍按規(guī)定格式加樣，最后用單槍加入DNA標(biāo)準(zhǔn)品。7)走膠蓋上電泳槽蓋，檢查正負級，開啟電泳儀，調(diào)節(jié)電泳電壓。
8)定量當(dāng)溴酚藍走離加樣孔1. 5至2cm處，關(guān)閉電泳儀，小心取膠，放入攝相儀 照相，進行定量。定量marker為DL 2000，經(jīng)過電泳后，有6條帶可見，片段長度分別是2000bp、 IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp，DL2000 的總濃度是 300ng/5 μ 1。電泳時取 5μ 1 DL2000，因此每條帶的含量為50ng。PCR產(chǎn)物電泳時取3 μ 1 (PCR產(chǎn)物)+5 μ 1 (上樣緩沖 液)進行電泳。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳后的灰度值與DL2000的灰度值的比較判斷PCR產(chǎn)物的含量。實施例3純化的SLC26A4基因編碼區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的直接測序一、PCR產(chǎn)物DNA模板的純度與用量要求DNA 純度0D26。/0D28。= 1. 6 2. 0。DNA 濃度PCR 產(chǎn)物 IOng/ μ 1。PCR產(chǎn)物DNA用量100 200bp1 3ng200 500bp 3 IOng500 IOOObp 5 20ng1000 2000bp 10 40ng> 2000bp40 IOOng二、測序反應(yīng)1、測序反應(yīng)所需試劑應(yīng)為新鮮配制，需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使 用。測序反應(yīng)所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應(yīng)為潔凈無菌的。2、為了保證測序樣本及反應(yīng)試劑的新鮮，加樣時應(yīng)在冰上操作。3、目前的反應(yīng)體系為5 μ 1，各種試劑加入量如表2所示。表2SLC26A4基因PCR擴增產(chǎn)物的測序反應(yīng)體系 *BigDye 3. 1為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的一種用于測序反應(yīng)的熒光染 料。4、樣品放于PCR儀上，所作反應(yīng)的過程見表3。
表3SLC26A4基因PCR擴增產(chǎn)物的測序反應(yīng)過程 5、反應(yīng)完的樣品要及時從PCR儀上取下，短時間內(nèi)要進行純化的樣品放置于4°C 冰箱中，超過一天以上才能純化的樣品放置于-20°C冰箱冷凍。三、測序反應(yīng)物的純化和測序1、向每孔中加入20 μ 1 80%乙醇，以4000rpm的速率離心30min ；將樣品板放在折 好的紙巾上，在離心機中倒甩，倒甩時速率不能超過IOOOrpm ；2、在每孔中加入30 μ 1 70%乙醇，以4000rpm的速率離心IOmindgjM ；3、重復(fù)第2步的操作；4、重復(fù)第2步的操作；5、將樣品板放于干凈的抽屜中，避光干燥30min ；6、加入5μ 1甲酰胺，封膜，離心后置于_20°C冰箱中；7、上ABI PRISM 3730DNA序列分析儀前95°C變性5分鐘，放置冰上2分鐘，離心后 上樣。將所得到的測序圖譜進行分析，與ID:NT_007933的標(biāo)準(zhǔn)序列比較以確定突變位點是
否存在。上述實施例1 3中的試驗材料均為市售購買產(chǎn)品。以上對本發(fā)明的詳細描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出 各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
權(quán)利要求
一種檢測SLC26A4基因c.232T＞C突變的試劑盒，包括——針對SLC26A4基因或SLC26A4基因編碼區(qū)第232位堿基附近設(shè)計的PCR引物；——PCR反應(yīng)試劑；——檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測SLC26A4基因c.232T > C突變的試劑盒，其特征在于所 述PCR引物為15 30個堿基，GC含量為45 50%。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測SLC26A4基因c.232T > C突變的試劑盒，其特征在于所 述PCR引物中上游引物為 SLC26A4-3F :5’ -GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，；下游引物為 SLC26A4-3R :5’ -AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測SLC26A4基因c.232T > C突變的試劑盒，其特征在于 所述 PCR 反應(yīng)試劑為 2. 5iil、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 緩沖液，2. 0 iU、2. 5mM 的 dNTP， 0. 3u l,5U/u 1的耐熱聚合酶，0. 25 u 1熒光染料。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測SLC26A4基因c.232T > C突變的試劑盒，其特征在于所 述檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑為測序檢測試劑、限制性內(nèi)切酶酶切檢測試劑、限制性長度多 態(tài)性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑或雜交探針檢測試劑中的任意一種。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測SLC26A4基因c.232T > C突變的試劑盒在檢測前庭導(dǎo)水 管擴大相關(guān)的位于SLC26A4基因的232位突變中的應(yīng)用，包括以下步驟(1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取基因組DNA；(2)以所述DNA為模板，采用所述PCR引物進行PCR反應(yīng)，得到PCR擴增產(chǎn)物SLC26A4-3F :5’ -GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，SLC26A4-3R :5’ -AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3’ ；(3)將所述PCR擴增產(chǎn)物純化后進行直接測序，并將測序結(jié)果與SLC26A4基因標(biāo)準(zhǔn)序列 進行比較，確定是否存在SLC26A4基因的c. 232T > C突變位點；(4)判斷待測個體是否為SLC26A4基因突變c.232T > C導(dǎo)致的前庭導(dǎo)水管擴大。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測SLC26A4基因c.232T > C突變的試劑盒在檢測前庭導(dǎo)水 管擴大相關(guān)的位于SLC26A4基因的232位突變中的應(yīng)用，其特征在于該應(yīng)用還包括按照正 常閱讀框架進行翻譯以確定c. 232T > C突變，使得位于Pendrin氨基端的第78位極性中 性酪氨酸變?yōu)閴A性組氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測SLC26A4基因c.232T＞C突變的試劑盒，該試劑盒包括針對SLC26A4基因或SLC26A4基因編碼區(qū)第232位堿基附近設(shè)計的PCR引物、PCR反應(yīng)試劑和檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑。本發(fā)明具有快速、靈敏度高、特異性強的特點，有效地判斷來自于患者的待測樣本中是否存在SLC26A4基因c.232T＞C突變，從而為判斷該患者前庭導(dǎo)水管擴大發(fā)生原因提供依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK101838698SQ201010180608
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者王艷莉, 郭玉芬 申請人:蘭州大學(xué)