專利名稱：一種快速檢測牛糞便樣品中布魯菌的pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及布魯菌的檢測分析技術(shù)，尤其公開了公開一種快速檢測牛糞便樣品中布魯菌的PCR試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
布魯菌病是由布魯菌(Brucella)引起的一種全世界范圍的人獸共患傳染病，被 世界動物衛(wèi)生組織(0IE)列為B類動物疫病。主要引起許多家畜和野生動物流產(chǎn)，人類通 過食用未巴氏消毒的牛奶及奶制品或直接與感染動物或尸體接觸而感染，臨床上表現(xiàn)為發(fā) 熱(波浪熱)、寒戰(zhàn)、頭痛、全身疼痛、疲勞、腦神經(jīng)功能障礙、關(guān)節(jié)炎等非特異性癥狀。布魯 氏菌是一種革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌，傳統(tǒng)上可分為6個種，即羊種布魯菌(B. melitensis)， 牛種布魯菌(B. abortus)，豬種布魯菌(B. suis)，綿羊附睪種布魯菌(B. ovis)，沙林鼠種布 魯菌(B. neotomae)和犬種布魯菌(B. canis)。其中，羊種布魯菌、牛種布魯菌和豬種布魯菌 是直接危害人類健康，嚴重困擾畜牧業(yè)發(fā)展的主要病原菌，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，布魯菌病的診斷手段主要包括病原分離鑒定、虎紅平板凝集試驗(RBT)、試 管凝集試驗(SAT)和補體結(jié)合試驗(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、PCR等，用常規(guī)方法 分離鑒定病原條件要求苛刻，且費力、費時、危險性高、成功率低。RBT和SAT特異性不高、敏 感性低；CFT操作繁瑣，實驗條件和技術(shù)水平要求高，實踐應(yīng)用極為不便。PCR方法是這些方 法中特異性最強、敏感性最高。在歐美的一些發(fā)達國家已經(jīng)把PCR作為布魯菌病病原診斷 的一種工具。國內(nèi)對于布魯菌病的檢疫診斷還相對比較落后，國內(nèi)很多實驗室建設(shè)仍然還 是空白，對該病的檢測仍然采用RBT、SAT和CFT，遠不能滿足實際需要。因此，開發(fā)簡便易 行、快速、靈敏、特異的分子生物學技術(shù)已成為主要的發(fā)展趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種快速檢測牛糞便樣品中布魯菌的PCR試劑盒，適用于牛糞便樣 品中布魯菌定性檢測。本發(fā)明提供的快速檢測牛糞便樣品中布魯菌的PCR試劑盒包括由DNA提取液、PCR反應(yīng)液、標準陽性模板、布魯菌BCSP31基因特異性引物對和陰 性質(zhì)控標準品組成；其中，正向引物FBCSP31 5 ‘ -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘；反向引物RBCSP31 5 ‘ -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘；標準陽性模板含有布魯菌高度保守基因的301個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的 pMD-18重組載體，該載體在大腸桿菌DH5ci中增殖。PCR 反應(yīng)液由正反向引物 FBCSP31 和 RBCSP31，10 XPCR Buffer (含 Mg2+)，dNTPs 及無 菌雙蒸水組成。布魯菌標準陽性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列為5 ‘ -ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatcca gaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagagga ctggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggag cgagctttgc-3'本發(fā)明所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)DNA 提取液包括如下組分PBS(137mM Nacl，2. 7mM Kcl, lOmM Na2HP04, 2mMKH2P04, PH7. 4)，10XTE (0. 1M Tris_HCl，0. 1M EDTA, pH 8. 0)；2)PCR 反應(yīng)液由正反向引物 FBCSP31 和 RBCSP31，10XPCR Buffer (含 Mg2+)，dNTPs 及 無菌雙蒸水組成；3)標準陽性模板含有布魯菌高度保守基因BCSP31基因301個堿基的核苷酸片 段構(gòu)成的PMD-18重組質(zhì)粒；4)布魯菌BCSP31基因特異性引物序列正向引物FBCSP31 5 ‘ -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘反向引物RBCSP31 5 ‘ -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘5)陰性質(zhì)控標準品陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水。本發(fā)明定性檢測布魯菌的方法，包括以下步驟1)樣本的預(yù)處理，提取DNA ；2)將DNA和陽性標準品分別加入到反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中，進行PCR檢測；取 PCR產(chǎn)物，以瓊脂糖凝膠進行電泳檢查，在凝膠圖像分析儀上觀察301bp的擴增條帶。以下實驗表明試劑盒可以快速檢測布魯菌1)取0. 5g牛糞便樣品于2mL離心管中，加lmL PBS緩沖液(137mM Nacl, 2. 7mMKcl, 10mM Na2HP04, 2mM KH2P04, PH7. 4)，充分振蕩搖勻 5min，500r/m 離心 5min，收集 上清液于另一 2mL離心管中，此步驟重復(fù)2次。上清液13，000r/m離心2min，棄上清，收集 沉淀，用 lOOiiL 10XTE(0. 1M Tris-HCl，0. 1M EDTA PH8. 0)懸浮沉淀，先冰浴 5min，然后 100°C煮沸l(wèi)Omin, 13,000r/m離心2min，取上清1 u L，用于PCR擴增。2)分別取PCR反應(yīng)液各49 u L，取第(1)步所得布魯菌DNA和布魯菌陽性標準模 板各IP L，并設(shè)陰性對照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在PCR儀上平行做PCR檢測。循環(huán) 條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec、65°C退火30sec、72°C延伸30sec，擴增31個循 環(huán)。最后72°C延伸5min。3)取L PCR產(chǎn)物，以1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢查，在凝膠圖像分析儀上觀察 301bp的擴增條帶。重復(fù)試驗3次，所得檢測結(jié)果都相同，說明不同批次之間的檢測結(jié)果具有可比性 和良好的重復(fù)性。見圖1。從上述實例可以說明，PCR方法重復(fù)性好，而且PCR檢測試劑盒對樣品(DNA)的檢 測僅需3 5個小時就能完成。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其積極效果在于該PCR檢測試劑盒實用性強，可直接檢測牛糞便樣品中的布魯菌，3 5小時內(nèi)快 速出結(jié)果、靈敏度高達10pg基因組，裝配成試劑盒使用安全，特異性好，使用步驟簡單，可 重復(fù)性好，可以對牛糞便樣品中的布魯菌進行定性檢測，可以替代傳統(tǒng)的病原學和血清學
4方法。


圖1為布魯菌標準陽性模板PCR擴增圖；圖中，1是DL2000DNA marker，2 5分別為牛種布魯菌544A、牛種布魯菌104M、羊 種布魯菌16M、豬種布魯菌S2pMD-18重組質(zhì)粒的PCR擴增結(jié)果。圖2為PCR試劑盒的特異性鑒定圖；圖中，1是DL2000DNA Marker ;2是牛種布魯菌544A ;3是牛種布魯菌104M ;4是羊 種布魯菌16M ；5是豬種布魯菌S2 ；6是鼠傷寒沙門氏菌；7是金黃色葡萄球菌；8是銅綠假 單胞菌；9是豬鏈球菌；10是大腸桿菌；11是肺炎克雷伯氏菌；12是變形桿菌；13是多殺性 巴氏桿菌；14是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；15是蠟樣芽胞桿菌；16是豬胸膜肺炎放線桿菌血清 1型；17是豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型；18是豬胸膜肺炎放線桿菌血清3型；19是豬胸 膜肺炎放線桿菌血清5型；20是大腸桿菌0157 :H7 ；21是純水對照。圖3為PCR試劑盒的敏感性鑒定圖；圖中，1是DL2000DNA Marker ；2 5是倍比稀釋牛種布魯菌544A基因組DNAPCR 擴增圖，2 的濃度為 lX104pg ；3 是 lX103pg ；4 是 lX102pg ；5 是 lXlObg。圖4為臨床牛糞便樣品的PCR檢測結(jié)果；1是DL2000 DNA Marker ；2是陽性對照； 3 17是臨床牛糞便樣品，18是純水對照。
具體實施例方式通過以下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改 動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實驗材料牛種布魯菌544A(B. abortus 544A)、牛種布魯菌104M(B. abortusl04M)、羊種布魯菌 16M(B. melitensis 16M)、豬種布魯菌 S2 (B. suis S2)滅活 菌液由中國地方病第一研究所提供，限制性內(nèi)切酶、PMD18T克隆載體購自Takara公司， 鼠傷寒沙門氏菌(CVCC541)、豬鏈球菌(CVCC606)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1型 (CVCC259)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型(CVCC260)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌 血清3型(CVCC261)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型(CVCC263)均購自中國獸藥監(jiān)察 所，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸桿菌(ATCC35218)、蠟 樣芽胞桿菌(CMCC(B)63301)、變形桿菌(CMCC (B) 45103)均購自由中國藥品生物制品檢定 所，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(ATCC9610)、大腸桿菌0157 :H7 (912981)、肺炎克雷伯氏菌(臨床 分離株，豬)、多殺性巴氏桿菌(臨床分離株，豬)由本室保存。實施例1 試劑盒組成與配制1) DNA提取液配制緩沖液，包括如下組分PBS (137mM Nacl，2. 7mM Kcl， 10mMNa2HP04, 2mM KH2P04, PH7. 4) 10XTE (0. 1M Tris_HCl，0. 1M EDTA PH8. 0)。2) PCR 反應(yīng)液配制反應(yīng)液 10 X PCR Buffer (含 Mg2+) 10 u L、dNTPs (2. 5mmol/ L) 5 ii L、正向引物和反向引物各2 ii L (10 ii mol/L)、Taq酶(5U/ u L)0. 5u L、無菌雙蒸水29. 5u L ；3)標準陽性模板標準陽性模板為含有布魯菌高度保守基因BCSP31基因301個 堿基的核苷酸片段構(gòu)成的PMD-18重組質(zhì)粒。布魯菌標準陽性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列為5 ‘ -ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggtttt gggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatcca gaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagagga ctggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggag cgagctttgc-3'4)布魯菌BCSP31基因特異性引物序列正向引物FBCSP31 5 ‘ -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘；反向引物RBCSP31 5 ‘ -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘5)陰性質(zhì)控標準品陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水。實施例2 試劑盒的特異性試驗用經(jīng)過DNA有效性驗證鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、豬鏈球 菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、多殺性巴氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、蠟樣芽 胞桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型、豬胸膜肺炎放線桿 菌血清3型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型、大腸桿菌0157 :H7等15種對照，陽性樣品各 1 u L為模板進行PCR反應(yīng)，同時設(shè)陰性對照。PCR擴增條件為循環(huán)條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec、65°C退火30sec、 72°C延伸30sec，擴增31個循環(huán)，最后72°C延伸5min。結(jié)果只有牛種布魯菌544A、牛種布魯菌104M、羊種布魯菌16M、豬種布魯菌S2擴增 出301bp特異性目的片段，而鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、豬鏈球菌、 大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、多殺性巴氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、蠟樣芽胞桿 菌、豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型、豬胸膜肺炎放線桿菌血 清3型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型、大腸桿菌0157 :H7和陰性對照無條帶(見圖2)。上 述結(jié)果說明試劑盒具有較好的特異性。實施例3試劑盒的敏感性試驗將牛種布魯菌基因組DNA的濃度調(diào)整為10ng/ u L，然后進行10倍系列稀釋，每個 稀釋度取1 P L作為模板，分別用所建立的PCR方法進行擴增。以出現(xiàn)陽性條帶所用模板的 最高稀釋度為該方法的最低檢出限。PCR擴增條件為循環(huán)條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec、65°C退火30sec、 72°C延伸30sec，擴增31個循環(huán)，最后72°C延伸5min。通過試驗結(jié)果確定試劑盒的敏感性為10pg基因組(見圖3)。實施例4試劑盒對臨床牛糞便樣品的檢測用試劑盒檢測106份牛糞便樣品，并于虎紅平板凝集試驗結(jié)果進行比較。結(jié)果試劑盒能從106份牛糞便樣品中檢出9份布魯菌感染陽性樣品，與虎紅平板凝集試驗的陽性 符合率為100%。部分臨床牛糞便樣品的PCR檢測結(jié)果見圖4。
權(quán)利要求
一種快速檢測牛糞便樣品中布魯菌的PCR試劑盒，其特征在于由DNA提取液、PCR反應(yīng)液、標準陽性模板、布魯菌BCSP31基因特異性引物對和陰性質(zhì)控標準品組成；正向引物FBCSP315′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′；反向引物RBCSP315′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′；標準陽性模板含有布魯菌高度保守基因的301個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD-18重組載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是PCR反應(yīng)液由正反向引物Fbcsp31和Rbcsp31，10XPCR Buffer (含Mg2+)，dNTPs及無菌雙 蒸水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是布魯菌標準陽性模板所包含的BCSP31基因 的核苷酸序列為5 ‘ -ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggc tgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaat aatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactgg tattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagc tttgc-3‘ ο
4.權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)DNA提取液包括如下組分PBS(137mM Nacl, 2. 7mM Kcl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, PH7. 4) ,10XTE (0. IM Tris_HCl，0. IMEDTA, pH 8.0)；2)PCR 反應(yīng)液由正反向引物 Fbcsp31 和 Rbcsp31，10 X PCR Buffer (含 Mg2+)，dNTPs 及無菌 雙蒸水組成；3)標準陽性模板含有布魯菌高度保守基因BCSP31基因301個堿基的核苷酸片段構(gòu) 成的pMD-18重組質(zhì)粒；4)布魯菌BCSP31基因特異性引物序列正向引物 FBCSP31:5' -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘反向引物 RBCSP31:5' -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘。5)陰性質(zhì)控標準品陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水。
5.一種定性檢測布魯菌的方法，包括以下步驟1)樣本的預(yù)處理，提取DNA;2)將DNA和陽性標準品分別加入到反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中，進行PCR檢測；取PCR產(chǎn) 物，以瓊脂糖凝膠進行電泳檢查，在凝膠圖像分析儀上觀察301bp的擴增條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測牛糞便樣品中布魯菌的PCR試劑盒，涉及一種人獸共患傳染病病原體的基因檢測技術(shù)，適用于布魯菌定性檢測。本發(fā)明由標準陽性模板、PCR反應(yīng)液、布魯菌BCSP31基因特異性引物、陰性質(zhì)控標準品組成。本發(fā)明檢測速度快，特異性好，靈敏度高，使用步驟簡單，可重復(fù)性高，可以替代傳統(tǒng)的病原學檢測方法。
文檔編號C12Q1/04GK101851679SQ201010188839
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者冮森林, 孫長江, 李鐵峰, 杜崇濤, 杜濤峰, 王大力, 雷連成, 韓文瑜 申請人:吉林大學