專利名稱：維持干細(xì)胞自我更新的6個豬源關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了體外轉(zhuǎn)錄載體及能夠誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn) 變成豬多能干細(xì)胞的6個關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，用于誘導(dǎo)豬的成纖維細(xì)胞成豬多能干 細(xì)胞，為建立人類疾病模型提供了基本條件，該發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬是最適合人類器官移植和建立人類疾病模型的動物，但豬的疾病模型大多數(shù)用 基因敲除技術(shù)得到基因敲除的體細(xì)胞然后利用核移植的技術(shù)產(chǎn)生可繼續(xù)發(fā)育的卵母細(xì)胞， 從而得到基因敲除豬。但在這個過程中存在基因敲除效率低，孕期流產(chǎn)率高，初生仔豬有缺 陷等問題；此外，豬的干細(xì)胞分離至今沒有成功，所以根據(jù)Yamanaka研究小組的實驗方法， 在成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)入幾個干細(xì)胞的關(guān)鍵基因就能將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成多能干細(xì)胞。目前， 利用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑對成纖維細(xì)胞的多基因轉(zhuǎn)染效率非常低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)入的基因量不同， 但用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶基因用其感染成纖維細(xì)胞的方法得到的基因敲除豬又存在生物安全 性的問題。因此，我們試圖在體外大量轉(zhuǎn)錄維持干細(xì)胞自我更新的豬的6個關(guān)鍵基因，然后 將其mRNA轉(zhuǎn)入豬胚胎成纖維細(xì)胞后使其變成豬的多能干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是構(gòu)建基因體外轉(zhuǎn)錄載體，該載體可以對某個基因進(jìn)行大量的 體外轉(zhuǎn)錄，得到可高效翻譯的mRNA。本發(fā)明的另一個目的是構(gòu)建了攜帶維持干細(xì)胞自我更新的豬的6個關(guān)鍵基因和 對照基因EGFP的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，這6個基因體外轉(zhuǎn)錄出的mRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞 后能夠使其轉(zhuǎn)變成豬的多能干細(xì)胞；并用細(xì)胞水平通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染鑒定了體外轉(zhuǎn)錄mRNA的 功能。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的維持干細(xì)胞自我更新的6個豬源關(guān)鍵基因的體 外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于具體制備方法如下首先設(shè)計基因體外轉(zhuǎn)錄空載體Vitr0-TranSPMD-18T，然后獲得EGFP和維持 干細(xì)胞自我更新的豬源的6個關(guān)鍵基因的cDNA，再按相應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切連接， 并用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對7個體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的mRNA，然后將 Vitro-Trans-EGFP轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞，檢測其功能；1、基因體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建用重疊延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7啟動子，增強(qiáng)翻譯效率的 minusCT，包含ATG起始密碼子的5’ UTR和一段包含酶切位點(diǎn)的無關(guān)序列。然后連接進(jìn)入 PMD-18T simple載體，用于以后表達(dá)基因的插入。根據(jù)目的序列設(shè)計2對引物，PI, P2 ；P3, P4。用引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得 到60bp的序列，電泳，切膠回收，然后以60bp的產(chǎn)物為模板用引物P3和P4進(jìn)行PCR，得到104bp的反轉(zhuǎn)錄模板序列。表1引物序列
權(quán)利要求
維持干細(xì)胞自我更新的6個豬源關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于具體制備方法如下首先設(shè)計基因體外轉(zhuǎn)錄空載體Vitro TransPMD 18T，然后獲得EGFP和維持干細(xì)胞自我更新的豬源的6個關(guān)鍵基因的cDNA，并按相應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切連接，最后用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對7個體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的mRNA，然后將Vitro Trans EGFP轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞(1)、基因體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建用重疊延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7啟動子，增強(qiáng)翻譯效率的minusCT，包含ATG起始密碼子的5’UTR和一段包含酶切位點(diǎn)的無關(guān)序列；然后連接進(jìn)入PMD 18T simple載體，用于以后表達(dá)基因的插入；根據(jù)目的序列設(shè)計2對引物，P15′ tatagggagaagagggagagtagagccgccaccat 3′，P25′ attctccgcggacatatgtgggcccatggtggcgg3′；P35′ Ctcgaggactaatacgactcactataggga 3′，P45′ aagcttgctagctctcgagagaattctccg 3′；用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到60bp的序列，電泳，切膠回收，然后以60bp的產(chǎn)物為模板用引物P3和P4進(jìn)行PCR，得到104bp的反轉(zhuǎn)錄模板序列；Ctcgaggactaatacgactcactatagggagaagagggagagtagagccgccaccatgggcccacatatgtccgcggagaattctctcgagagctagcaagctt；(2)、維持干細(xì)胞自我更新的豬源關(guān)鍵基因的cDNA的獲得利用NCBI中公布的EGFP的序列和杜洛克豬的相應(yīng)基因mRNA序列，設(shè)計引物，包括Oct4(NM_001113060.1)，Sox2(NM_001123197.1)，c Myc(NM_001005154.1)，Klf4(NM_001031782.1)，Nanog(NM_001129971.1)和Lin28(NM_001123133.1)；引物兩端帶有連接體外轉(zhuǎn)錄載體的內(nèi)切酶位點(diǎn)(NcoI，EcoRI和NheI)，采用RT PCR的方法得到這6個基因的cDNA序列；(3)、基因體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的獲得將上述的體外轉(zhuǎn)錄空載體與Oct4，Sox2，c Myc，Klf4，Nanog和Lin28的7個基因的cDNA連接，得到基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(VitroTrans EGFP/Oct4/Sox2/c Myc/Klf4/Nanog/Lin28)；(4)、基因的體外轉(zhuǎn)錄利用Applied Biosystems公司的mMESSGE mMACHINE T7Ultra Kit對線性化的基因體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；(5)、基因體外轉(zhuǎn)錄出的mRNA功能的驗證用作為對照的體外轉(zhuǎn)錄出的EGFP的mRNA對豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12小時后觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維持干細(xì)胞自我更新的6個豬源關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的 構(gòu)建，其特征在于所述的基因體外轉(zhuǎn)錄載體的序列及含相同元件相同功能的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種維持干細(xì)胞自我更新的6個豬源關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒構(gòu)建，其特征在于具體制備方法如下首先設(shè)計基因體外轉(zhuǎn)錄空載體Vitro-TransPMD-18T，然后獲得EGFP和維持干細(xì)胞自我更新的豬源的6個關(guān)鍵基因的cDNA，并按相應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切連接，最后用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對7個體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的mRNA，然后將Vitro-Trans-EGFP轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞其6個基因體外轉(zhuǎn)錄出的mRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞后能夠使其轉(zhuǎn)變成豬的多能干細(xì)胞；6個基因體外轉(zhuǎn)錄出的mRNA能夠高效翻譯。
文檔編號C12N5/10GK101984062SQ20101018240
公開日2011年3月9日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者周楊, 唐小春, 張明軍, 朱建國, 歐陽紅生, 段新平, 賴良學(xué), 逄大欣, 陳月 申請人:吉林大學(xué)