專利名稱：一種超聲波介導的微生物遺傳轉(zhuǎn)化方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物遺傳轉(zhuǎn)化領域，具體涉及一種采用低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化方法將DNA、RNA、多糖、蛋白等生物大分子轉(zhuǎn)化入細胞中。本發(fā)明還涉及一種采用低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化方法在難轉(zhuǎn)化微生物(革蘭氏陽 性細菌)以及微生物遺傳代謝工程中的應用。
背景技術：
嗜熱、厭氧、革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化一直是令科學家頭疼的問題，在國際上成功的報 道一直很少。原因是嗜熱細菌由于適應其特殊的生存環(huán)境，與常溫細菌不同，其細胞膜厚 且通透性低，而且外來核酸必須通過特定的DNA結(jié)合蛋白才能實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運。對于革蘭氏 陽性菌，由于其細胞壁上特殊的多層肽聚糖結(jié)構(gòu)也難以轉(zhuǎn)化，而且當雙鏈DNA結(jié)合到細胞 膜上之后，馬上會被膜上的核酸酶降解，失去完整性。對于嚴格厭氧細菌來說，進行遺傳轉(zhuǎn) 化時整個操作過程必須在厭氧工作站中進行，操作步驟非常繁瑣。因此對于嗜熱厭氧且為 革蘭氏陽性細菌的轉(zhuǎn)化更是難上加難，目前成功的報道僅限于采用基于高壓電擊的電轉(zhuǎn)化 儀和電擊杯，通過高壓電穿孔的方法完成(Tyurin et al. ,2004,Tyurin et al.，2005)，而 且這一方法在國內(nèi)外僅有美國達特茅斯學院Lee Lynd所在的實驗室可以成功，其它實驗室 無法重復。而嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌又被廣泛應用于以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)綠色低碳的 可再生生物燃料。目前我們面臨的最大問題是這些嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌降解纖維素的能 力和糖醇轉(zhuǎn)化率普遍較低，無法進一步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此對這些嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌必 須進行基因工程改造。而進行這一遺傳改造的前提是必須建立一種簡單、快速的遺傳轉(zhuǎn)化 體系。目前報道的在微生物中可以進行遺傳操作的轉(zhuǎn)化體系主要有結(jié)合轉(zhuǎn)移 (Conjugation)和電穿孔轉(zhuǎn)化(Electroporation)。其中結(jié)合轉(zhuǎn)移需要供體菌的參與才能 介導DNA植入受體菌中。而對于嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌，目前還沒有發(fā)現(xiàn)合適的供體菌。 因此，目前對嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化完全依賴電轉(zhuǎn)(Klapatch et al. ,1996,Mai et al. ,1997, Tyurin et al.，2004)，而這一方法如果采用常規(guī)商業(yè)化的電轉(zhuǎn)化儀，轉(zhuǎn)化效率 不會超過102/μ gDNA。低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化方法是近幾年才發(fā)現(xiàn)的、一種處于不斷完善的新方法。該 方法的原理是通過超聲波在細胞膜表面瞬時產(chǎn)生微型囊泡，該囊泡在形成的同時可以裹入 與之相鄰的核酸、多糖等生物大分子。然后囊泡破裂并在細胞膜上形成一個納米通道，其包 裹的生物大分子通過納米通道和細胞膜在自我修復的同時嵌入細胞內(nèi)部，完成“攝入”或者 轉(zhuǎn)化過程。該方法最初主要用于真核細胞的轉(zhuǎn)化和基因療法(Liu et al. , 2006,Manomeet al. ,2005, Newman & Bettinger, 2007) 在原核生物中的報道始于 2007 年(University of Sheffield) (Song et al.，2007)。但是目前報道的超聲波轉(zhuǎn)化法仍然僅僅局限在革 蘭氏陰性菌或者中溫菌中。主要包括大腸桿菌(Escherichia coli DH5a)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)禾口惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)。對于該方法若經(jīng)改進，能否應用于革蘭氏陽性菌、高溫菌或者古菌， 目前未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用基于超聲波聲致穿孔的原理，通過超聲波在微生物 細胞膜表面形成的瞬時囊泡，將細胞外部的生物大分子(脫氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白、 多糖等)裹入其中，然后通過細胞膜的自我修復功能，使膜上的囊泡連同內(nèi)容物一起攝入 細胞內(nèi)部。由于超聲波功率過大時，也可以在細胞內(nèi)部形成空泡，該空泡破裂時釋放的能量 足以使整個細胞破碎。為了避免這一弊端，本發(fā)明采用的超聲波為低頻(0. 1-1000千赫)、 低功率(0.01-1000瓦特)。這一設置可以保證在細胞膜上形成囊泡的同時，不破壞細胞膜 和周圍生物大分子的結(jié)構(gòu)。由于本發(fā)明中超聲波介導的方法采用非探頭式接觸，所有反應 過程培養(yǎng)液原位進行，因此更安全可靠。該方法可以應用于難轉(zhuǎn)化微生物(如高溫、厭氧 的革蘭氏陽性細菌)核酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，還可以應用于控制生物反應器中特定底物(核酸、多 糖、蛋白以及特定化學藥物等生物大分子)與細胞的接觸、攝取和代謝過程。既可以對單 個細胞、單個反應器操作，也可以實現(xiàn)高通量，而且操作簡單，隨意控制，并可以實現(xiàn)遠程遙 控。具體地說，本發(fā)明提供的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，包括如下主要步 驟1)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌至對數(shù)期；2)在含有步驟1中的液體培養(yǎng)基的玻璃瓶中加入待轉(zhuǎn)化的底物；3)將步驟2中的玻璃瓶放入超聲波儀器的空腔內(nèi)；4)啟動超聲波儀器，頻率0. 1-1000千赫，功率0.01-1000瓦特，采用非探頭式接 觸，整個轉(zhuǎn)化過程在生物反應器的溶液中進行，連續(xù)可調(diào)或間歇式超聲波；5)細胞復蘇、轉(zhuǎn)接、涂平板。所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，步驟1的細菌是指40°C -90°C 的高溫菌、厭氧菌、革蘭氏染色陽性菌或古菌。所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，細菌為嗜熱厭氧產(chǎn)乙 酉享 If M (Thermoanaerobacter ethanolicus) ^^K^^Mft (Thermoanaerobium brockii)、木聚糖降解嗜熱菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、麻氏嗜熱厭氧桿 胃(Thermoanaerobacterium mathranii) ^ Mft H^-t^^lf (Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、嗜熱厭氧斜桿菌(Thermoanaerobacter italicus)魏氏嗜熱厭氧 桿菌(Thermoanaerobacterwiegelii)、纖維素降角軍嗜熱桿菌(Thermoanaerobacter thermocopriae)、嗜熱角軍糖梭菌(Clostridium thermosaccharo 1 yticum)、熱纖梭菌 (Clostridiumthermocellum)、高溫溶劑梭菌(Clostridium straminisolvents)、獎堆 梭菌(Clostridium stercorarium)、嗜熱硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulf uricum)、嗜熱丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)以及熱解纖維素果汁桿菌 Caldicellulosiruptor kristjanssonii 禾口 Caldicellulosiruptor saccharolyticus,紅球菌(Rhodococcus sp·)、古細菌(Archaea)0所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，步驟2加入的待轉(zhuǎn)化的底物為分子量大于100道爾頓的生物大分子，如DNA、RNA、質(zhì)粒、基因組、蛋白質(zhì)、多糖、脂類、抗 生素、納米顆粒中的一種或多種。所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，步驟3的空腔內(nèi)液體的液面 高于玻璃瓶內(nèi)液體的液面。本發(fā)明的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，可以應用在微生物遺傳代謝工程 中。本發(fā)明提供的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化方法突破了高溫或者革蘭氏陽性菌難以轉(zhuǎn) 化的障礙，利用德克薩斯紅標記的葡聚糖轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性嗜熱厭氧乙醇桿菌，轉(zhuǎn)化效率可 以到達27%以上，利用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性嗜熱厭氧乙醇桿菌，轉(zhuǎn)化效率可以達到 6X102/Ug DNA以上。與傳統(tǒng)的化學轉(zhuǎn)化或者電穿孔轉(zhuǎn)化相比，本發(fā)明建立的超聲波轉(zhuǎn)化 法的優(yōu)點在于(1)無需制備感受態(tài)細胞、無需制備原生質(zhì)體、無需反復離心、洗滌等步驟；所需 要的細胞為正常培養(yǎng)的、且處于生長期的細胞。(2)超聲波過程中不采用探頭接觸，因此完全可以采用聲波遠程控制。(3)對于厭氧菌，無需在厭氧工作站中操作超聲波轉(zhuǎn)化，僅需要將培養(yǎng)瓶密封，放 在超聲波容器內(nèi)即可。(4)本發(fā)明中建立的超聲波轉(zhuǎn)化方法，對細胞和質(zhì)粒DNA等生物大分子不產(chǎn)生任 何破壞作用。(5)本方法不需要昂貴的儀器即可實現(xiàn)。如普通的Branson B200超聲波儀 (40kHz,19W)。(6)本發(fā)明還可以應用于以下高溫或革蘭氏陽性細菌嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 (Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobium brockii)、 木聚糖降解嗜熱菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、麻氏嗜熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacterium mathranii)、厭氧糖化嗜熱桿菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)、嗜熱厭氧斜桿菌(Thermoanaerobacter italicus)、魏氏嗜熱厭氧桿 胃(Thermoanaerobacter wiegelii) Λ^f i^MMbW^If S" (Thermoanaerobacterthermoc opriae)、嗜熱角軍糖梭菌(Clostridium thermosaccharoIyticum)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、高溫溶齊Ll梭菌(Clostridium straminisolvents)、獎堆梭菌(Clostridium stercorarium)、嗜熱硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)、嗜熱 丁酸梭 菌(Clostridium thermobutyricum)以及熱解纖維素果汁桿菌 Caldicellulosiruptor kristjanssonii 禾口 Caldicellulosiruptor saccharolyticus ；對于其它嗜熱革蘭氏陽性 細菌或古細菌，本發(fā)明建立的方法同樣適用。(7)本發(fā)明可以實現(xiàn)低成本、高通量。一次可以對幾十、上百個生物樣品進行轉(zhuǎn)化。此外，本發(fā)明中建立的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化方法還可以應用于控制生物反應器 中特定底物(DNA、RNA、多糖、蛋白以及特定化學藥物等生物大分子)與細胞的接觸、攝取和 代謝過程。既可以對單個細胞、單個反應器操作，也可以實現(xiàn)對多反應器高通量操作，而且 步驟簡單，容易控制。


圖1是超聲波轉(zhuǎn)化嗜熱厭氧乙醇桿菌(德克薩斯紅標記的葡聚糖)。圖1A是利用超聲波方法(Branson B200,40kHz, 19W)將德克薩斯紅標記的葡聚糖 轉(zhuǎn)化入嗜熱厭氧乙醇桿菌中。超聲波持續(xù)時間為0-40秒(S)；轉(zhuǎn)化后利用01ympUS-BX51熒 光顯微鏡觀察細胞，第一排為可見光視野，第二排為熒光視野，標尺為10 U m。圖1B是超聲波持續(xù)時間對德克薩斯紅標記葡聚糖轉(zhuǎn)化效率的影響。利用超聲波 方法(Branson B200,40kHz, 19W)將德克薩斯紅標記的葡聚糖轉(zhuǎn)化入嗜熱厭氧乙醇桿菌中。 超聲波持續(xù)時間為0-40秒(Sec)，然后將細胞反復洗滌，在熒光顯微鏡觀察紅色熒光細胞 占全部細胞的比例。每一時間的數(shù)據(jù)統(tǒng)計來自5個不同的視野，取平均值。圖2是超聲波轉(zhuǎn)化不動桿菌(納米顆粒)，利用超聲波將納米金粒轉(zhuǎn)化入不動桿菌 中。桿菌內(nèi)部的黑色顆粒為納米金粒。透射電鏡觀察，標尺為1微米。
具體實施例方式本發(fā)明的目的在于提供一種快速轉(zhuǎn)化高溫厭氧革蘭氏陽性細菌的轉(zhuǎn)化方法及其 在細胞發(fā)酵和代謝工程中的應用。本發(fā)明的創(chuàng)新性在于采用低頻超聲波，其特征性頻率為0. 1-1000千赫；功率為 0.01-1000瓦特；采用非探頭式接觸；整個轉(zhuǎn)化過程在生物反應器的溶液中進行。時間連續(xù) 可控，并能實現(xiàn)隨意控制。本發(fā)明提供的快速轉(zhuǎn)化嗜熱厭氧革蘭氏陽性細菌的方法，包括如下步驟1)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌至對數(shù)期；2)在含有步驟1中的液體培養(yǎng)基的玻璃瓶中加入待轉(zhuǎn)化的底物如核酸、多糖等 生物大分子；3)將步驟2中的玻璃瓶放入超聲波儀器的空腔內(nèi)，空腔內(nèi)液體的液面略高于玻璃 瓶內(nèi)液體的液面，而不至于完全浸沒玻璃瓶；4)啟動超聲波儀器；5)細胞復蘇、轉(zhuǎn)接、涂平板。所述的方法中，步驟1中的嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌是指最適生長溫度高于40°C、 嚴格或兼性厭氧、革蘭氏染色為陽性的細菌或古菌，主要包括嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 (Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobium brockii)、 木聚糖降解嗜熱菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、麻氏嗜熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacterium mathranii)、M ft H B譽 % |f 胃(Thermoanaerobacterium saccharo 1 yticum)、嗜熱厭氧斜桿菌(Thermoanaerobacter italicus)、魏氏嗜熱厭氧桿 胃(Thermoanaerobacter wiegelii) ^^fi^MM^If S" (Thermoanaerobacterthermoc opriae)、嗜熱角軍糖梭菌(Clostridium thermosaccharo 1 yticum)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、高溫溶齊梭菌(Clostridium straminisolvents)、獎堆梭菌(Clostridium stercorarium)、嗜熱硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)、嗜熱 丁酸梭 菌(Clostridium thermobutyricum)以及熱解纖維素果汁桿菌 Caldicellulosiruptor krist janssonii 禾口 Caldicellulosiruptor saccharolyticus，紅球菌(Rhodococcus sp.)和古細菌(Archaea)。本發(fā)明提供的低頻超聲波轉(zhuǎn)化方法在細胞發(fā)酵和代謝工程中的應用，包括如下步 驟1)在反應器中培養(yǎng)細菌、病毒、細胞、真菌等微生物至一定生長時期；2)向反應器中加入特定的生物大分子，主要包括DNA、RNA、多糖、抗生素、蛋白 質(zhì)、維生素；3)連續(xù)或者間歇啟動超聲波；此時生物大分子會被攝入細胞內(nèi)部，啟動隨后的細 胞內(nèi)代謝或調(diào)控過程。以下的實施例可以使本專業(yè)技術領域的技術人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。實施例1 (以德克薩斯紅標記的葡聚糖轉(zhuǎn)化嗜熱厭氧乙醇桿菌為例)1)細菌培養(yǎng)將嗜熱厭氧乙醇桿菌接種到已除氧的的RCM培養(yǎng)基(配方酵母膏3g/L，牛肉膏 10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉lg/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，NaCl 3g/ L，NaAc 3g/L，瓊脂0. 5g/L，刃天青2mg/L,加蒸餾水補至總體積為1L，調(diào)整pH值為6. 8，通 N2除氧，115°C濕熱滅菌15min。RCM固體培養(yǎng)基配制瓊脂1. 25%，其它同RCM培養(yǎng)基)， 培養(yǎng)瓶為底部完全扁平的小青瓶。60°C厭氧培養(yǎng)，待菌液長至對數(shù)期，此時細胞濃度應為 109cellS/mL。(注不同種屬的厭氧微生物培養(yǎng)基配方不同，RCM培養(yǎng)基僅適合嗜熱厭氧產(chǎn) 乙醇桿菌，對于特定的微生物，需要選用相應的培養(yǎng)基)。2)向步驟1的小青瓶中加入德克薩斯紅標記的葡聚糖(Dexas-Redconjugated dextran，70kDa，Invitrogen)，葡聚糖終濃度為 1. 25mg/mL。3)將含有德克薩斯紅標記的葡聚糖和嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的小青瓶放入超聲波 儀器的空腔內(nèi)，空腔內(nèi)液體的液面略高于玻璃瓶內(nèi)培養(yǎng)基的液面，但又不至于完全浸沒玻 璃瓶。如果小青瓶在超聲波儀器內(nèi)腔的液面上漂浮，可以用支架固定。4)啟動超聲波儀器。儀器型號為Branson B200 (40kHz，19W)，超聲波持續(xù)時間為 20秒。5)離心收集菌體，并用滅菌的生理鹽水洗滌4次，放在熒光顯微鏡 (01ympus-BX51)下觀察菌體有無紅色熒光。如果菌體呈現(xiàn)紅色熒光，說明德克薩斯紅標記 的葡聚糖已被轉(zhuǎn)化入菌體內(nèi)部；如果沒有熒光，說明德克薩斯紅標記的葡聚糖沒有被轉(zhuǎn)化 入細胞。統(tǒng)計6個不同視野內(nèi)熒光和沒有熒光的菌體總數(shù)。陽性對照為未經(jīng)過洗滌的德克 薩斯紅標記的葡聚糖和細胞混合物，陰性對照為沒有加德克薩斯紅標記葡聚糖的細胞。計 算轉(zhuǎn)化效率，此時的轉(zhuǎn)化效率應為27% (見圖1)。實施例2 (以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化嗜熱厭氧乙醇桿菌為例)1)細菌培養(yǎng)將嗜熱厭氧乙醇桿菌接種到已除氧的的RCM培養(yǎng)基(配方酵母膏3g/L，牛肉膏 10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉lg/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g/L，NaCl 3g/L， NaAc 3g/L，瓊脂0. 5g/L，刃天青2mg/L,加蒸餾水補至總體積為1L，調(diào)整pH值為6. 8，通N2 除氧，115°C濕熱滅菌15min。RCM固體培養(yǎng)基配制瓊脂1. 25%，其它同RCM培養(yǎng)基)，培 養(yǎng)瓶為底部完全扁平的小青瓶。60°C厭氧培養(yǎng)，待菌液長至對數(shù)期，此時細胞濃度應為109cells/mL。(注不同種屬的厭氧微生物培養(yǎng)基配方不同，RCM培養(yǎng)基僅適合嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌，對于特定的微生物，需要選用相應的培養(yǎng)基，此為公知技術，不作詳細介紹)。2)向步驟1的小青瓶中加質(zhì)粒pIKM2(該質(zhì)粒含有梭菌啟動子，可以表達β-葡聚 糖酶，卡那霉素抗性)，質(zhì)粒用量為5 μ g。3)將含有5 μ g質(zhì)粒pIKM2和ImL嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的小青瓶放入超聲波儀器 的空腔內(nèi)，空腔內(nèi)液體的液面略高于玻璃瓶內(nèi)培養(yǎng)基的液面，但又不至于完全浸沒玻璃瓶。 如果小青瓶在超聲波儀器內(nèi)腔的液面上漂浮，可以用支架固定。4)啟動超聲波儀器。儀器型號為Branson B200 (40kHz，19W)，超聲波持續(xù)時間為 20秒。5)然后向含有質(zhì)粒PIKM2和嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的小青瓶中加入5mL新鮮的RCM 液體培養(yǎng)基，45°C復蘇5小時，然后在厭氧工作站中涂布RCM固體培養(yǎng)基(含有250 μ g/mL 卡那霉素)。在厭氧罐中培養(yǎng)5-7天。6)在RCM固體平板上挑取單克隆，采用PCR方法鑒定陽性菌落。同時對于轉(zhuǎn)化子 的培養(yǎng)物，采用已經(jīng)公知的方法檢測葡聚糖酶活性。如果轉(zhuǎn)化成功，則能夠檢測到酶 活。陽性對照為商品化的葡聚糖酶，陰性對照為不含有葡聚糖酶基因的空載體轉(zhuǎn) 化的嗜熱厭氧乙醇桿菌。此時陽性轉(zhuǎn)化子的比活力為0. 9U/mg，而不含有β -葡聚糖酶基因 的空載體轉(zhuǎn)化的嗜熱厭氧乙醇桿菌沒有任何活性。實施例3本發(fā)明提供的低頻超聲波轉(zhuǎn)化方法在細胞發(fā)酵和代謝工程中的應用(以納米顆 粒轉(zhuǎn)化不動桿菌Acinetobacter sp.為例)1)在5L反應器中培養(yǎng)不動桿菌至對數(shù)生長時期；2)向反應器中加入納米金粒(Gold nanoparticles)。3)連續(xù)或者間歇啟動超聲波40kHZ，10秒。此時納米顆粒會被攝入細胞內(nèi)部，啟 動隨后的細胞內(nèi)代謝調(diào)控過程。4)用無菌生理鹽水洗滌細胞，然后利用透射電鏡觀察納米金粒在不動桿菌中的分 布。如果轉(zhuǎn)化成功，納米金粒會在菌體內(nèi)部形成顆粒狀陰影(見圖2)。
權(quán)利要求
一種低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，包括如下主要步驟1)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌至對數(shù)期；2)在含有步驟1中的液體培養(yǎng)基的玻璃瓶中加入待轉(zhuǎn)化的底物；3)將步驟2中的玻璃瓶放入超聲波儀器的空腔內(nèi)；4)啟動超聲波儀器，頻率0.1-1000千赫，功率0.01-1000瓦特，采用非探頭式接觸，整個轉(zhuǎn)化過程在生物反應器的溶液中進行，連續(xù)可調(diào)或間歇式超聲波；5)細胞復蘇、轉(zhuǎn)接、涂平板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，步驟1的細菌是 指40°C -90°C的高溫菌、厭氧菌、革蘭氏染色陽性菌或古菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中， 細菌為嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜熱厭 _ 胃(Thermoanaerobium brockii)> M. W ^ M ^m ^ M (Thermoanaerobacterium xylanolyticum) > 15 BW ^ M ft If lif (Thermoanaerobacterium mathranii) > M ft H ft. Bf ^ ff lif (Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、 嗜熱厭氧斜桿菌 (Thermoanaerobacter italicus) I 氏口譽 % M ft If (Thermoanaerobacterwiegelii)、 纖維素降解嗜熱桿菌(Thermoanaerobacter thermocopriae)、嗜熱解糖梭菌 (Clostridium thermosaccharo 1 yticum)、熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)、高溫 溶劑梭菌(Clostridium straminisolvents)、獎堆梭菌(Clostridium stercorarium)、 嗜熱硫化梭菌(Clostridiumthermohydrosulfricum)、嗜熱丁 酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)以及熱角軍纖維素果？十桿菌 Caldicellulosiruptor kristjanssonii 禾口 Caldicellulosiruptor saccharolyticus，紅球菌(Rhodococcus sp.)、古細菌(Archaea)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，步驟2加入的待 轉(zhuǎn)化的底物為分子量大于100道爾頓的生物大分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，分子量大 于100道爾頓的生物大分子為DNA、RNA、質(zhì)粒、基因組、蛋白質(zhì)、多糖、脂類、抗生素、納米顆 粒中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中，步驟3的空腔內(nèi) 液體的液面高于玻璃瓶內(nèi)液體的液面。
7.權(quán)利要求1所述的低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法在微生物遺傳代謝工程中 的應用，其中頻率為0. 1-1000千赫，功率0. 01-1000瓦特。
全文摘要
一種低頻超聲波介導的轉(zhuǎn)化微生物的方法，步驟為1)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌至對數(shù)期；2)在含有步驟1中的液體培養(yǎng)基的玻璃瓶中加入待轉(zhuǎn)化的底物；3)將步驟2中的玻璃瓶放入超聲波儀器的空腔內(nèi)；4)啟動超聲波儀器，頻率0.1-1000千赫，功率0.01-1000特，采用非探頭式接觸，整個轉(zhuǎn)化過程在生物反應器的溶液中進行，連續(xù)可調(diào)或間歇式超聲波；5)細胞復蘇、轉(zhuǎn)接、涂平板。本發(fā)明可以對單個細胞、單個反應器操作，也可以實現(xiàn)高通量，而且操作簡單，隨意控制，并可以實現(xiàn)遠程遙控。
文檔編號C12R1/145GK101875947SQ20101018640
公開日2010年11月3日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者宋厚輝, 徐健, 林璐, 黃巍 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所