專利名稱：一種1, 4-β-D-木聚糖酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及耐熱性提高的1，4-A-D-木聚糖酶突變體。
背景技術(shù)：
木聚糖酶(endo-1，4-/ -xylanases, EC 3. 2. 1. 8)以內(nèi)切方式水解木聚糖分子中的辦-1，4-糖苷鍵，生成低聚木糖和木糖，是半纖維素水解酶系中最關(guān)鍵的水解酶之一，在工業(yè)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。自上世紀(jì)80年代木聚糖酶開始工業(yè)應(yīng)用以來，木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，目前已經(jīng)在飼料、制漿造紙、食品、能源等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。隨著木聚糖酶的應(yīng)用范圍進(jìn)一步拓展，工業(yè)上對其現(xiàn)有性能提出了更高的要求，如長時(shí)間內(nèi)保持活性穩(wěn)定，在極端環(huán)境中保持高的活性(極端溫度或者PH值等)或者可以接受不同的底物(包括非天然底物)。其中酶的熱穩(wěn)定性對于工業(yè)應(yīng)用來說十分重要，而且高溫條件下， 酶的反應(yīng)速度更快，能縮短反應(yīng)周期，節(jié)約成本，也有利于避免反應(yīng)過程中被其他微生物污
^fe ο隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)的手段對酶分子進(jìn)行人工進(jìn)化和改造已成為當(dāng)前酶工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。到目前為止，已有許多學(xué)者運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)成功的改造了各種各樣的酶，取得了令人矚目的進(jìn)展(Zhao，2007， Biotechnogy and Bioengineering 98 (2)，271—275)。胃巾胃辛昔 PCR(error—prone PCR)、 DNA改組(DNA shuffling)、半理性設(shè)計(jì)等已成為酶的分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白質(zhì)的進(jìn)化過禾呈(Lehmann and Wyss, 2001 Current Opinion in Biotechnology 12(4), 371-375 )。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于采用定向進(jìn)化技術(shù)同時(shí)結(jié)合基于序列比對的半理性設(shè)計(jì)方法對來源于Geobacillus stearothermophilus的1，β -D-木聚糖酶ΧΤ6進(jìn)行分子改造， 獲得熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶突變體。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明使用多輪易錯(cuò)PCR方法、DNA改組技術(shù)對1，-D-木聚糖酶ΧΤ6基因進(jìn)行突變，再通過高通量篩選方法將正突變檢出，同時(shí)使用半理性設(shè)計(jì)方法確定部分潛在熱穩(wěn)定相關(guān)位點(diǎn)，再通過定點(diǎn)突變方法得到熱穩(wěn)定相關(guān)突變體。本發(fā)明的具體實(shí)施方法為來源于stearothermophilus (^mhankyH號為 Z^080)的木聚糖酶 XT6 由 379 個(gè)氨基酸組成(Lapidot, Mechaly et al.，1996 Journal of Biotechnogy 51(3)，259-264)(見 SEQ ID NO. 1)。為迅速得到 XT6 全基因序列并提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量，以利于對XT6酶分子的改造，根據(jù)已報(bào)道的XT6基因序列信息(Gat, Lapidot et al.，1994 Applied and Environmental Microbiology 60(6)， 1889-1896)，采用基于PCR的全基因合成方法合成了木聚糖酶XT6全基因序列。同時(shí)根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對其DNA序列進(jìn)行優(yōu)化(在線軟件DNAWorks，Α /7.· //helixweb. nih.^^/ofearorAs/，優(yōu)化合成的的木聚糖酶XT6基因序列為SEQ ID NO. 2)，功能正常的酶蛋白在大腸桿菌BL21-DE3 中過量表達(dá)Siang, Pei et al., 2009 Chinese Journal of Applied and Environmental Biology 15(2), 271-275)。采用易錯(cuò) PCR 方法、DNA 改組技術(shù)對其進(jìn)行隨機(jī)突變，以PET 28a (+)載體構(gòu)建高效突變庫，再將含有突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主 E. coli BL21-DE3中，挑選單克隆于96孔板中表達(dá)蛋白。離心重懸后，取部分菌液加入1% 濃度木聚糖底物反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，以DNS法終止反應(yīng)，測定酶活性。同時(shí)，另取部分菌液熱處理一定時(shí)間，測定殘余活性。殘余活性高于對照的菌株轉(zhuǎn)接到新的96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行重復(fù)篩選。將篩選得到的殘余活性高于對照的菌株，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，獲得突變體DNA序列信息。詳細(xì)方案見實(shí)施例2。同時(shí)采用基于序列比對的半理性設(shè)計(jì)方法獲得熱穩(wěn)定突變體((Lehmarm，Loch et al. , 2002 Protein engineering 15(5)，403-411)。具體做法為，首先將 XT6 氨基酸序列與其他不同來源的17條木聚糖酶氨基酸序列進(jìn)行比對，初步確定有可能影響酶穩(wěn)定性的位點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變得到各個(gè)位點(diǎn)的單點(diǎn)突變體，測定其熱失活半衰期，并與野生型比較，得到酶熱穩(wěn)定性的突變體F360L。詳細(xì)方案見實(shí)施例6。經(jīng)上述對構(gòu)建的突變文庫篩選以及半理性設(shè)計(jì)方法，獲得20個(gè)熱穩(wěn)定性提高的突變體，分別為 10E11、05D03、09D05、08A07、05F03、04D08、04F06、04H09、08G01、06B01、 04D03、03B11、04H12、02E04、06H07、F360L、FAM、FAMG, FTAMG 禾Π FC06T，序列信息見 SEQ ID Ν0. 3—NO. 22，其特征如下
10E11 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?DNA序列由TTT變?yōu)門AT)。05D03 該酶的第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚AT)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。09D05 該酶的第120位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ACC變?yōu)锳TC)、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)。08Α07 該酶的第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。05F03 該酶的256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)。04D08 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第72位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AAA變?yōu)棣ˇ肠?、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270 位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。04F06 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)、第379位的賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸(AAA變?yōu)锳CA)。04H09 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)門AT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第379 位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AAA變?yōu)棣ˇ肠?。08G01 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第112位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼?GAA變?yōu)镚AT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270 位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。06Β01 該酶的第212位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ACT變?yōu)锳TT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?GCA變?yōu)門TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)锳TA )、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)。04D03 該酶的第25位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AAA變?yōu)棣ˇ肠?、第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA )、第270 位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)?GAC )。03Β11 該酶的第137位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼?GAA變?yōu)镚AC)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第 363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)。04Η12 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第115位的脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸(CCG變?yōu)锳CG)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。02Ε04 該酶的第16位的天冬酰胺突變?yōu)橘嚢彼?AAC變?yōu)锳AA)、第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)門AT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA )、第270 位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。06Η07 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第72位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AAA變?yōu)棣ˇ肠?、第120位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ACC變?yōu)锳TC)、第218 位的纈氨酸突變?yōu)楸彼?GAT變?yōu)镚CT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、 第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC 變?yōu)镚AC)、第379位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?AAA變?yōu)锳AC).
F360L 該酶的第360位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?TTT變?yōu)門TA)。FAM 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)門AT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?。FAMG 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第363 位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)。FTAMG 該酶的第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第120位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ACC變?yōu)锳TC)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270 位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)?GAC )。FC06T 該酶的第16位的天冬酰胺突變?yōu)橘嚢彼?AAC變?yōu)锳AA)、第25位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AAA變?yōu)棣ˇ肠?、第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?TTT變?yōu)棣肠ˇ?、第72 位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AAA變?yōu)棣ˇ肠?、第112位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼?GAA變?yōu)?GAT)、第120位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ACC變?yōu)锳TC)、第137位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼?GAA變?yōu)镚AC )、第218位的纈氨酸突變?yōu)楸彼?GAT變?yōu)镚CT)、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(GCA變?yōu)镚TA)、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?ATG變?yōu)棣ˇ肠?、第360位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?TTT變?yōu)棣肠肠?、第363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?GGC變?yōu)镚AC)、 第379位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?AAA變?yōu)锳AC)。將上述突變體的基因連入載體pET ^a (+)，并在宿主細(xì)胞大腸桿菌 Escherichiacoli BL21-DE3中表達(dá)，獲得突變體酶蛋白。
相比野生型1，4-A-D-木聚糖酶XT6，本發(fā)明的20個(gè)突變體熱穩(wěn)定性明顯提高， 在 75° C 的熱失活半衰期( 1/2)分別提高了 2. 4、2. 5、2. 1,3. 1,5. 1、6. 7、8、8. 8、10. 4、9. 2、 19. 9,13. 7,8. 5,10. 4,23,2. 3,7. 3、15、19和52倍，顯示出在造紙制漿，生物能源等工業(yè)上
潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為包含所有已發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定相關(guān)突變位點(diǎn)的7個(gè)突變體不同溫度下殘余酶活的測定。圖2為包含所有已發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定相關(guān)突變位點(diǎn)的7個(gè)突變體在不同溫度下酶的反應(yīng)速率測定。SEQ ID NO. 1 %絮橋、號 Geobacillus stearothermophilus (Genebank 登錄號為 Z29080)的木聚糖酶XT6氨基酸序列，SEQ ID NO. 2為本發(fā)明優(yōu)化的木聚糖酶基因iT6核苷酸序列。SEQ ID NO. 3為突變體10E11的氨基酸序列。SEQ ID NO. 4為突變體05D03的
氨基酸序列。SEQ ID NO. 5為突變體09D05的氨基酸序列。SEQ ID N0. 6為突變體08A07的氨基酸序列。SEQ ID N0. 7為05F03的氨基酸序列。SEQ ID N0. 8為04D08的氨基酸序列。SEQ ID N0. 9為04F06的氨基酸序列。SEQ ID NO. 10為04H09的氨基酸序列。SEQ ID NO. 11 為08G01的氨基酸序列。SEQ ID N0. 12為06B01的氨基酸序列。SEQ ID N0. 13為04D03 的氨基酸序列。SEQ ID N0. 14為03B11的氨基酸序列。SEQ ID N0. 15為04H12的氨基酸序列。SEQ ID N0. 16為02E04的氨基酸序列。SEQ ID N0. 17為06H07的氨基酸序列。SEQ ID N0. 18為F360L的氨基酸序列。SEQ ID N0. 19為FAM的氨基酸序列。SEQ ID N0. 20為 FAMG的氨基酸序列。SEQ ID N0. 21為FTAMG的氨基酸序列。SEQ ID N0. 22為FC06T的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1易錯(cuò)PCR (error - prone PCR)方法構(gòu)建木聚糖酶XT6突變文庫
采用
GeiieMoij:>li;t' Π R^ncloiii Mu^^eue^^ kih 以優(yōu)化后的見 SEQ ID
NO. 2)為模板擴(kuò)增1，4-i3-D-木聚糖酶XT6基因，隨機(jī)引入突變。所用引物為5‘ - TAGGAGGTCATATGAAAAATGCGGACAGCTATGCG-3 ‘， 5 ‘ -ATACGCGGATCCCTATTTGTGATCAATGATCGCCCAATACGCCGGCTT-3‘
反應(yīng)條件為94 ° C預(yù)變性10 min，94 ° C變性30 s，60 ° C退火60 s和72 ° C 延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)，0.8%瓊脂糖電泳，試劑盒回收目的基因片段。按照NEB公司2007-2008產(chǎn)品目錄說明書描述的方法，用Mfe I和及III雙酶切消化后，與經(jīng)過相同酶切的PET 28a(+)載體(卡那霉素抗性基因)進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)條件為載體和片段按摩爾比1:3的比例混合，加入400個(gè)單位的T4連接酶，16 ° C過夜。電擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B，得到超過IO5個(gè)克隆的突變體庫。實(shí)施例2木聚糖酶XT6突變體庫的篩選
將實(shí)施例1中突變庫克隆收集后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21-DE3，涂布含有卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)12 h。挑取單克隆于96孔板，每孔含有150 μ L TB培養(yǎng)基(含有50 yg/mL卡納霉素，1 mM IPTG)，37 ° C，245 rpm，震蕩培養(yǎng)36 h。96孔板復(fù)制器復(fù)制各單克隆于LB固體培養(yǎng)基平板，37 ° C培養(yǎng)12 h后，4 ° C冰箱保存。用排槍輕輕吸出96孔板各孔中的細(xì)胞培養(yǎng)物，按相應(yīng)位置分配于A板和B板的96孔板中，每塊96孔板各孔中的培養(yǎng)物為70 UL0 4000 rpm, 4 ° C，離心10 min，棄去上清，各孔中菌體細(xì)胞用30 μ L，50 mM,pH 7. 6的磷酸鈉緩沖液重懸。A板直接加入50 μ L，50 mM,pH 7. 6的磷酸鈉緩沖液配制的1%木聚糖底物，37° C, 245 rpm，反應(yīng)1.5 h，加入120 μ L DNS溶液， 充分混勻后置于烘箱，顯色，篩選酶活性高于野生型對照的突變體；B板用保鮮膜封好，置于85 ° C烘箱，2 h處理后迅速放置在-20 ° C，溫度快速降至室溫。加入50 μ L用50 mM, pH 7. 6的磷酸鈉緩沖液配制的1% xylan底物，37 ° C，245 rpm，反應(yīng)3 h，加入120 UL DNS溶液，加熱顯色。測定突變體殘余活性，取殘余活性比野生型XT6高的菌株到新的 96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行重復(fù)篩選。篩選到4個(gè)突變體，分別為10E11、05D03、09D05、08A07，殘余活性是野生型對照的2-3倍，分別挑取單克隆送上海英駿生物技術(shù)公司測序。實(shí)施例3突變體和野生型熱酶蛋白粗體物的制備和熱穩(wěn)定性的測定 3. 1粗酶液制備和酶活測定方法
挑取篩選到的突變體單克隆于20 mL TB (50 mg/mL卡那霉素、1. 0 mM IPTG)、37 ° C 培養(yǎng)并誘導(dǎo)36 h后，6000 rpm，離心10 min收集菌體。棄去上清，12 mL磷酸鈉緩沖液(50 mM，pH7. 6)重懸菌體，超聲波破碎細(xì)胞，提取酶蛋白粗提液。酶活測定10 mL離心管中，反應(yīng)體系為0. 2 mL稀釋的粗酶液(用磷酸鹽緩沖液稀釋50倍)，1. 8 mL底物溶液(提前在50 °C溫浴30 min), 50 °C水浴，5 min,再加入3 mL DNS溶液終止反應(yīng)，混勻后，沸水浴中煮沸5 min，立即用冷水冷卻至室溫，540 nm處測定吸光值。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)(Bailey, Biely et al.，1992 Journal of biotechnolgy 23(3)，257-270)。酶活力單位定義在pH 7.6,50 °C條件下，每分鐘產(chǎn)生1 mmol還原糖或者其相等物所需要的酶量為一個(gè)活力單位(U)。3. 2 XT6酶突變體熱穩(wěn)定性的測定
將蛋白濃度0.1 mg/mL的粗酶液40 mL置于容量250 mL的PCR管，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，用PCR儀在75 ° C處理不同的時(shí)間，然后將樣品管放置于冰上冷卻，4 °C, 12000 rpm, 離心25 min，取適量處理后的酶液測定殘余活性，測定方法見3. 1。以未經(jīng)過高溫處理的酶液為參比，得到殘余酶活百分比。以處理時(shí)間為X軸，殘余酶活百分比的自然對數(shù)為Y軸， 用0rigin75軟件做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到酶熱處理時(shí)間與殘余活性的線性方程，以殘余50%的自然對數(shù)為3. 912023來計(jì)算得到相應(yīng)的時(shí)間，此時(shí)間即為突變體的熱失活半衰期 1/2。各突變體在PH 7.6，75 ° C條件下的熱失活半衰期見表1。突變體10E11，05D03， 09D05和08A07在75° C的熱失活半衰期分別為野生型的2. 4,2. 5,2. 1和3. 1倍。將蛋白濃度0. 1 mg/ml的粗酶液300 mL置于1. 5 mL離心管中，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，在pH 7. 6，不同溫度下處理20 min，迅速放置冰上冷卻，4 ° C，12000 rpm，離心25 min, 取適量酶液測定殘余活性，參照實(shí)施案例3. 1。在以未經(jīng)過高溫處理的酶液為參比，得到殘余酶活百分比，結(jié)果見說明書附圖2，與野生型比較，突變體10E11，05D03，09D05和08A07的熱穩(wěn)定性有顯著提高，野生型木聚糖酶在72 ° C處理20 min后，只剩下10%的活性，而4 個(gè)突變體在相同條件下，仍能保持50%的殘余活性。3. 3溫度對酶突變體反應(yīng)速率的影響
在pH 7.5條件下，測定木聚糖酶野生型和突變型在不同溫度下的最大反應(yīng)速率，酶的濃度為 0.1 mg/mL，反應(yīng)溫度分別為 60 ° C，65 ° C，70 ° C，75 ° C，80 ° C，85 ° C， 90 ° C，95 ° C。測定方法同3.1。以最大反應(yīng)速率時(shí)的活性為100%，其他溫度下測定的酶活與它的比值百分比為縱坐標(biāo)，反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，繪制酶活隨反應(yīng)溫度變化的曲線。結(jié)果見說明書附圖2。突變體10E11，05D03，09D05和08A07在82 ° C具有最大反應(yīng)速率，比野生型提高5 ° C。實(shí)施例4第二輪易錯(cuò)PCR突變文庫的構(gòu)建和篩選
4.1突變文庫的構(gòu)建
除以第一輪易錯(cuò)PCR篩選到的三個(gè)突變體10E11、05D03、09D05提取質(zhì)粒作第二輪易錯(cuò) PCR的模板外，隨機(jī)突變體庫的構(gòu)建過程中，引物的選擇，PCR反應(yīng)條件，文庫的構(gòu)建同實(shí)施例1。結(jié)果得到超過IO5個(gè)克隆的隨機(jī)突變體庫。4. 2突變文庫的篩選
將步驟4. 1中構(gòu)建得到的突變體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21-DE3，篩選活性/熱穩(wěn)定正突變時(shí)以10E11、05D03、09D05為參照，熱處理時(shí)間為150 min，其余操作同實(shí)施例2，取活性/殘余活性比突變型10E11、05D03、09D05、高的菌株到新的96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行重復(fù)篩選。篩選到10個(gè)熱穩(wěn)定性提高的酶突變體，分別為05F03、04D08、04F06、04H09、08G01、 06B01、04D03、03B11、04H12、02E04。挑取熱穩(wěn)定正突變體送于上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。4. 3突變體熱穩(wěn)定性的測定
測定方法同實(shí)施例3. 2，結(jié)果(表1)表明，突變體05F03、04D08、04F06、04H09、08G01、 06B01、04D03、03B11、04H12、02E04 在 75 ° C 的熱失活半衰期是野生型的 5. 1,6. 7、8、8. 8、 10. 4、9· 2、19· 9、13· 7、8· 5 和 10. 4 倍。
實(shí)施例5 XT6突變體基因DNA改組突變庫的構(gòu)建和篩選
5.1 DNA改組突變庫的構(gòu)建
以篩選到的木聚糖酶 XT6 突變體 10E11、05D03、09D05、08A07、05F03、04D08、04F06、 04H09、08G01、06B01、04D03、03B11、04H12、02E04 為模板，一對引物 5 ‘ -GTGAGCGGATAACAATTCCC-3‘， 5 ‘ -CCTCAAGACCCGTTTAGAGG-3‘
分別擴(kuò)增各突變體基因，反應(yīng)條件為94 ° C預(yù)變性10 min, 94 ° C變性30 s，60 ° C 退火30 s和72 ° C延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)，0.8%瓊脂糖電泳，試劑盒回收純化目的基因。按照Memmer的方法，DNase I將獲得的DNA目的基因片段處理適當(dāng)時(shí)間，回收5(Tl50 bp 的小片段(Stemmer , 1994 Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 91(22)，10747-10751)。經(jīng)過無引物 PCR 和有引物 PCR，所用引物為5' - TAGGAGGTCATATGAAAAATGCGGACAGCTATGCG-3'， 5 ‘ -ATACGCGGATCCCTATTTGTGATCAATGATCGCCCAATACGCCGGCTT-3‘ 得到重組后的全長目的基因。DNA改組突變文庫的構(gòu)建方法同實(shí)施例1，獲得超過IO5 個(gè)克隆的突變體庫。5. 2 DNA改組突變庫的篩選
篩選正突變以第二輪易錯(cuò)PCR中獲得的熱穩(wěn)定性最高的突變體04D03為參照，熱處理時(shí)間為MO min，其余操作同實(shí)施例2，取殘余活性比突變型04D03高的菌株到新的96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行重復(fù)篩選。篩選到突變體06H07。送于上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。5. 3突變體熱穩(wěn)定性的測定
測定方法同實(shí)施例3. 2，結(jié)果(表1)表明，突變體06H07熱穩(wěn)定性和野生型相比有很大的提高，在75 ° C條件下的熱失活半衰期是野生型的23倍。實(shí)施例6基于序列比對的半理性設(shè)計(jì)
將木聚糖酶XT6氨基酸序列與蛋白質(zhì)文庫(SwissPort)中已知的FlO家族17個(gè)親緣關(guān)系比較近的木聚糖酶氨基酸序列進(jìn)行比對(表2)。在這17個(gè)不同來源的木聚糖酶氨基酸序列中，9個(gè)木聚糖酶來源于嗜熱菌，8個(gè)來自中溫細(xì)菌。他們的氨基酸序列和木聚糖酶 XT6相比，氨基酸相似度在40%-75%之間。序列比對所用軟件為Clustal X。比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶XT6氨基酸序列中Phe94, Ilel51，Tyrl99，Asn261, Phe360和Ile375位的氨基酸在其同源木聚糖酶氨基酸序列相應(yīng)位置占多數(shù)的氨基酸分別為Gly, Val, Phe, lie, Leu和Val0定點(diǎn)突變方法改變這些位點(diǎn)，所用引物
XYL94-F 5 ‘ -GGCATGGATATTCGTGGTCACACCCTGGTGTGG-3‘ XYL94-R 5‘ -CCACACCAGGGTGTGACCACGAATATCCATGCC-3‘ XYL151-F 5' -GAACGTTATAAGGATGATGTAAAGTACTGGGATGTAG-3‘ XYL151-R 5' -CTACATCCCAGTACTTTACATCATCCTTATAACGTTC-3‘ XYL199-F 5' -GGCGATAACATTAAGTTATTCATGAATGACTACAATACCG-3' XYL199-R 5' -CGGTATTGTAGTCATTCATGAATAACTTAATGTTATCGCC-3' XYL261-F 5' -GCACTGGGCCTGGATATCCAAATTACCGAACTGG-3‘ XYL261-R 5' -CCAGTTCGGTAATTTGGATATCCAGGCCCAGTGC-3‘ 360-F 5' -GCAAAGATGCGCCGCTTGTGTTTGGCCCGG-3‘ 360-R 5' -CCGGGCCAAACACAAGCGGCGCATCTTTGC-3‘ XYL375-F 5' -CCGGCGTATTGGGCGGTCATTGATCACAAATAG-3‘ XYL375-R 5' -CTATTTGTGATCAATGACCGCCCAATACGCCGG-3‘
PCR 條件為10 XBuffer 5 mL，引物(10 mM)各 6 mL, dNTP (2.5 mM) 6 mL, pfu (2.5 U/ mL)lmL，質(zhì)粒10 ng，超純水補(bǔ)足50 mL，條件:95 ° C預(yù)變性30 s，95 ° C變性30 s，55 ° C 退火1 min，68 ° C延伸7 min，共12個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1 mL φ/ I處理，37 ° C處理1 h。PCR產(chǎn)物10 mL化學(xué)法轉(zhuǎn)入五cWi DH5a。送于上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株五co/iBL21-DE3。提取突變體酶蛋白，測定其在75° C下的熱穩(wěn)定性。測定方法同實(shí)施例3. 2。結(jié)果得到熱穩(wěn)定性提高的突變體F360L，在75 ° C 的熱失活半衰期為10.5 min，是野生型的2. 3倍(表3)。 實(shí)施例7突變位點(diǎn)組合構(gòu)建XT6新突變體7. 1突變體FAM的構(gòu)建
定點(diǎn)突變方法將突變體05D03的52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?，?gòu)建突變體FAM，所用的引物如下
52-F: 5' - GATGCTGAAGCGTCATTATAACTCAATTGTGGCGG-3'， 52-R: 5' -CCGCCACAATTGAGTTATAATGACGCTTCAGCATC-3' PCR條件以及操作同實(shí)施例6，得到新突變體FAM。
7. 2突變體FAMG的構(gòu)建
定點(diǎn)突變法將突變體FAM的363位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，?gòu)建突變體FAMG。所用的引物如下
363-F: 5' -GCGCCGTTTGTGTTTGACCCGGATTACAAAGTGAAGC-3'， 363-R: 5' -GCTTCACTTTGTAATCCGGGTCAAACACAAACGGCGC-3' PCR條件以及后續(xù)操作同實(shí)施例6，得到突變體FAMG。7. 3突變體FTAMG的構(gòu)建
定點(diǎn)突變法將突變體FAMG的120位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?gòu)建突變體FTAMG，所用的引物如下
120-F: 5' -CCGATGGTGAACGAGATCGATCCGGTGAAACGTG-3'， 120-R: 5' -CACGTTTCACCGGATCGATCTCGTTCACCATCGG-3' PCR條件以及后續(xù)操作同實(shí)施例6，得到突變體FTAMG。7. 4突變體FC06T的構(gòu)建
定點(diǎn)突變法將突變體06H07的16位的天冬酰胺突變?yōu)橘嚢彼幔?5位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?12位的脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸，137位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼幔?60位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?gòu)建突變體FC06T，所用的引物如下 16-F 5' -GCATATTAGCGCCCTGAAAGCGCCACAGCTGG-3‘ 16-R 5' -CCAGCTGTGGCGCTTTCAGGGCGCTAATATGC-3‘ 25-F 5' -CAGCTGGACCAACGGTACATAAATGAATTTACTATTGGTGCG-3‘ 25-R 5' -CGCACCAATAGTAAATTCATTTATGTACCGTTGGTCCAGCTG-3' 112-F 5' -GGTTCTTCCTTGACAAAGATGGAAAACCGATGGTG-3‘ 112-R 5' -CACCATCGGTTTTCCATCTTTGTCAAGGAAGAACC-3‘ 137-F 5' -CTGCTGAAACGCTTGGACACCCACATCAAAACC-3‘ 137-R 5' -GGTTTTGATGTGGGTGTCCAAGCGTTTCAGCAG-3' 360-F 5' -GCAAAGATGCGCCGCTTGTGTTTGGCCCGG-3‘ 360-R 5' -CCGGGCCAAACACAAGCGGCGCATCTTTGC-3‘ PCR條件以及后續(xù)操作同實(shí)施例6，得到突變體FC06T。7. 5 XT6突變體熱穩(wěn)定性測定
木聚糖酶突變體FAM，F(xiàn)AMG, FTAMG, FC06T熱穩(wěn)定性測定方法同3. 2，測定結(jié)果表明 FAM, FAMG,FTAMG,FC06T在75 ° C條件下的熱失活半衰期分別是野生型的7. 3、14. 8、19. 4 和52倍(表1) ;FTAMG，F(xiàn)C06T經(jīng)20 min熱處理后測定殘余活性，78 ° C時(shí)，野生型殘余活性低于1%，而突變體FTAMG仍能保持20%活性，F(xiàn)C06T仍能保持50%的活性，當(dāng)溫度達(dá)到 80° C時(shí)，F(xiàn)TAMG的殘余活性低于5%，而突變體FC06T的殘余活性為30%。溫度對酶突變體反應(yīng)速率的影響測定同3. 3，突變體FTAMG，F(xiàn)C06T在87° C具有最大反應(yīng)速率，比野生型提高10° C。結(jié)果見說明書附圖2。
_ 1突變體在75°C熱失活半衰期
權(quán)利要求
1.一種1，4-A-D-木聚糖酶突變體，其特征在于以SEQ ID NO. 1所示的1， 4-A -D-木聚糖酶XT6氨基酸序列為基礎(chǔ)，經(jīng)突變后具有以下20個(gè)突變體中任一項(xiàng)所述特征的氨基酸序列將其第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?，或者?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸且第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，或者?20位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆业?63 位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔蛘叩?70位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，或者?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆业?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，或者?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?2位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷⒌?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸且270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，或者?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼崆业?79位的賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸，或者第52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆?79位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔蛘叩?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?12位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼帷⒌?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸且270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，或者?12位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?70位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，或者?5位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆业?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，或者?37位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆业?63 位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，或者?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?15位的脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸、第256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸且270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，或者?6 位的天冬酰胺突變?yōu)橘嚢彼?、?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼帷⒌?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸且第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，或者?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼帷⒌?2 位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?20位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?18位的纈氨酸突變?yōu)楸彼帷⒌?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼崆?79位的賴氨酸突變?yōu)樘於０罚蛘叩?60位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，或者?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸且270 位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔蛘叩?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔蛘叩?52位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?20位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?56位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崆?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，或者?6 位的天冬酰胺突變?yōu)橘嚢彼?、?5位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷⒌?2位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?2位賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?12位谷氨酸突變?yōu)樘於彼?、?20位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?37位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼?、?18位纈氨酸突變?yōu)楸彼?、?256位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第270位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?60位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?63位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼崆?79位的賴氨酸突變?yōu)樘於０贰?br> 2.如權(quán)利要求1所述的一種1，4-A-D-木聚糖酶突變體，其特征在于，將突變體的基因連入pET 28a (+)載體，并在宿主細(xì)胞大腸桿菌fecAericAiaco/i BL21-DE3中表達(dá)，獲得突變體酶蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及1,4-β-D-木聚糖酶突變體。本發(fā)明使用易錯(cuò)PCR方法、DNA改組技術(shù)對該酶基因進(jìn)行突變，再通過高通量篩選方法將正突變檢出。并結(jié)合基于序列比對的半理性設(shè)計(jì)方法確定部分潛在熱穩(wěn)定相關(guān)位點(diǎn)，再通過定點(diǎn)突變方法得到熱穩(wěn)定相關(guān)突變體。經(jīng)上述突變文庫構(gòu)建、篩選以及半理性設(shè)計(jì)方法，獲得20個(gè)熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體，其熱失活半衰期比野生型提高2-52倍，顯示出在造紙制漿、生物能源等工業(yè)上潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/56GK102260659SQ20101018732
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者劉艷, 吳中柳, 張志剛 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所