專利名稱：一種新的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新的β-1，6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物被膜(biofilm)是由細(xì)菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。一旦形成生物被膜，細(xì)菌將具有極強(qiáng)的抗生素耐藥性(比浮游細(xì)菌高 100-1000倍)和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的能力。牙菌斑生物被膜是牙周病的始動(dòng)因素，在牙菌斑生物被膜的刺激下，牙周組織細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在牙槽骨吸收及牙周軟組織破壞的過程中發(fā)揮著重要作用。然而，目前絕大多數(shù)研究集中在浮游細(xì)菌對牙周組織細(xì)胞毒性的研究，而關(guān)于細(xì)菌生物被膜與牙周病的研究極少。伴放線放線桿菌是侵襲性牙周炎的主要致病菌，它產(chǎn)生的β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物被膜的主要成份，在生物被膜形成和致病性方面發(fā)揮著重要作用。但目前尚未有能降解β_1，6-Ν-乙酰葡聚糖胺的β-1， 6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的發(fā)明人從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了一種β_1， 6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl，能降解β-1，6-Ν-乙酰葡聚糖胺，并具有抗伴放線放線桿菌生物被膜的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述酶在抗伴放線放線桿菌生物被膜中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，從海洋微生物中純化得到一種新的產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。根據(jù)本發(fā)明的另一技術(shù)方案，使用上述酶對伴放線放線桿菌生物被膜形成進(jìn)行了抑制，對已形成生物被膜進(jìn)行了清除。本發(fā)明的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl對伴放線放線桿菌生物被膜形成的抑制作用> 50%，對已形成生物被膜的清除率為74.5%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌株的分離和發(fā)酵條件從黃海采集海泥，樣品置于無菌塑料瓶，4°C保存，4h以內(nèi)用如下方法處理lmL海泥，加4mL無菌海水，取其懸浮液稀釋接入選擇性培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。一周后劃線于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)過連續(xù)5代挑取單克隆純化培養(yǎng)后，挑取單克隆接種到含3毫升液體培養(yǎng)基的試管中，25°C 200r/min培養(yǎng)12小時(shí)。將培養(yǎng)液按的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于25°C 150r/ min培養(yǎng)3d。4°C 12000對min離心IOmin去除菌體，測定上清液的酶活力，選取酶活力最高的菌株。其中菌株QY403產(chǎn)生的酶活力最高，為4.65U/mL。培養(yǎng)基配方為每升含β_1， 6-Ν-乙酰葡聚糖胺 3g、KH2P043g、K2HP04*3H20 7g、(NH4)2SO4 2g、NaCl 30g、MgS04 ·7Η20 llg、FeSO4 ·7Η20 llg，pH 6. 0，IOOkP滅菌15min。固體培養(yǎng)基中添加1. 5%瓊脂。酶活力測定方法200μ1底物(1.71g/L 4-硝基苯基-N-乙酰葡聚糖胺)中，加入5 μ 1的酶，40°C保溫5 分鐘，再加入5 μ 1 IOM的NaOH中止反應(yīng)，以O(shè)min處底物溶液為空白。迅速測定反應(yīng)體系在405nm的光吸收值(0D405)。酶活力單位(U)定義為在以上條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μ mol 的產(chǎn)物的酶量，定義為1個(gè)U。 實(shí)施例2N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl的分離純化⑴細(xì)菌培養(yǎng)挑QY403單克隆入5ml培養(yǎng)基，25°C 150r/min過夜。轉(zhuǎn)接裝有IOOmL培養(yǎng)基的 500mL搖瓶(1%接種量)，25°C 150r/min振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。4°C離心lOOOOrpm，15分鐘，收集細(xì)菌發(fā)酵液上清液。(2)硫酸銨沉淀粗分離發(fā)酵液上清中緩慢加入硫酸銨至80%飽和度，4°C靜置3h ;40°C 12000g離心 30min,棄去上清液，沉淀溶于20mmol/LpH7. 5磷酸鹽緩沖液，對同樣的緩沖液4°C透析過夜；40°C 13000g離心30min取上清液，即為粗酶液。(3)離子交換層析粗酶液上樣于以20mmol/L pH7. 5磷酸鹽緩沖液平衡的DEAES印harose Fast Flow 柱進(jìn)行離子交換層析。層析所用緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液，A液為20mmol/L pH7. 5磷酸鹽緩沖液，B液為含有2.0mol/L NaCl的A液。層析柱體積為14ml (IcmX 20cm)，上樣量為3ml，采取NaCl濃度梯度洗脫，流速1. Oml/min，檢測收集物的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 NagYl活性，大量收集活性組分。(4)凝膠過濾層析離子交換收集到的活性組分進(jìn)行凝膠過濾層析，Superdex75HR10/30柱用 20mmol/L pH7. 5磷酸鹽緩沖液平衡，上樣量1. 0ml,以平衡液洗脫，流速0. 5ml/min，檢測收集物活性，大量收集高活性組分，濃縮備用。以上層析純化操作均在4°C進(jìn)行。經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析以及凝膠過濾層析收集的酶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果表明純化后的樣品只有一條帶，達(dá)到電泳純水平。根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算， N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl分子量大約為40. 2kD。其比活力為2. 37X 104U/mg。實(shí)施例3N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl抗伴放線放線桿菌生物被膜作用(1)96孔板伴放線放線桿菌生物被膜的構(gòu)建從TSA培養(yǎng)平板挑伴放線放線桿菌單菌落到5mL TSB(50ml離心管)，培養(yǎng)過 (12h)，調(diào)整細(xì)菌OD值至1. 0，稀釋至不同倍數(shù)；96孔板每孔加入100 μ L稀釋菌液，37°C， 5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時(shí)；吸出菌液，用水洗96孔板3次；加入150 yL,l% 結(jié)晶紫染色30min ；用水徹底清洗至溶液無色；每孔中加入200 μ L 30%醋酸溶液，用酶標(biāo)儀(590nm波長)比色。(2)蓋玻片上伴放線放線桿菌生物被膜模型的構(gòu)建從TSA培養(yǎng)平板挑伴放線放線桿菌單菌落到5mL TSB (50ml離心管)，培養(yǎng)過夜 (12h)；調(diào)整細(xì)菌0D600值至1.0，稀釋10倍；六孔板每孔中加入稀釋后的菌液2ml，將滅菌蓋玻片(24X24mm)輕輕平放入孔底部；37°C，5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時(shí)；小心取出蓋玻片，用滅菌水清洗3次；將蓋玻片放入含2mlTSB的六孔板中，37°C超聲振蕩10分鐘；將超聲振蕩后的含菌TSB稀釋，取200 μ L涂TSA平板，37°C,5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12小時(shí)后計(jì)數(shù)。長有生物被膜的蓋玻片用PBS沖洗三次，蓋玻片上滴核酸染料 SYT09(0.01Mm)20y 1，避光靜置15分鐘后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察生物被膜形態(tài)(激發(fā)激光488nm，觀察濾色片505nm，20X物鏡觀察，針孔522 μ m，Z軸步進(jìn)2 μ m，四次掃描增加信躁比)。(3)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl對伴放線放線桿菌已形成生物被膜的降解作用按照以上構(gòu)建生物被膜的方法在9 6孔板中造膜，即將OD為1的A. a菌液稀釋10 倍，96孔板每孔加入100 μ L稀釋菌液，37°C,5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時(shí)。吸出細(xì)菌培養(yǎng)液，用滅菌水小心沖洗96孔板三次，吸出滅菌水后每孔加入TSB培養(yǎng)基100 μ L，然后每孔中分別加入含有終濃度為0. 9U/ml、9U/ml、90U/ml、180U/ml以及經(jīng)加熱滅活處理的 90U/ml N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(酶溶于50mM PBS，pH7. 4)NagYl 5μ L的。對照組中僅加入TSB 105 μ L ；37°C，5% 二氧化碳，靜置培養(yǎng)4小時(shí)后，吸去上清液，加入ddH20清洗三次。 吸凈沖洗液，室溫下晾干；加入150μ L 結(jié)晶紫染色30min ；用ddH20清洗殘余的結(jié)晶紫； 加入200yL 30%乙酸洗脫結(jié)晶紫；洗脫液590nm檢測OD值，用結(jié)晶紫的量表示剩余的生物被膜的量。結(jié)果表明N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl對伴放線放線桿菌生物被膜有明顯的降解作用，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的濃度增加，對生物被膜的降解作用亦逐漸增強(qiáng)。90U/ml 的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl作用4小時(shí)能夠降解生物被膜達(dá)74. 5%。(4) N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl對伴放線放線桿菌生物被膜形成的影響(蓋玻片)將蓋玻片放入6孔板中，每孔中加入PBS 2mL，然后加入含N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl 90U/ml的PBS 100 μ L，4°C，靜置24小時(shí)后，用PBS沖洗一遍，盡量吸干孔中的液體。按照前述在蓋玻片上構(gòu)建生物被膜的方法造膜，每孔中加入伴放線放線桿菌菌液2ml。 24小時(shí)后，取出蓋玻片，PBS沖洗三次，蓋玻片上滴核酸染料SYT09 (0. OlmM) 20 μ L靜置15 分鐘后，于倒置相差顯微鏡下觀察生物被膜形態(tài)。結(jié)果顯示，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl對伴放線放線桿菌生物被膜生長的最終抑制效果達(dá)到50%左右。
權(quán)利要求
1.一種新的β_1，6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl。
2.如權(quán)利要求1所述的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl，在抗伴放線放線桿菌生物被膜方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及一種從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1，可以用于抗伴放線放線桿菌生物被膜。
文檔編號(hào)C12N9/24GK102260658SQ20101018267
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者于文功, 劉忠, 張貴民, 譚玉龍, 趙志全, 韓峰 申請人:中國海洋大學(xué), 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司