專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)定向進(jìn)化手段獲得的rsp_2728酯酶突變基因及酯酶在扁桃酸甲酯拆分反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶工程與基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及通過(guò)定向進(jìn)化手段獲得源于類(lèi) 球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株的酯酶 RSP_2728 基因(GeneID 3720458)的突 變體，以及將突變基因與表達(dá)載體pET-30a(+)相連接后在大腸桿菌中的表達(dá)以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酯酶是一類(lèi)十分重要的生物催化劑，它能夠水解催化一系列酯鍵并生成相應(yīng)的酸和醇，其立體選擇性是其催化反應(yīng)的一個(gè)重要特性，廣泛用于合成食品添加劑、農(nóng)用化學(xué)品 和醫(yī)藥中間體等重要手性化合物。酶催化的立體選擇性反應(yīng)是當(dāng)今手性藥物合成研究的熱
；ο從自然界中獲得的酶不能達(dá)到手性拆分的理想程度，往往具有一定的局限性，因 此，通過(guò)相關(guān)技術(shù)提高酶的立體選擇性具有重要的意義。在對(duì)酶結(jié)構(gòu)或催化機(jī)理信息缺乏 的情況下，定向進(jìn)化技術(shù)為開(kāi)發(fā)新的生物催化提供了有力的工具。許多研究表明，采用定向 進(jìn)化技術(shù)可以提高酶的立體選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)定向進(jìn)化手段獲得的RSP_2728酯酶突變基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種通過(guò)定向進(jìn)化手段獲得的RSP_2728酯酶突變基因 編碼的酯酶及其應(yīng)用。一種類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的RSP_2728基因的突變基因，其特 征在于，所述突變基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(2)序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列；(3)序列表中SEQ ID NO 3的核苷酸序列；(4)序列表中SEQ ID NO 4的核苷酸序列；由突變基因編碼的酯酶，所述酯酶的氨基酸序列是下列氨基酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO 5的氨基酸序列；(2)序列表中SEQ ID NO 6的氨基酸序列；(3)序列表中SEQ ID NO 7的氨基酸序列；(4)序列表中SEQ ID NO 8的氨基酸序列；其中，序列表中SEQ ID NO 5的氨基酸序列編碼的酯酶命名為XLA，相對(duì)于野生型 其第62位的天冬酰胺突變成酪氨酸；序列表中SEQ ID NO :6的氨基酸序列編碼的酯酶命名 為XLB，相對(duì)于野生型其第62位的天冬酰胺突變成酪氨酸、第145位亮氨酸突變成組氨酸； 序列表中SEQ ID NO 7的氨基酸序列編碼的酯酶命名為XLC，相對(duì)于野生型其第62位天冬酰胺突變成半胱氨酸、第145位亮氨酸突變成組氨酸；序列表中SEQ ID NO :8的氨基酸序列 編碼的酯酶命名為XLD，相對(duì)于野生型其第62位天冬酰胺突變成半胱氨酸、第121位甲硫氨 酸突變成頡氨酸、第145位亮氨酸突變成組氨酸。酯酶XLA、XLB、XLC或XLD的獲得方法，其特征在于根據(jù)SEQ ID NO =USEQ IDNO 2、SEQ ID NO :3或者SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增的方法獲得 擴(kuò)增產(chǎn)物并將其與表達(dá)載體pET-30a (+)相連后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo) 表達(dá)后獲得重組酯酶。酯酶的XLA、XLB、XLC或XLD的應(yīng)用，其特征在于將所述酯酶用于扁桃酸甲酯的 拆分反應(yīng)，當(dāng)為酯酶XLA時(shí)，其對(duì)(S)-型扁桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選擇 性從E = 3. 1提高到了 E = 5. 3，其對(duì)扁桃酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從10U/mg提高到 了 43U/mg;當(dāng)為酯酶XLB時(shí)，其對(duì)(S)-型扁桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選 擇性從E = 3. 1提高到了 E = 8. 8，其對(duì)扁桃酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從6U/mg提高到 了 142U/mg ；當(dāng)為酯酶XLC時(shí)，其對(duì)(S)-型扁桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選 擇性從E = 3. 1提高到了 E = 14. 0，其對(duì)扁桃酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從6U/mg提高到 了 88U/mg ；當(dāng)為酯酶XLD時(shí)，其對(duì)(S)-型扁桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選 擇性從E = 3. 1提高到了 E = 30. 8，其對(duì)扁桃酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從6U/mg提高到 了 20U/mg。 一種含有酯酶RSP_2728突變基因的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，它是將含有酯酶基因的重組 載體導(dǎo)入到宿主；所述宿主為大腸桿菌DH5 α，BL21或者JM109之一。一種以溴百里香芬蘭為指示劑，通過(guò)監(jiān)測(cè)酯水解反應(yīng)所產(chǎn)生的氫離子濃度來(lái)確定 酶活的高通量篩選方法。類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株的RSP_2728野生型基因，其核苷酸 序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過(guò)對(duì)一個(gè)類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株中的酯酶 RSP.2728進(jìn)行基因工程改造，從分子水平進(jìn)行研究，獲得了在消旋酯的拆分反應(yīng)過(guò)程中，酶 立體選擇性明顯提高的突變株，適用于工業(yè)應(yīng)用。本發(fā)明中所獲得的突變酯酶XLA，XLB, XLC, XLD的特點(diǎn)在于和野生型的酯酶相比 較，在拆分消旋扁桃酸甲酯的時(shí)候，其立體選擇性具有非常明顯的提高，XLD的立體選擇性 達(dá)到最高E = 30. 8，其活力較野生型而言也有明顯提高；XLB對(duì)底物的反應(yīng)活力最高，達(dá)到 142U/mg。


圖1顯示了一種含有酯酶基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建策略圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1酯酶RSP_2728突變基因的分子克隆與表達(dá)1、通過(guò)易錯(cuò)PCR獲得酯酶突變基因利用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株(從中國(guó)普通微 生物保藏管理中心獲得，菌種保藏編號(hào)為CGMCC 1.1737)中的RSP_2728基因，獲得突變序列。易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中，擴(kuò)增引物為 S2a(5，-CGGGATCCATGACACGCAAGCTGACGTTCG-3，)和 S2b(5， -CCCAAGCTTTCAGTCCGGCAGACGCTCCTTC-3，)。擴(kuò)增體系為50 ill反應(yīng)體系10x 易錯(cuò) PCR 緩沖液:3-8u 1 ；Mg2+ (25mM/L) :2-8u 1 ；dNTP(10mmol/L dGTP, lOmmol/L dATP, lOmmol/L dCTP 和 lOmmol/LdTTP 混合物) 0. 5-3 u 1 ；引物 S2a 和 S2b :5_40pmol ；DNA 模板5-40pmol ；Taq DNA 聚合酶5_10U ；用雙蒸水補(bǔ)足體系。擴(kuò)增條件95°C2-3min ；95°C 45_60s，50-59°C 40_90s，72°C 40_90s，30-35 個(gè) 循環(huán)；72°C lOmin。最終獲得易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用于構(gòu)建酯酶突變文庫(kù)。2、酯酶突變文庫(kù)的構(gòu)建將易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳，用PCR純化回收試劑盒進(jìn) 行純化回收。純化后的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行37°C酶切過(guò)夜后與 pET-30a (+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB (含50 y g/ml卡那霉素) 固體培養(yǎng)板上，37°C培養(yǎng)，挑選具有插入片段的克隆，獲得的克隆構(gòu)建成成突變體庫(kù)。實(shí)施例2酯酶RSP_2728突變基因的活性以及立體選擇性的篩選1、突變體的高通量誘導(dǎo)表達(dá)采用96微孔板進(jìn)行表達(dá)。將LB固體培養(yǎng)板上的單菌落逐個(gè)挑選到含有200 u 1/ 孔LB培養(yǎng)基(含50 y g/ml卡那霉素)的96孔板中(此板以下稱(chēng)為母板)，將母板于37°C、 200r. p. m.轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，以2%的接種量，將母板上每個(gè)孔中的菌液接 種到新的含有500 u 1/孔LB培養(yǎng)基(加50 y g/ml卡那霉素抗性)的96孔微量板中(此 板以下稱(chēng)為子板)；同時(shí)，母板中每個(gè)孔加10%的甘油，-80°C保存以備今后使用。將子板于 37°C、220r. p. m.搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，待每個(gè)孔中菌液達(dá)到0D6(1(1約為0. 5左右，加入0. lmmol/ L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4h后，4750r. p. m.離心10分鐘，洗滌，收集菌體。在將離心后的 子板放入-80°C過(guò)夜后，每個(gè)孔加入250 ill的磷酸鹽裂解緩沖液(PBS(pH7. 4)0. lmol/L, MgCl210mmol/L, lysozyme 0. 5mg/ml，DNaseI 2U/ml)，放于 37°C培養(yǎng) 40_60min。此時(shí)，由于 冷熱膨脹，菌體細(xì)胞壁破碎，其含有的酶蛋白將釋放在液體中。4750r. p. m.離心10分鐘，并 用 PBS (NaCl 8g/L, KC1 0. 2g/L, Na2HP04 12H20 3. 63g/L, KH2P04 0 . 24g/L, pH 7. 4)溶液洗 滌后，將酶液轉(zhuǎn)移，保存，用于之后立體選擇性的高通量篩選。2、立體選擇性的高通量篩選為了篩選突變后陽(yáng)性克隆的手性選擇性，選用(R)_和(S)_扁桃酸甲酯作為底物， 在96孔反應(yīng)板上進(jìn)行反應(yīng)。(R)-和(S)_扁桃酸甲酯分別加于對(duì)應(yīng)的兩列反應(yīng)微孔中。充 分混勻后，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。由于扁桃酸甲酯在酶的水解下會(huì)形成酸根離子，會(huì)使溶液的 PH值下降，使得溴百里香芬蘭指示劑從初始的藍(lán)綠色變?yōu)辄S色，從而使630nm下的吸光度 發(fā)生變化。因此，直接用酶標(biāo)儀測(cè)得630nm下各個(gè)反應(yīng)孔中的吸光度的變化，便可對(duì)各突變體的手性選擇性進(jìn)行初篩。高通量篩選的反應(yīng)體系溴百里香芬蘭指示劑濃度0. l-5mmol/L ；粗酶液20-80ii g ；(R)_扁桃酸甲酯(溶于叔丁醇、乙腈、異丙醇或者丙酮)10-50mmol/L ；(S)-扁桃酸甲酯(溶于叔丁醇、乙腈、異丙醇或者丙酮)10-50mmol/L ；用PBS緩沖液(pH7. 0-7. 6)補(bǔ)足體系至250 yl。反應(yīng)一定時(shí)間后，觀測(cè)630nm下的吸光度變化，初步比較各突變體的立體選擇性。第一輪高通量篩選，獲得了突變體 A3G4、A1H1, A2E3, A3F12, A3A8, A4G3, A4F6, A6D3，A6A5，A7D11，A8A5，初步顯示立體選擇性的提高；第二輪高通量篩選，獲得了突變體B2G1，B2E3, B2E10, B3E11, B3D12, B4B7, B4C9, B7F11，B8E6，B8G1，B9E11，初步顯示立體選擇性的提高；第三輪高通量篩選，獲得了突變體C1D2，C1F9, C2G10, C3D6, C3C11, C6H10, C7G12, C7G1，C8B2，C8G1，C9B1，初步顯示立體選擇性的提高；第四輪高通量篩選，獲得了突變體D1B5，D3D4, D3E1, D3E11, D4A11, D4E5, D4G12, D4F9, D5D10, D5E1, D6G7, D6G6, D6F6，初步顯示立體選擇性的提高。3、立體選擇性的液相測(cè)定對(duì)于初篩結(jié)果呈現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)從保存的母板中挑取 對(duì)應(yīng)的突變體于5ml LB培養(yǎng)基(卡那霉素溶液50i!g/ml)的試管中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)夜。 第二天，以2%的接種量將試管中的菌液接種到含50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中(卡那霉 素50 ii g/ml)，進(jìn)行37°C下、200r. p. m培養(yǎng)。待菌液0D_值達(dá)到0. 5-1. 0時(shí)，加入0. lmmol/ L的IPTG溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。4h后，離心收集菌體，并用PBS(pH7.4)溶液進(jìn)行洗滌，離心 后收集菌體，溶于3-8ml的50mmol/L Tris_HCl(pH 8.0)溶液中，進(jìn)行超聲破碎。破碎后進(jìn) 行離心(4750r. p. m.，20min)，酶液用于水解反應(yīng)。反應(yīng)體系(R)-和(S)_扁桃酸甲酯消旋體(溶于叔丁醇、乙腈、異丙醇或者丙酮)10-100mmol/L ；酶液20-100ii 1 ；用Tris-HCl (pH = 8. 0)補(bǔ)足至 2_5ml ；于20-50°C，反應(yīng)2_12h，取樣檢測(cè)。使用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)(SPD-20A，Shimadzu)。色譜柱型號(hào)為 AD-H(Daicel,250mmX4. 6mm)手性柱，用紫外/可變波長(zhǎng)檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流動(dòng) 相為異丙醇與正己烷(含千分之一的三氟乙酸)，二者之比為10 90，流速為lml/min。通過(guò)復(fù)篩，獲得了突變體A6A5，B7F11，C8G1和D3E11，其立體選擇性分別從初始的 E = 3. 1，提高到E = 5. 3，E = 8. 8，E = 14. 0以及E = 30. 8，E值代表酶催化的對(duì)映體選 擇性大小。4、活性的液相測(cè)定對(duì)于由實(shí)施例所獲得的立體選擇性提高的突變體A6A5，B7F11，C8G1和D3E11進(jìn)行 活性的測(cè)定。
反應(yīng)體系(R)-和(S)_扁桃酸甲酯消旋體(溶于叔丁醇、乙腈、異丙醇或者丙酮)10-100mmol/L ；酶液20-100ii1 ；用Tris-HCl (pH = 8. 0)補(bǔ)足至 2_5ml ；于20-50°C，反應(yīng)lh，取樣檢測(cè)。使用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)(SPD-20A，Shimadzu)。色譜柱型號(hào)為 AD-H(Daicel,250mmX4. 6mm)手性柱，用紫外/可變波長(zhǎng)檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流動(dòng) 相為異丙醇與正己烷(含千分之一的三氟乙酸)，二者之比為10 90，流速為lml/min。定義每分鐘消耗lymol底物所需要的酶量為一個(gè)單位(1U).其活性分別從初始的10U/mg，提高到 43U/mg，142U/mg, 88U/mg, 20U/mg。實(shí)施例3酯酶突變體的序列分析將由實(shí)施例2所獲得的突變體A6A5、B7F11、C8G1和D3E11進(jìn)行測(cè)序(由上海英進(jìn) 公司完成)，并使用clustalxl 1. 8軟件以及vector軟件進(jìn)行序列比較與分析，分析得到序 列表中SEQ N0. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3和SEQ NO. 4所示的酯酶突變基因。對(duì)理想的突變體進(jìn)行基因序列和氨基酸序列比較，獲得結(jié)果見(jiàn)表1 :表1突變體的序列分析結(jié)果
權(quán)利要求
一種類(lèi)球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides的RSP 2728基因的突變基因，其特征在于，所述突變基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列；(2)序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列；(3)序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列；(4)序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列；
2.一種酯酶，其特征在于所述酯酶由權(quán)利要求1中突變基因編碼，并且所述酯酶的氨 基酸序列是下列氨基酸序列之一(1)序列表中SEQID NO 5的氨基酸序列；(2)序列表中SEQID NO 6的氨基酸序列；(3)序列表中SEQID NO 7的氨基酸序列；(4)序列表中SEQID NO 8的氨基酸序列；其中，序列表中SEQ ID NO :5的氨基酸序列編碼的酯酶命名為XLA，相對(duì)于野生型其第 62位的天冬酰胺突變成酪氨酸；序列表中SEQ ID NO :6的氨基酸序列編碼的酯酶命名為 XLB，相對(duì)于野生型其第62位的天冬酰胺突變成酪氨酸、第145位亮氨酸突變成組氨酸；序 列表中SEQ ID NO 7的氨基酸序列編碼的酯酶命名為XLC，相對(duì)于野生型其第62位天冬酰 胺突變成半胱氨酸、第145位亮氨酸突變成組氨酸；序列表中SEQ ID NO :8的氨基酸序列編 碼的酯酶命名為XLD，相對(duì)于野生型其第62位天冬酰胺突變成半胱氨酸、第121位甲硫氨酸 突變成頡氨酸、第145位亮氨酸突變成組氨酸。
3.—種權(quán)利要求2中酯酶XLA、XLB、XLC或XLD的獲得方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利 要求1中的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增的方法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物并將其與表達(dá)載體 pET-30a(+)相連后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組酯酶。
4.一種權(quán)利要求2所述的酯酶的應(yīng)用，其特征在于將所述酯酶用于扁桃酸甲酯的拆 分反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酯酶的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)為酯酶XLA時(shí)，其對(duì)(S)-型扁 桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選擇性從E = 3. 1提高到了 E = 5. 3 ；其對(duì)扁桃 酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從10U/mg提高到了 43U/mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酯酶的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)為酯酶XLB時(shí)，其對(duì)(S)-型扁 桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選擇性從E = 3. 1提高到了 E = 8. 8 ；其對(duì)扁桃 酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從10U/mg提高到了 142U/mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酯酶的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)為酯酶XLC時(shí)，其對(duì)(S)-型扁 桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選擇性從E = 3. 1提高到了 E = 14. 0，其對(duì)扁桃 酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從10U/mg提高到了 88U/mg。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酯酶的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)為酯酶XLD時(shí)，其對(duì)(S)-型扁 桃酸甲酯立體選擇性從野生型出發(fā)，對(duì)映體選擇性從E = 3. 1提高到了 E = 30. 8 ；其對(duì)扁 桃酸甲酯的活性從野生型出發(fā)，從10U/mg提高到了 20U/mg。
9.一種載體，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的突變基因。
10.一種宿主細(xì)胞，其特征在于包含權(quán)利要求9所述的載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程與酶工程領(lǐng)域。公開(kāi)了酯酶基因RSP-2728的突變基因及其基因工程的應(yīng)用。通過(guò)定向進(jìn)化手段，采用易錯(cuò)PCR和基因克隆方法，以及一種適用于活性以及立體選擇性的高通量篩選方法，通過(guò)四輪篩選，獲得了最終突變酯酶XLA，XLB，XLC和XLD。將其應(yīng)用于扁桃酸甲酯的拆分反應(yīng)中，證實(shí)立體選擇性最高的突變酯酶XLD其立體選擇性與野生型相比較，其對(duì)映體選擇性(E值)從E＝3.1提高到了E＝30.8；對(duì)底物的反應(yīng)活性最高的XLB與野生型相比較，活性從10U/mg，最高提高到了142U/mg。在酯酶拆分消旋底物或者合成重要的藥物中間體中，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101870984SQ20101018686
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者于洪巍, 劉擊, 湯曉玲 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)