專(zhuān)利名稱(chēng)：檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸是一種廣泛應(yīng)用于飲料、食品以及醫(yī)藥等行業(yè)的有機(jī)酸，檸檬酸的制備一般包括將原料進(jìn)行預(yù)處理并發(fā)酵得到發(fā)酵清液，并進(jìn)一步從發(fā)酵清液中提純檸檬酸，并進(jìn)行后處理?，F(xiàn)有技術(shù)的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液中，碳源多以淀粉質(zhì)原料(如玉米粉)為主，適量添加有機(jī)的氮源，少量或不加無(wú)機(jī)鹽成分，這種發(fā)酵液的發(fā)酵效率較低且成分復(fù)雜，發(fā)酵液中的雜質(zhì)對(duì)后續(xù)檸檬酸的提取存在很大的影響。另一方面，淀粉質(zhì)原料隨著產(chǎn)地、品種等不同而存在一定的差異，導(dǎo)致各批次制備的培養(yǎng)基的差異較大，從而導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵效率的不穩(wěn)定。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種新型的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的檸檬酸發(fā)酵液存在的發(fā)酵效率低、雜質(zhì)含量高、并且易受淀粉質(zhì)原料產(chǎn)地、品質(zhì)等因素影響而導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵效率不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，提供一種發(fā)酵效率高、雜質(zhì)含量低且發(fā)酵效率穩(wěn)定的新型的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法。本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為75-95重量％，所述氮源的含量為0. 01-0. 5重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為 0. 01-0. 5重量％，硫酸鎂的含量為0. 001-0. 5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵方法，其中，該方法包括將黑曲霉接種至發(fā)酵液中，之后發(fā)酵以產(chǎn)生檸檬酸，其中，所述發(fā)酵液為本發(fā)明提供的發(fā)酵液。本發(fā)明提供的發(fā)酵液由于無(wú)需使用淀粉質(zhì)原料作為碳源，這種發(fā)酵液的發(fā)酵效率高且成分簡(jiǎn)單，發(fā)酵液中的雜質(zhì)少而有利于后續(xù)檸檬酸的提取。另一方面，克服了淀粉質(zhì)原料的產(chǎn)地、品種等影響，從而提高了后續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為75-95重量％，所述氮源的含量為0. 01-0. 5 重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 01-0. 5重量％，硫酸鎂的含量為0. 001-0. 5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。優(yōu)選情況下，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為 80-90重量％，所述氮源的含量為0. 05-0. 15重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 05-0. 15 重量％，硫酸鎂的含量為0. 005-0. 1重量％，水的含量為9. 6-19重量％，在此優(yōu)選范圍內(nèi)能夠更進(jìn)一步地提高發(fā)酵的效率。根據(jù) 本發(fā)明，所述淀粉質(zhì)原料液化清液是指淀粉質(zhì)原料經(jīng)過(guò)酶解之后故也分離后得到的液化清液，所述淀粉質(zhì)原料液化清液可以通過(guò)多種方法制備得到，例如，可以通過(guò)如下方法制備得到的將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)?，所述固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)墓毯繛?-50重量％，更優(yōu)選為20-40重量％。所述淀粉質(zhì)原料的種類(lèi)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如可以玉米、木薯、高粱等， 優(yōu)選為玉米。所述粉碎的條件沒(méi)有特別的限制，只要能夠使淀粉質(zhì)原料充分破碎即可，優(yōu)選情況下，所述粉碎的條件使淀粉質(zhì)原料的粒度為20-50目。所述酶解步驟可以通過(guò)本領(lǐng)域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長(zhǎng)溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計(jì)，所述淀粉酶的用量為10-60酶活力單位， 更優(yōu)選以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計(jì)，所述淀粉酶的用量為15-50酶活力單位。本發(fā)明所述酶的酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫克淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。所述酶解的溫度可以為淀粉酶的任何最適作用溫度，一般為70_98°C，更優(yōu)選 80-90°C。所述酶解的時(shí)間理論上越長(zhǎng)越好，考慮到設(shè)備利用率，優(yōu)選所述酶解的時(shí)間為 60-180分鐘，更優(yōu)選為100-130分鐘。所述酶解的pH值可以為淀粉酶的任何最適作用pH， 一般為5. 0-6. 5，更優(yōu)選pH值為5. 6-6. 2。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。本發(fā)明所述酶包括淀粉酶。α-淀粉酶又稱(chēng)淀粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開(kāi)淀粉鏈內(nèi)部的 α-1,4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。β -淀粉酶又稱(chēng)淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開(kāi)1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉產(chǎn)生。糖化酶又稱(chēng)淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非還原性末端，以葡萄糖為單位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖。糖化酶作用于支鏈淀粉后的產(chǎn)物有葡萄糖和帶有α-1，6_糖苷鍵的寡糖；作用于直鏈淀粉后的產(chǎn)物幾乎全部是葡萄糖。此酶產(chǎn)生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、 擬內(nèi)孢霉、紅曲霉。
異淀粉酶又稱(chēng)淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝鏈淀粉分子分枝點(diǎn)處的α-1，6-糖苷鍵，將枝鏈淀粉的整個(gè)側(cè)鏈切下變成直鏈淀粉。此酶產(chǎn)生菌主要是嫌氣桿菌、芽孢桿菌及某些假單孢桿菌等細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明，所述固液分離的方法與裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，壓濾機(jī)或離心機(jī)。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵方法，其中，該方法包括將黑曲霉接種至發(fā)酵液中，之后發(fā)酵以產(chǎn)生檸檬酸，其中，所述發(fā)酵液為本發(fā)明提供的發(fā)酵液。本發(fā)明中，能夠發(fā)酵單糖如葡萄糖和/或果糖、寡糖如蔗糖和/或半乳糖的微生物都可以用于本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程，優(yōu)選使用黑曲霉作為發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的微生物。以每克淀粉質(zhì)原料液化清液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為IO4-L 5 X IO5個(gè) 菌落形成單位，更優(yōu)選5 X IO4-IO5個(gè)菌落形成單位。所述菌落形成單位的定義為將稀釋后的一定量的菌液通過(guò)澆注或涂布的方法，讓其內(nèi)的微生物單細(xì)胞一一分散在培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)后，每一活細(xì)胞就形成一個(gè)菌落。即每毫升菌液中含有的單細(xì)胞的數(shù)目。所述菌落形成單位可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法測(cè)定， 例如，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。本發(fā)明發(fā)酵所使用的黑曲霉可以為商購(gòu)的黑曲霉固體制劑或黑曲霉菌種，例如， 黑曲霉Co827 (上海新立工業(yè)微生物科技有限公司)、黑曲霉TOl (天津工業(yè)微生物所)和黑曲霉菌株(中科院微生物所)。所述黑曲霉可以采用常規(guī)的方法接種，例如，在被接種至發(fā)酵液中之前，將所述黑曲霉經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)處理，之后將得到的種子液加入到發(fā)酵液中。優(yōu)選情況下，所述種子培養(yǎng)處理的方法包括將黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的條件使黑曲霉菌體的呼吸商為0. 7-1. 5，并在該呼吸商下保持2-8小時(shí)。術(shù)語(yǔ)“呼吸商”是指二氧化碳釋放速率除以氧消耗速率所得到的叫做呼吸商(在單位時(shí)間、單位發(fā)酵液體積內(nèi)細(xì)胞釋放的二氧化碳量，叫做二氧化碳釋放速率；以單位時(shí)間、單位發(fā)酵液體積內(nèi)細(xì)胞消耗的氧量表示的氧利用速率)所述呼吸商的檢測(cè)方法可以為各種能夠檢測(cè)微生物呼吸商的方法，例如，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。一方面，所述培養(yǎng)的條件使黑曲霉的呼吸商優(yōu)選為0.85-1.0，在此范圍內(nèi)的呼吸商能夠使培養(yǎng)的黑曲霉更適合于后續(xù)的發(fā)酵，使其發(fā)酵效率更為理想。另一方面，所述保持的時(shí)間優(yōu)選為3-5小時(shí)，本發(fā)明人驚奇地在這樣的保持時(shí)間范圍內(nèi)，能夠進(jìn)一步地提高黑曲霉在后續(xù)發(fā)酵中的效率，從而使其處于更適于發(fā)酵的狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法沒(méi)有特別的限制，只要得到的培養(yǎng)液能夠適用于黑曲霉的培養(yǎng)即可，例如，所述黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法可以包括在淀粉漿液中加入淀粉酶，以5-8°C /每分鐘的速度升溫至90-100°C并在該溫度下酶解淀粉0. 5-1小時(shí)，之后進(jìn)行閃蒸，待溫度降至80-95°C時(shí)在該溫度下保持90-120分鐘，之后加入氮源并滅菌。根據(jù)本發(fā)明，所述淀粉漿液中，淀粉和水的含量以及漿液的pH可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，所述淀粉的含量為20-40重量％，水的含量為60-80重量％，所述淀粉漿液的PH值為5-7。
本發(fā)明中，所述淀粉酶的加入量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，相對(duì)于1000 重量份的淀粉漿液，所述淀粉酶的加入量可以為0. 2-0. 5重量份。根據(jù)本發(fā)明，所述氮源的種類(lèi)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，所述氮源可以為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種，所述氮源的加入量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，以所述黑曲霉培養(yǎng)液的總重量為基準(zhǔn)，所述氮源的加入量為0. 05-0. 5重量％。根據(jù)本發(fā)明，所述閃蒸是指通過(guò)在真空條件下在閃蒸罐內(nèi)將物料溫度迅速下降到指定溫度。本發(fā)明中，所述黑曲霉的接種量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，所述黑曲霉的接種量可以為IO4-L 5X105。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)的條件可以在很大范圍內(nèi)改變，例如所述培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度可以為25-45°C，pH值可以為1-7，通氣量可以為0. 05-0. 5體積體積 分鐘，培養(yǎng)的時(shí)間可以為45-65小時(shí)；更優(yōu)選的情況下，所述培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度可以為30-40°C，pH值可以為2-4，通氣量可以為0. 1-0. 3體積體積 分鐘，所述培養(yǎng)的時(shí)間可以為50-60小時(shí)。術(shù)語(yǔ)“通氣量”一般以通氣比來(lái)表示，通常以每分鐘內(nèi)通過(guò)單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來(lái)表示(V/V · min)，例如通氣比為1 0. 05-0. 5，簡(jiǎn)稱(chēng)通氣量為0. 05-0. 5體積體積·分鐘。 所述培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明中，所述發(fā)酵的條件沒(méi)有特別的限制，例如，所述發(fā)酵的條件可以包括溫度為30-40°C，更優(yōu)選為30-35°C ；pH值為1_7，優(yōu)選為2_4，通氣量為0. 1-1體積體積·分鐘；更優(yōu)選為0. 2-0. 8體積體積·分鐘；時(shí)間為40-70小時(shí)，更優(yōu)選50-60小時(shí)。發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求分離并精制，比如蒸餾、濃縮、除水。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液。(1)原料的去皮及粉碎將收獲的100重量份玉米通過(guò)粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 8的比例調(diào)漿，按40單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α "淀粉酶)?？焖偕郎刂?2°C，維持 120分鐘后(pH = 5. 5)利用壓濾機(jī)過(guò)濾得到液化清液和酶解殘?jiān)?固含量為10重量％ )。(3)將90重量份的上述液化清液、0. 1重量份的硝酸銨、0. 05重量份的磷酸二氫鉀、0. 005重量份的硫酸鎂和10重量份的水混合，得到發(fā)酵液Al。對(duì)比例1根據(jù)與實(shí)施例1相同的方法制備參比發(fā)酵液CA1，不同在于使用酶解后固液分離得到的殘?jiān)鳛榈础?shí)施例2(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過(guò)粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為25目)(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 8的比例調(diào)漿，按30單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?5°C，維持 140分鐘后(pH = 6. 0)利用壓濾機(jī)過(guò)濾得到液化清液和酶解殘?jiān)?固含量為40重量％ )。(3)將76重量份的上述液化清液、0. 4重量份的硝酸銨、0. 3重量份的磷酸二氫鉀、 0. 3重量份的硫酸鎂和23重量份的水混合，得到發(fā)酵液A2。實(shí)施例3(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過(guò)粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 8的比例調(diào)漿，按45單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)。快速升溫至85°C，維持 160分鐘后(pH = 6. 5)利用壓濾機(jī)過(guò)濾得到液化清液和酶解殘?jiān)?固含量為50重量％ )。(3)將85重量份的上述液化清液、0. 2重量份的硝酸銨、0. 2重量份的磷酸二氫鉀、 0. 1重量份的硫酸鎂和14. 5重量份的水混合，得到發(fā)酵液A3。實(shí)施例4(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過(guò)粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 6的比例調(diào)漿，按30單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?0°C，維持 170分鐘后(pH = 5. 0)利用壓濾機(jī)過(guò)濾得到液化清液和酶解殘?jiān)?固含量為30重量％ )。(3)將90重量份的上述液化清液、0. 15重量份的硝酸銨、0. 1重量份的磷酸二氫鉀、0. 05重量份的硫酸鎂和9. 7重量份的水混合，得到發(fā)酵液A4。實(shí)施例5(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過(guò)粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 6的比例調(diào)漿，按30單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?5°C，維持 140分鐘后(pH = 5. 5)利用壓濾機(jī)過(guò)濾得到液化清液和酶解殘?jiān)?固含量為40重量％ )(3)將84. 8重量份的上述液化清液、0. 05重量份的硝酸銨、0. 05重量份的磷酸二氫鉀、0. 1重量份的硫酸鎂和15重量份的水混合，得到發(fā)酵液A5。實(shí)施例6本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的發(fā)酵方法。(1)將實(shí)施例1步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10% (術(shù)語(yǔ)總糖是指酶解液化液中所含糖的總含量)投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種 (黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液IO5個(gè)菌落形成單位)，在37°C、0. 4體積體積 分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過(guò)取樣顯微鏡鏡檢、酸度測(cè)定和 PH測(cè)定對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2.0、酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，
停止培養(yǎng)。(2)使用實(shí)施例1得到發(fā)酵液Al，并將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液5 X IO4個(gè)菌落形成單位， 在37°C、120轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌、1 0.4通氣的條件下培養(yǎng)60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

對(duì)比例2根據(jù)與實(shí)施例6相同的方法進(jìn)行發(fā)酵，不同在于使用對(duì)比例1中得到的參比酶解產(chǎn)物CAl配制發(fā)酵液。實(shí)施例7(1)將實(shí)施例2步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液IO5個(gè)菌落形成單位)，在37°C、0. 4體積體積 分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過(guò)取樣顯微鏡鏡檢、酸度測(cè)定和PH測(cè)定對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)。(2)使用實(shí)施例2得到發(fā)酵液A2，并將步驟⑴培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1) 中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液IO5個(gè)菌落形成單位，在37°C、0. 4體積體積·分鐘的條件下培養(yǎng)50小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。實(shí)施例8(1)將實(shí)施例3步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液2X IO5個(gè)菌落形成單位)，37°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過(guò)取樣顯微鏡鏡檢、酸度測(cè)定和PH測(cè)定對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、 酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)。(2)使用實(shí)施例3得到發(fā)酵液A3，將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1)中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液1. 5X105個(gè)菌落形成單位，在30°C、0. 8體積體積·分鐘的通氣的條件下培養(yǎng)60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。實(shí)施例9(1)將實(shí)施例4步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液IO5個(gè)菌落形成單位)，在36°C、0. 5體積體積 分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過(guò)取樣顯微鏡鏡檢、酸度測(cè)定和PH測(cè)定對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)。(2)使用實(shí)施例4得到發(fā)酵液A4，將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1)中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液1. OX IO5個(gè)菌落形成單位，在32°c、0. 8體積體積·分鐘的通氣的條件下培養(yǎng)65小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。
實(shí)施例10 (1)將實(shí)施例5步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液2X IO5個(gè)菌落形成單位)，在36°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過(guò)取樣顯微鏡鏡檢、酸度測(cè)定和PH測(cè)定對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在 2. 0、酸度1 %、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)。(2)使用實(shí)施例5得到發(fā)酵液A5，將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1)中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液1. 5X105個(gè)菌落形成單位，在35°C、0. 6體積體積·分鐘的通氣的條件下培養(yǎng)52小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。實(shí)施例11根據(jù)與實(shí)施例10相同的方法進(jìn)行發(fā)酵，不同在于步驟(1)中通過(guò)以下方法控制黑曲霉的培養(yǎng)在培養(yǎng)過(guò)程中將培養(yǎng)尾氣接入質(zhì)譜儀，在線記錄二氧化碳釋放速率和氧消耗速率，并在線計(jì)算呼吸商，在呼吸商在0. 75下維持7小時(shí)。實(shí)施例12根據(jù)與實(shí)施例10相同的方法進(jìn)行發(fā)酵，不同在于步驟(1)中通過(guò)以下方法控制黑曲霉的培養(yǎng)在培養(yǎng)過(guò)程中將培養(yǎng)尾氣接入質(zhì)譜儀，在線記錄二氧化碳釋放速率和氧消耗速率，并在線計(jì)算呼吸商，在呼吸商在1. 2下維持3小時(shí)。實(shí)施例13-19根據(jù)GB 1987-2007標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)實(shí)施例6_12中發(fā)酵后發(fā)酵液的濃度(簡(jiǎn)稱(chēng)酸度)，并計(jì)算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率(％)=發(fā)酵液的濃度(簡(jiǎn)稱(chēng)酸度)X發(fā)酵液的體積/總糖的重量X 100%，結(jié)果如表1所示。對(duì)比例3根據(jù)與實(shí)施例13-19相同的方法檢測(cè)，對(duì)比例2發(fā)酵后的酸度和轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如表 1所示。表 1
編號(hào)I實(shí)施I實(shí)施I實(shí)施I實(shí)施I實(shí)施I實(shí)施I實(shí)施I對(duì)比
例13 例14 例15 例16 例17 例18 例19 例3
濃度14. 5% 14.7% 14.6% 15. 5% 15. 7% 15. 1% 15. 3% 13. 5%~
(酸度)
轉(zhuǎn)化率(% ) 95. 7%95. 9%~~96. 5%~~96. 0%96. 2% 97. 5%~~97. 7%91. 8%~從上表1的數(shù)據(jù)可以看出，與使用淀粉質(zhì)原料作為氮源的實(shí)施例1制得的參比發(fā)酵液CAl相比，使用本發(fā)明提供的發(fā)酵液(A1-A5)的發(fā)酵效率高，并且由于成分簡(jiǎn)單發(fā)酵液中的雜質(zhì)少而有利于后續(xù)檸檬酸的提取。另一方面，克服了淀粉質(zhì)原料的產(chǎn)地、品種等影響，從而提高了后續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。此外，與實(shí)施例13-17檢測(cè)的數(shù)據(jù)相比，實(shí)施例18和19的發(fā)酵效率(酸度和轉(zhuǎn)化率)更好，由此可以看出，根據(jù)呼吸商來(lái)判斷黑曲霉種子的培養(yǎng)狀態(tài)，能夠使黑曲霉的生長(zhǎng)狀態(tài)更加適合后續(xù)的發(fā)酵，并且這種方法受人為因素的影響很小，能夠保持批次之間黑曲霉培養(yǎng)的 穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為 75-95重量％，所述氮源的含量為0. 01-0. 5重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 01-0. 5重量％，硫酸鎂的含量為0. 001-0. 5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵液，其中，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為80-90重量％，所述氮源的含量為0. 05-0. 15重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 05-0. 15重量％，硫酸鎂的含量為0. 005-0. 1重量％，水的含量為9. 6-19. 6重量％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵液，其中，所述淀粉質(zhì)原料液化清液是通過(guò)如下方法制備得到的將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)?，所述固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)墓毯繛?-50重量％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液，其中，所述粉碎使淀粉質(zhì)原料的粒度為20-60目。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液，其中，所述酶解使用的酶包括淀粉酶，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計(jì)，所述淀粉酶的用量為10-60酶活力單位；所述酶解的溫度為70-98°C，所述酶解的時(shí)間為60-180分鐘，所述酶解的pH值為5. 0-6. 5。
6.一種生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵方法，其中，該方法包括將黑曲霉接種至發(fā)酵液中，之后發(fā)酵以產(chǎn)生檸檬酸，其中，所述發(fā)酵液為權(quán)利要求1-6中的任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其中，所述發(fā)酵液中，以每克淀粉質(zhì)原料液化清液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為IO4-L 5X IO5個(gè)菌落形成單位，所述發(fā)酵條件包括溫度為 30-40°C，通氣量為0. 1-1體積體積·分鐘，時(shí)間為40-70小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其中，在被接種至發(fā)酵液中之前，所述黑曲霉經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)處理，該種子培養(yǎng)處理的方法包括將黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的條件使黑曲霉菌體的呼吸商為0. 7-1. 5，并在該呼吸商下保持2-8小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述呼吸商為0.85-1. 0，所述保持的時(shí)間為3-5 小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為75-95重量％，所述氮源的含量為0.01-0.5重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0.01-0.5重量％，硫酸鎂的含量為0.001-0.5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。本發(fā)明提供的發(fā)酵液中由于無(wú)需使用淀粉質(zhì)原料作為氮源，這種發(fā)酵液的發(fā)酵效率高且成分簡(jiǎn)單，發(fā)酵液中的雜質(zhì)少而有利于后續(xù)檸檬酸的提取。另一方面，克服了淀粉質(zhì)原料的產(chǎn)地、品種等影響，從而提高了后續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12P7/48GK102260716SQ201010186009
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者盧宗梅, 周勇, 周永生, 張繼學(xué), 章輝平 申請(qǐng)人:安徽豐原生物化學(xué)股份有限公司