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      活化蛋白激酶c受體1作為抗腫瘤耐藥靶點(diǎn)的用途的制作方法

      文檔序號(hào):583859閱讀:334來源:國(guó)知局
      專利名稱:活化蛋白激酶c受體1作為抗腫瘤耐藥靶點(diǎn)的用途的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和腫瘤防治領(lǐng)域,更具體而言,本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)、診斷和治 療腫瘤耐藥性領(lǐng)域。本發(fā)明中提供了一種新的腫瘤耐藥標(biāo)志物在腫瘤組織中高表達(dá)并導(dǎo) 致腫瘤耐藥的活化蛋白激酶C受體l(receptor for activated C-kinase 1,RACK1),將該 蛋白作為靶點(diǎn),可設(shè)計(jì)出針對(duì)該蛋白及其相關(guān)分子的預(yù)測(cè)、診斷腫瘤耐藥試劑盒、篩選針對(duì) 該蛋白及其相關(guān)分子的治療腫瘤耐藥的藥物。
      背景技術(shù)
      惡性腫瘤是危害人類健康的一類疾病,化療是目前治療惡性腫瘤的主要手段之 一。然而,化療過程中產(chǎn)生的腫瘤耐藥,卻成為影響腫瘤治療效果的一大障礙。對(duì)腫瘤耐藥 發(fā)生機(jī)制的研究和尋找開發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物是當(dāng)前腫瘤防治中的重要研究領(lǐng)域。為了逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,提高化療療效,本領(lǐng)域迫切需要通過多種方式研究腫瘤耐藥 發(fā)生的機(jī)制、腫瘤耐藥的關(guān)鍵基因靶點(diǎn),并根據(jù)這些靶點(diǎn)設(shè)計(jì)治療腫瘤耐藥的新藥,從而引 導(dǎo)腫瘤耐藥靶向性治療。RACKl (receptor for activated C-kinase 1,活化蛋白激酶 C 受體 1),最早 被報(bào)道為PKCiiII(蛋白激酶C的一種亞型)的受體,分子量約36kd。它含有7個(gè)內(nèi) 在的Trp-Asp (WD40)重復(fù)基序,是G蛋白β亞基的同源物(Mol Pharmaco 12002 ;62 1261-1273)。RACKl的特殊結(jié)構(gòu)使它能與多種激酶及膜受體相互作用,在細(xì)胞應(yīng)答過程中發(fā) 揮著重要的作用。質(zhì)譜分析法發(fā)現(xiàn)RACKl能和核糖體的小亞基結(jié)合,并招募PKC到40S,從而 調(diào)控翻譯起始(Nat Struct Mol Biol2004 ;11 :957_962)。另有文獻(xiàn)報(bào)道,通過冷凍電鏡觀 察到RACKl定位在核糖體40S亞基的頭部區(qū)域,并能和核糖體RNA直接作用,同時(shí),RACKl的 一個(gè)WD序列被暴露,能夠招募其它蛋白至核糖體(Mol Pharmacol 2002;62:1261-1273)。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的主要目的之一就是為了提供一種腫瘤耐藥的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)及蛋白靶點(diǎn), 為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、提高化療療效提供更為有效的工具。本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是根據(jù)這些靶點(diǎn)設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)、診斷腫瘤耐藥試劑盒、篩選 針對(duì)該蛋白及其相關(guān)分子的治療腫瘤耐藥的藥物。本發(fā)明的目的之一是提供一種逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)RACK1,針對(duì)該靶點(diǎn)及其 相關(guān)分子,如RACKl的配體PKC,設(shè)計(jì)藥物和治療方案,下調(diào)腫瘤中RACKl表達(dá)或抑制其功 能,能夠有效治療耐藥腫瘤。在本發(fā)明的第一方面中,提供了一種活化蛋白激酶C的抑制劑或活化蛋白激酶C 受體1的抑制劑在制備降低或消除腫瘤治療中的耐藥性的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,所述活化蛋白激酶C或活化蛋白激酶C受體1來自 人或其它真核生物,例如小鼠、大鼠、?;蚝锏龋宜鼈冎g具有高度的保守性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,所述抑制劑選自抗活化蛋白激酶C或抗活化蛋白激酶C受體1的抗體、針對(duì)活化蛋白激酶C或活化蛋白激酶C受體1編碼序列的RNA干擾 分子或反義寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述抑制劑是抑制活化蛋白激酶C受體1結(jié)合到核糖體的抑制 劑、或是抑制活化蛋白激酶C受體1與其配體結(jié)合抑制劑。在另一個(gè)優(yōu)選例中,所述活化蛋白激酶C的抑制劑選自PKCi3II的抑制劑 CGP-53353 或者 PKC 的抑制劑 Go6976。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中,所述抑制劑是選自下組的RNA干擾分子shRNA、 siRNA、miRNA或dsRNA,更優(yōu)選這些RNA干擾分子是針對(duì)活化蛋白激酶C受體1或其編碼序 列的核糖體定位序列的干擾分子。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述RNA干擾分子選自shRNA或SiRNA,優(yōu)選為針對(duì)活化蛋白激 酶 C 受體 1 的 shRNA,更優(yōu)選所述 shRNA 的序列為CTGACCAGGGATGAGACCA (SEQ ID NO 3)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中,所述抑制劑作用于活化蛋白激酶C受體1或其編 碼序列的核糖體定位序列。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述核糖體定位序列為R36/K38。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中,所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子 宮頸癌、肺癌(優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌)、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌,優(yōu)選肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和 非小細(xì)胞肺癌,更優(yōu)選肝癌。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中,所述腫瘤治療所采用的治療劑選自烷化劑、抗代 謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述治療劑選自白消安、順氯氨鉬、環(huán)磷酰胺、氮烯咪胺、異環(huán) 磷酰胺、鹽酸氮芥/苯丙氨酸氮芥、5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、博來霉素、更 生霉素、紅必霉素、阿霉素、黃膽素、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、三尖杉酯堿、足葉乙甙、門冬酰胺酶、 維甲酸、強(qiáng)的松、氟美松、雌激素、抗雌激素、黃體酮和男性激素。在另一個(gè)優(yōu)選例中,所述治療劑優(yōu)選為抗腫瘤抗生素,優(yōu)選阿霉素。在本發(fā)明的第二方面中,提供了一種藥物組合物,所述藥物組合物包含(i)活化蛋白激酶C受體1的抑制劑或活化蛋白激酶C的抑制劑;(ii)腫瘤治療劑;(iii)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述腫瘤治療劑是化療劑。在本發(fā)明的第三方面中,提供了一種藥盒,所述藥盒包含(A)容納有活化蛋白激酶C受體1的抑制劑和/或活化蛋白激酶C的抑制劑的容 器;(B)容納腫瘤治療劑的容器;和(C)使用說明書。在一個(gè)優(yōu)選例中,本發(fā)明的藥物組合物或藥盒中所包含的抑制劑選自抗活化蛋 白激酶C受體1的抗體、針對(duì)活化蛋白激酶C受體1編碼序列的RNA干擾分子或反義寡核 苷酸、活化蛋白激酶C的抑制劑如PKCi3 II的抑制劑CGP-53353或者經(jīng)典PKC的抑制劑 Go6976)、針對(duì)活化蛋白激酶C編碼序列的RNA干擾分子或反義寡核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選例中,本發(fā)明的藥物組合物或藥盒中所包含的抑制劑為選自下組的
      4RNA干擾分子shRNA、siRNA、miRNA或dsRNA,優(yōu)選為shRNA或siRNA,更優(yōu)選序列為針對(duì) RACKl 的 19 個(gè)堿基序列CTGACCAGGGATGAGACCA。在另一個(gè)優(yōu)選例中,所述抑制劑作用于活化蛋白激酶C、活化蛋白激酶C受體1或 其編碼序列的核糖體定位序列,優(yōu)選所述核糖體定位序列為R36/K38。在另一個(gè)優(yōu)選例中,所述活化蛋白激酶C受體1的抑制劑是shRNA,所述腫 瘤治療劑是阿霉素,兩者在腫瘤治療中具有協(xié)同作用,更優(yōu)選所述shRNA的序列為 CTGACCAGGGATGAGACCA。在另一個(gè)優(yōu)選例中,所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子宮頸癌、肺癌、 胰腺癌、胃癌、或膀胱癌,優(yōu)選肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子宮頸癌或非小細(xì)胞肺癌,更 優(yōu)選肝癌。在另一個(gè)優(yōu)選例中,所述治療劑選自烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗 癌藥、激素、或免疫制劑,優(yōu)選白消安、順氯氨鉬、環(huán)磷酰胺、氮烯咪胺、異環(huán)磷酰胺、鹽酸氮 芥/苯丙氨酸氮芥、5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、博來霉素、更生霉素、紅必 霉素、阿霉素、黃膽素、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、三尖杉酯堿、足葉乙甙、門冬酰胺酶、維甲酸、強(qiáng)的 松、氟美松、雌激素、抗雌激素、黃體酮和男性激素,更優(yōu)選阿霉素。在本發(fā)明的第四方面中,提供了一種篩選抗耐藥的腫瘤治療藥物的方法,所述方 法包括(a)提供表達(dá)活化蛋白激酶C受體1及其配體的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng) 物;(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物接觸,作 為給藥組;(C)檢測(cè)給藥組中活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達(dá)水平,并與未給予候選藥 物的對(duì)照腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物的活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達(dá)水 平進(jìn)行比較;如果檢測(cè)結(jié)果顯示,給藥組的活化蛋白激酶C受體1和/或其配體的表達(dá)水平顯 著低于對(duì)照組,則表明該候選藥物是抗耐藥的腫瘤治療藥物。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述方法用于篩選不會(huì)對(duì)患有腫瘤的個(gè)體產(chǎn)生腫瘤治療耐藥性 的腫瘤治療藥物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,所述活化蛋白激酶C受體1的配體是PKCii II。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


      圖1 :RACK1在各正常組織及腫瘤細(xì)胞系中蛋白表達(dá)情況。圖Ia 成年小鼠不同組織中RACKl的表達(dá)情況,GAPDH作為內(nèi)參;圖Ib 人腫瘤細(xì)胞系中RACKl的表達(dá)情況,GAPDH作為內(nèi)參。圖2 =RACKl在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)。圖2a =RACKl在肝細(xì)胞系(L02和Chang)和肝癌細(xì)胞系(Huh7、!fepG2和H印3B)中 表達(dá)情況,GAPDH作為內(nèi)參;
      圖2b =RACKl在癌組織⑴與癌旁組織(N)中的蛋白表達(dá)情況,GAPDH作為內(nèi)參;圖2c =RACKl在原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織中的mRNA表達(dá)情況,β -肌動(dòng)蛋白作為 內(nèi)參;圖2d =RACKl在不同 Μ分期的原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織中表達(dá)情況,GAPDH作為 內(nèi)參;圖2e 免疫組化檢測(cè)RACKl在原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織中表達(dá)情況。圖3 體外驗(yàn)證核糖體定位的RACKl促進(jìn)肝癌化療抵抗。圖3a 肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)RACKl增強(qiáng)細(xì)胞阿霉素治療抵抗。轉(zhuǎn)染空載體或野生 型 RACK124h 后,用阿霉素分別處理 IfepG2(100ug/ml)、Huh7 (20ug/ml)和 H印3B (50ug/ml)。 膜聯(lián)蛋白AKArmexin V)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。圖3b 抑制肝癌細(xì)胞中RACKl表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生阿霉素誘導(dǎo)的凋亡。轉(zhuǎn)染空載 體或 shRACK172h 后,用阿霉素分別處理 HepG2 (100ug/ml)、Huh7 (20ug/ml)和 Hep3B(50ug/ ml) 24h,再檢測(cè)細(xì)胞凋亡。圖3c =RACKl定位至核糖體是其促進(jìn)腫瘤耐藥所必須的。瞬轉(zhuǎn)野生型RACKl或其 突變體24h后再用阿霉素處理細(xì)胞24h,膜聯(lián)蛋白V染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。圖3d =RACKl的DE突變體使Huh7細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。在Huh7細(xì) 胞中瞬轉(zhuǎn)不同濃度的野生型RACKl或其DE突變體。24h后再用阿霉素處理細(xì)胞24h,膜聯(lián) 蛋白V染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。圖3e 在RACKl耗竭的肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型RACKl能夠使得肝癌細(xì)胞獲得耐藥 性,而DE突變體則不可。在表達(dá)shRACKl的H印G2、Huh7和H印3B細(xì)胞系中進(jìn)一步轉(zhuǎn)染空 載體、野生型RACKl或DE突變體,24h后再用阿霉素處理細(xì)胞24h,膜聯(lián)蛋白V染色檢測(cè)細(xì) 胞凋亡。圖4 體外驗(yàn)證核糖體定位的RACKl促進(jìn)肝癌化療抵抗。圖4a_b 阿霉素協(xié)同RACKl耗竭在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。Huh7細(xì)胞裸鼠皮下成瘤, 2周后將攜帶shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和阿霉素進(jìn)行瘤內(nèi)注射。圖4a 在不同時(shí)間點(diǎn)觀察的腫瘤體積(mm3);圖4b 最后一天處死小鼠后觀察的小鼠腫瘤重量(g);圖4c_f 核糖體定位的RACKl促進(jìn)腫瘤化療抵抗。將分別穩(wěn)轉(zhuǎn)空載體、野生型 RACKl或DE突變體的Huh7細(xì)胞裸鼠皮下成瘤,2周后瘤內(nèi)注射阿霉素。圖4c 在不同時(shí)間點(diǎn)觀察腫瘤體積(mm3);圖4d 最后一天處死后觀察小鼠腫瘤重量(g);圖4e =TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA片段;圖4f TUNEL染色量化柱狀圖。
      具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過長(zhǎng)期而深入的研究發(fā)現(xiàn)RACK1在腫瘤組織中高表達(dá),并通過體內(nèi)、 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 RACKl是腫瘤發(fā)生化療抵抗的關(guān)鍵分子。過表達(dá)的RACKl可優(yōu)先啟動(dòng)一系 列抗凋亡蛋白的翻譯,抑制細(xì)胞凋亡,引起腫瘤耐藥。采用諸如RNA干擾的方法下調(diào)RACKl 表達(dá),或轉(zhuǎn)染不能定位于核糖體的RACKl突變體,可降低或消除腫瘤的耐藥性。在此基礎(chǔ)上,本發(fā)明人完成了本發(fā)明?;罨鞍准っ窩、其警體1及它們的抑制劑如本文所用,術(shù)語“RACK1 ”、“活化蛋白激酶C受體1 ”可互換使用,均是指可與PKC 特異性結(jié)合,且具有SEQ ID NO :2所示序列或其同源序列的蛋白質(zhì)或其活性片段。它們的 表達(dá)受到抑制后,可改善腫瘤治療中的藥物耐藥性。該定義中也包括所述蛋白質(zhì)或多肽的 保守性變異多肽、或其同源多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,所述活化蛋白激酶C受體1 來自人或其它真核生物,例如小鼠、大鼠、?;蚝锏龋宜鼈冎g具有高度的保守性。如本文所用,術(shù)語“活化蛋白激酶C”或“RACK1配體”可互換使用,均是指可被 RACKl所結(jié)合的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,所述活化蛋白激酶C來自人或其 它真核生物,例如小鼠、大鼠、?;蚝锏?,且它們之間具有高度的保守性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方式中,所述RACKl配體是蛋白激酶C的亞型,例如PKCii II。如本文所用,術(shù)語“核糖體定位序列”是指RACKl與核糖體40S小亞基結(jié)合的序列 或者關(guān)鍵位點(diǎn)。在SEQ ID NO :1所示的序列中,其核糖體定位序列為RACKl編碼序列的第 106-108和112-114位堿基,其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中的R36/K38。因此, 本發(fā)明抑制劑所優(yōu)選針對(duì)的核糖體定位序列為R36/K38。本發(fā)明中首次揭示了 RACKl是一種腫瘤耐藥相關(guān)蛋白,其在腫瘤組織中異常高表 達(dá),優(yōu)先啟動(dòng)一系列抗凋亡蛋白的翻譯,抑制細(xì)胞凋亡,引起腫瘤耐藥。基于本發(fā)明的上述發(fā)現(xiàn),本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可將RACKl或其配體PKC(優(yōu)選 RACKl的核糖體結(jié)合位點(diǎn))作為靶點(diǎn),設(shè)計(jì)或篩選抗耐藥的腫瘤藥物。例如,本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員可根據(jù)已知的RACKl或其配體的序列設(shè)計(jì)或篩選出RACKl的抑制劑,將其與化療藥 物共同給予腫瘤患者,從而改善腫瘤對(duì)治療藥物的耐藥性、提高腫瘤治療的成功率、減少腫 瘤治療藥物的用量、以及減輕患者的痛苦?;罨鞍准っ窩或RACKl的抑制劑包括但不限于抗RACKl的抗體、針對(duì)RACKl編 碼序列的RNA干擾分子或反義寡核苷酸、活化蛋白激酶C的抑制劑(如PKCiiII的抑制劑 CGP-53353或者經(jīng)典PKC的抑制劑Go6976)、針對(duì)活化蛋白激酶C編碼序列的RNA干擾分子 或反義寡核苷酸,優(yōu)選選自下組的RNA干擾分子shRNA、siRNA,miRNA或dsRNA。例如本發(fā) 明實(shí)施例中所提供針對(duì)RACKl的19個(gè)堿基序列CTGACCAGGGATGAGACCA。更優(yōu)選,所述抑制 劑作用于RACKl的核糖體定位序列(為RACKl序列的第106-108和112-114堿基,即氨基 酸序列中R36和K38)。本發(fā)明的抑制劑包括對(duì)RACKl或其活性片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆 抗體,尤其是單克隆抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,而且還包括具有免 疫活性的抗體片段,如Fab'或(Fab)2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv 分子(Ladner等人,美國(guó)專利No. 4,946,778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍 保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如,可將 純化的RACKl蛋白或者其具有抗原性的片段施用于動(dòng)物(如家兔,小鼠,大鼠等)以誘導(dǎo) 多克隆抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交 瘤技術(shù)來制備(見 Kohler 等人,Nature 256 ;495,1975 ;Kohler 等人,Eur. J. Immunol. 6 511,1976 ;Kohler 等人,Eur. J. Immunol. 6 -.292,1976 ;Hammer ling 等人,In Monoclonal
      7Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N. Y.,1981)。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反 應(yīng),包括但不限于弗氏佐劑等。就siRNA而言,隨著SiRNA研究的深入,已有公司可商業(yè)化提供siRNA的 設(shè)計(jì)和合成服務(wù)。如QIAGEN提供siRNA設(shè)計(jì)合成一體化服務(wù)“4-for Silencing siRNAduplexes”(QIAGEN News, 2003 年 9 月第 3 期第 55-56 頁(yè),可從 Qiagen 公司網(wǎng)站上找 至丨J并下載該新聞 http://wwwl. qiagen. com/1 iterature/qiagennews/0303/ 1024467_low. pdf)針對(duì)客戶給出的一個(gè)基因序列,由QIAGEN的專家設(shè)計(jì)并合成4對(duì)siRNA,HPP純度,保 證其中至少一對(duì)siRNA的抑制效率達(dá)到70%以上,如果達(dá)不到,免費(fèi)為客戶另行設(shè)計(jì)合成 另外4對(duì)siRNA。顯然,通過上述的商業(yè)途徑和服務(wù),本領(lǐng)域研究人員只需提供靶基因序列,就可以 獲得高質(zhì)量的siRNA。此外,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可采用本領(lǐng)域中已知的方法和軟件來自行設(shè)計(jì)和篩 選 siRNA。例如,Status of siRNA Design Software (siRNA 設(shè)計(jì)軟件現(xiàn)狀,http //i. cs. hk/ sirna/software/status. php)中列舉了用于siRNA設(shè)計(jì)的多種軟件及其特點(diǎn)。因此,只要本領(lǐng)域普通技術(shù)人員獲知了靶基因RACKl的序列,他們就可以通過商 業(yè)途徑很容易地獲得針對(duì)該靶基因的小分子干擾RNA,也可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的原理,采 用已知的軟件和方法來獲得具有抑制作用的小分子干擾RNA。根據(jù)本領(lǐng)域中的常識(shí),“反義寡核苷酸”是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)針對(duì)特定靶序列 的反義核酸,從而可用于抑制特定基因的表達(dá),其包括反義RNA、反義DNA及核酶,它們通過 人工合成和生物合成獲得。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過計(jì)算機(jī)模擬和人工智能等技術(shù)(例 如計(jì)算機(jī)模擬RNA次級(jí)結(jié)構(gòu)、反義寡核苷酸與RNA雜交后的事件分子等),由已知的蛋白質(zhì) 或基因序列獲知其空間結(jié)構(gòu),確定其“可接近部位”,在結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)成功設(shè)計(jì)出針對(duì)性的 反義寡核苷酸。這些設(shè)計(jì)方法可參見例如,袁守軍等,反義藥物設(shè)計(jì)方法研究進(jìn)展(解放軍藥學(xué) 學(xué)報(bào),第20卷第2期ppl26-129),其中綜述了確定mRNA “可接近部位”和設(shè)計(jì)反義寡核 苷酸的各種常用技術(shù)和手段,通過這些現(xiàn)有技術(shù)可使得反義寡核苷酸設(shè)計(jì)的命中率顯著提 高,甚至可達(dá)到高于92%。藥物組合物和藥盒本發(fā)明提供了一種藥物組合物,它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的 0. 00001-20wt% ;更佳的,0. OOOl-IOwt % )的所述RACKl抑制劑,以及藥學(xué)上可接受的載 體。本發(fā)明的藥物組合物可用于通過抑制RACKl的表達(dá)和/或與核糖體的結(jié)合,改善腫瘤 耐藥性,提高腫瘤治療藥物在腫瘤治療中的有效性。如本文所用,“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的,即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上 可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體,包括各種賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的藥物組合物中藥學(xué)上可接受的載體,包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配,本發(fā)明的藥物組合 物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法 進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?;钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本
      8發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明藥物組合物中抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程 度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如 通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于本發(fā)明抑制劑配合使用的腫瘤治療劑的種類 和用量;抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等;患者所要治療的疾病 的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如,由治療狀況的迫切要求, 可每天給予若干次分開的劑量,或?qū)┝堪幢壤販p少。本發(fā)明藥物組合物的給藥方式?jīng)]有特別的限制,可以是全身的或局部的。優(yōu)選的, 本發(fā)明的藥物組合物可通過靜脈注射的方式給予對(duì)象。當(dāng)所述抑制劑為RNA或寡核苷酸 時(shí),也可采用基因治療的手段進(jìn)行給藥,比如可直接將抑制劑通過諸如注射等方法給藥于 受試者;或者,可通過一定的途徑將攜帶蛋白質(zhì)或多肽類抑制劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載 體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上,并使之表達(dá)活性抑制劑蛋白??蓪⒛[瘤治療藥物與本發(fā)明的抑制劑配制在同一藥物組合物中,或以單獨(dú)的形式 提供于藥盒中。優(yōu)選腫瘤治療藥物與本發(fā)明的抑制劑在聯(lián)合使用時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同效果,例如 針對(duì)RACKl的shRNA與阿霉素的聯(lián)合使用可對(duì)肝癌治療產(chǎn)生協(xié)同作用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員可根據(jù)本發(fā)明中的常規(guī)手段(例如參考本發(fā)明實(shí)施例中所揭示的方法)對(duì)這些組合進(jìn)行 蹄選。篩詵抗耐藥的腫瘤治療藥物的方法本發(fā)明中還提供了一種以RACKl為靶點(diǎn),篩選抗耐藥的腫瘤治療藥物(例如腫瘤 治療藥物)的方法,所述方法包括(a)提供表達(dá)活化蛋白激酶C受體1的腫瘤細(xì)胞系、腫 瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物;(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤 動(dòng)物接觸,作為給藥組;(c)檢測(cè)給藥組中活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達(dá)水平,并 與未給予候選藥物的對(duì)照腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物的活化蛋白激酶C受體1及 其配體的表達(dá)水平進(jìn)行比較;如果檢測(cè)結(jié)果顯示,給藥組的活化蛋白激酶C受體1和/或其 配體的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組,則表明該候選藥物是抗耐藥的腫瘤治療藥物。本發(fā)明的方法可用于從化合物庫(kù)中篩選出針對(duì)腫瘤的非耐藥性抗腫瘤藥物,可作 為化合物篩選評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。本發(fā)明的方法也可用于臨床中對(duì)腫瘤患者的個(gè)性化治 療的預(yù)測(cè)和診斷中,篩選出針對(duì)個(gè)體具有最佳腫瘤治療效果的抗腫瘤藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下(1)揭示了 RACKl與腫瘤耐藥性之間的關(guān)系,為設(shè)計(jì)和篩選耐藥腫瘤藥物提供了 新的途徑和靶點(diǎn);(2)提供了通過抑制RACKl及其相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來提高腫瘤對(duì)腫瘤治療的敏感 性的新方法,從而起到了提高腫瘤治療效果、減少腫瘤治療劑用量、緩解患者痛苦的積極作 用,具有臨床的實(shí)用性。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York =Cold SpringHarbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和
      份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1. RACKl在正常小鼠組織和人腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)為了研究RACKl在不同組織器官中的表達(dá)差異,發(fā)明人首先通過蛋白質(zhì)印跡法 (western blot)檢測(cè)了 RACKl在正常小鼠各種組織中的表達(dá)情況。所用材料和方法如下所 述動(dòng)物健康BALB/c小鼠,雄性,4_6周齡,購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。RIPA組織裂解液50mM Tris HCl, pH 7. 5,150mM NaCl,0. 1% Nonidet P_40,5mM EDTA, 5mM EGTA, 15mM MgCl2,60mM β-磷酸甘油,0. ImM 原釩酸鈉,0. ImM NaF, 0. ImM 苯甲酰胺,10 μ g/ml 抑 肽酶,10 μ g/ml 亮肽素,ImM PMSF實(shí)驗(yàn)方法稱量0. 5g組織,加入Iml RIPA組織裂解液,冰浴下玻璃勻漿器充分勻漿。勻漿結(jié) 束后100°C煮沸10 15min,離心取上清。蛋白定量,蛋白質(zhì)印跡法(參考《分子克隆》)檢 測(cè)蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖Ia所示。該結(jié)果顯示RACK1的蛋白水平在正常動(dòng)物的肝臟、胰臟、睪丸、 乳腺、肺、直腸和腎臟等組織中較高,在這些組織中,RACKl在肝臟中的表達(dá)水平最高。發(fā)明人接下來檢測(cè)了 RACKl在不同組織來源的腫瘤細(xì)胞系(各細(xì)胞系均購(gòu)自中 科院細(xì)胞所)中的表達(dá)情況,這些細(xì)胞系包括乳腺癌細(xì)胞系MB-MDA-231、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和肝癌細(xì)胞系(Huh7、!fep3B和H印G2)。2 X SDS細(xì)胞裂解液Tris 1. 9376g, NaCl 3. 5064g, EDTA 0. 1169g, SDS 4g,加ddH20定容至200ml,用HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4,常溫保存?zhèn)溆谩X SDS細(xì)胞裂解液50% 2XSDS細(xì)胞裂解液,5% β-巰基乙醇(Fluka),2 %完全蛋白酶抑制劑(Roche),2% PhosSTOP 磷酸酶抑制劑(Roche)41% ddH20 定容,_20°C保存?zhèn)溆谩T囼?yàn)方法將培養(yǎng)細(xì)胞用Iml PBS (pH = 7. 4)沖洗三次,再加入Iml PBS,用細(xì)胞刮刀刮下細(xì) 胞,收集細(xì)胞懸液于1. 5ml Eppendorf管中;4°C 4000rpm離心5min,盡棄上清,加入適量體 積的IXSDS細(xì)胞裂解液,吹打均勻;100°C煮沸10-20min,離心取上清。蛋白定量,蛋白質(zhì) 印跡法(參考《分子克隆》)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。
      試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖Ib所示。由該結(jié)果可知RACK1在各腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),其中在肝癌 細(xì)胞株(Huh7、!fep3B*!fepG2)中普遍高表達(dá),在乳腺癌細(xì)胞系MB-MDA-231、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中也高表達(dá)。實(shí)施例2. RACKl在肝癌中表達(dá)的普遍上調(diào)發(fā)明人首先采用蛋白質(zhì)印跡法(方法同實(shí)施例1),檢測(cè)了 RACKl在肝細(xì)胞系(L02 和Chang,購(gòu)自中科院細(xì)胞所)和肝癌細(xì)胞系(Huh7、!fepG2和H印3B,同實(shí)施例1)中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2a所示。該結(jié)果表明,RACKl在肝癌細(xì)胞系(Huh7、HepG2和H印3B)的 表達(dá)水平明顯高于其在正常肝細(xì)胞系(L02和Chang)中的表達(dá)。同時(shí),發(fā)明人還通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)了 RACKl在原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織及其對(duì) 應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況。組織來源和患者情況6對(duì)原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織,來源于南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。檢測(cè)方法同實(shí)施例1中健康小鼠組織裂解和檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖2b所示。該結(jié)果表明,RACKl在腫瘤組織中的表達(dá)較其對(duì)應(yīng)的癌旁組織 有明顯的上調(diào)。發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)腫瘤組織中的RACKl的mRNA水平。組織來源和患者情況34對(duì)原發(fā)性肝癌病人腫瘤(HCC)組織,獲自南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。檢測(cè)方法1.組織RNA抽提使用Trizol試劑(Invitrogen公司),按照Invitrogen公司RNA抽提方法進(jìn)行操作。2. RNA 逆轉(zhuǎn)錄使用RNA PCR 試劑盒(AMV) Ver. 3. O (Takara Biotechnology,中國(guó)大連),按照 Takara公司該試劑盒說明書進(jìn)行操作。3.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)使用 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche AppliedScience,德國(guó)曼海姆)實(shí)時(shí)PCR,按照Roche公司該試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果分析實(shí)時(shí)PCR 的結(jié)果用 LightCycIer 軟件 3. 5 版(Roche Applied Science,德國(guó)曼海 姆)軟件進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果如圖2c和圖2d所示。圖2c的數(shù)據(jù)表明RACK1的mRNA水平也在絕大多數(shù)腫瘤組織中上調(diào)。并且,如圖2d所示,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示隨著 Μ分期(惡性腫瘤國(guó)際臨床病期分類)的提升,RACKl的表達(dá)水平也呈現(xiàn)明顯增高的趨勢(shì)。為了進(jìn)一步研究RACKl是否參與了肝癌發(fā)展的過程,發(fā)明人利用免疫組織化學(xué)的 方法檢測(cè)了 RACKl在162例原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織中的表達(dá)情況。組織來源和患者情況162例原發(fā)性肝癌病人腫瘤組織,獲自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院。檢測(cè)方法1.石蠟切片免疫組化切片和烤片石蠟包埋組織5μπι連續(xù)切片,貼于APES處理過的載玻片上, 600C (于電熱恒溫干燥箱內(nèi),下同)烤片6 8h。脫蠟、水化組織切片二甲苯15minX3次(60°C )—無水乙醇10minX2次一95% 乙醇5minX2次一80%乙醇5min — 70%乙醇5min —自來水沖洗片刻一ddH20作用5min。 PBS 沖洗 3minX3 次。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶31^H2O2-甲醇37°C (于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),下同)孵育40min, PBS 沖洗 3minX3 次。抗原修復(fù)高壓鍋內(nèi)加適量水置電爐上煮沸,將切片浸入裝有0. OlM檸檬酸緩沖 液(pH 6.0)的燒杯中,放入高壓鍋內(nèi),加熱至噴氣,維持3min。取出切片使其自然冷卻至室 溫,PBS沖洗3minX3次。封閉擦去多余水分,滴加封閉血清,室溫孵育2h,不洗。甩去切片上的血清,滴加一抗,室溫孵育Ih后4°C過夜。使用一抗同型IgG作為陰 性對(duì)照。PBS沖洗3minX3次。擦去多余水分,滴加Polymer Helper,37°C孵育20min。PBS 沖洗3minX3次。擦去多余水分,HRP標(biāo)記的二抗,37°C孵育30min。PBS沖洗3minX 3次。顯色將切片浸入DAB工作液中2 5min,同時(shí)在顯微鏡下觀察控制顯色程度,待 出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),則置流水下沖洗及時(shí)終止反應(yīng)。襯染蘇木素復(fù)染30s 2min,流水沖洗,鹽酸-乙醇分化,流水沖洗。脫水70%乙醇3min — 80%乙醇3min — 95%乙醇5min —無水乙醇5min —二甲 苯 8minX2 次。封片中性樹脂封固。一抗所用到抗RACKl抗體和同型對(duì)照IgG均購(gòu)自BD公司;熒光二抗購(gòu)于Santa Cruz公司ο試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖2e所示。該結(jié)果顯示RACK1在肝癌中的表達(dá)普遍上調(diào)。由此表明RACK1 參與了肝癌發(fā)生和發(fā)展的過程。實(shí)施例3.核糖體定位的RACKl在體外參與了肝癌細(xì)胞系的化療抵抗發(fā)明人首先在肝癌細(xì)胞系H印G2、Huh7和H印3B中轉(zhuǎn)染了野生型RACKl的真 核表達(dá)載體(真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA-HA-RACKl 由 Jean-Luc Parent 博士(Universit6de Sherbrooke,Canada)饋贈(zèng)(也可購(gòu)買商品化的RACKl cDNA序列,例如購(gòu)自Invitrogen公 司或Proteintech公司或從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增RACKl cDNA序列,然后經(jīng)本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn) 方法構(gòu)建所述真核表達(dá)載體)。質(zhì)粒由LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染),并使用阿霉素0fepG2
      12100ug/ml, Huh7 20ug/ml, H印3B 50ug/ml ;分別處理24和48小時(shí))誘導(dǎo)三種肝癌細(xì)胞系
      的凋亡。采用膜聯(lián)蛋白V染色檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡情況將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液(IOmM HEPES/NaOH, pH 7.4 ; 140mM NaCl, 2. 5mM CaCl2),在含有約 IO5 個(gè)細(xì)胞的 195 μ 1 細(xì)胞懸液 中加入5 μ 1膜聯(lián)蛋白-V-FITC染色液,均勻混合,閉光孵育IOmin ;500g離心5分鐘,收集 細(xì)胞,PBS洗滌兩次后重懸于190 μ 1結(jié)合緩沖液,加入10 μ 1的20 μ g/ml PI染液,混合均 勻后用FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè))。試驗(yàn)結(jié)果如圖3a所示。該結(jié)果表明,過表達(dá)RACKl增強(qiáng)了這三種肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉 素的化療抵抗效果。發(fā)明人接下來使用短發(fā)夾RNA (shRNA,針對(duì) CTGACCAGGGATGAGACCA (SEQ ID NO 3) 序列設(shè)計(jì)引物如下正義引物5 ‘ -gatccccCTGACCAGGGATGAGACCAttcaagagaTGGTCTCATCCCTGGTCAGttttggaaa-3 ‘(SEQ ID NO 4)反義引物5 ‘ -agcttttccaaaaACTGACCAGGGATGAGACCAtctcttgaaTGGTCTCATCCCTGGTCAGggg-3' (SEQ ID NO:5)正、反向引物褪火,插入pSUPER-retro/neo-shRNA載體的BamHI/Hindlll酶切位 點(diǎn),構(gòu)建pSUPER-shRACKl質(zhì)粒來抑制RACKl的表達(dá)(pSUPER-shRACKl質(zhì)粒及載體對(duì)照由 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染,72小時(shí)后再分別采用阿霉素處理24小 時(shí)(處理?xiàng)l件同前),抑制RACKl蛋白表達(dá)的效果由蛋白免疫印跡檢測(cè)(同前)),并觀察其 對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的影響。結(jié)果如圖3b所示。結(jié)果表明,使用了特異性針對(duì)RACKl的shRNA下調(diào)RACKl的蛋白水平后,肝癌細(xì)胞 對(duì)阿霉素誘導(dǎo)凋亡的敏感性明顯增強(qiáng)。以上這些數(shù)據(jù)表明,RACKl在體外參與了肝癌細(xì)胞系的化療抵抗。發(fā)明人根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建了多個(gè)RACKl的功能缺陷突變體,包括Y302F(i3 1 整合素結(jié)合缺陷,J Biol Chem 2008 ;283 :22952_22961.)、Y52F(FAK 活化缺陷,J Biol Chem 2009 ;284 :20263-20274.)、Y228F/Y246F(Src 活化缺陷,MolCell Biol 2004 ; 24 6788-6798.)和 R36D/K38E(DE 突變體,核糖體定位缺陷,Nat CellBiol 2008 ;10 1324-1332.)。發(fā)明人將野生型RACKl以及這四種突變體轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中,并檢測(cè)了其 對(duì)Huh7對(duì)化療(阿霉素20ug/ml)敏感性的影響。結(jié)果如圖3c。結(jié)果顯示,Y302F、Y52F和Y228F/Y246F仍然有效的發(fā)揮了抗凋亡的 功能,而DE突變體卻促進(jìn)了阿霉素誘導(dǎo)的Huh7細(xì)胞的凋亡。為了進(jìn)一步研究DE突變體促凋亡的效果,發(fā)明人在不同肝癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了不 同劑量(0、l、2、4yg質(zhì)粒)的野生型RACKl或者DE突變體真核表達(dá)載體(方法同前)。結(jié)果如圖3d所示。結(jié)果表明,DE突變體呈劑量依賴性的促進(jìn)了 Huh7細(xì)胞的凋亡。接下來發(fā)明人使用拯救實(shí)驗(yàn)觀察RACKl的核糖體定位對(duì)肝癌細(xì)胞化療抵抗的影 響。
      首先,在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pSUPER-shRACKl質(zhì)粒,抑制RACKl表達(dá)(同前),并構(gòu)建 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;然后,在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)染野生型RACKl或者DE突變體。結(jié)果如圖3e所示。該結(jié)果表明抑制RACKl表達(dá)水平后,肝癌細(xì)胞顯示出對(duì)肝癌 化療的敏感性,而進(jìn)一步轉(zhuǎn)染野生型RACKl有效的恢復(fù)了肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的化療抵抗, 而進(jìn)一步轉(zhuǎn)染DE突變體則沒有明顯的影響。這些數(shù)據(jù)表明,RACKl的核糖體定位對(duì)于RACKl發(fā)揮抗凋亡的功能是必須的。實(shí)施例4.核糖體定位的RACKl在體內(nèi)參與了肝癌的化療抵抗發(fā)明人接下來利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 RACKl在體內(nèi)是否發(fā)揮了化療抵抗的功 能。發(fā)明人首先使用Huh7細(xì)胞進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn),并通過瘤內(nèi)注射shRNA和/或阿霉素(20ug/ kg,一周兩次)來觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響(對(duì)腫瘤體積和重量的影響)。具體方法如下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)處理5周齡雄性胸腺缺失裸鼠(Foxnrwnu, BALB/c背景)購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中 國(guó)科學(xué)院,中國(guó)上海),飼養(yǎng)于恒溫恒濕無菌SPF (Specific Pathogen-Free)級(jí)動(dòng)物房,實(shí) 驗(yàn)操作遵循文獻(xiàn)(〃 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals",《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 喂養(yǎng)和使用指南》,國(guó)家科學(xué)院(NIH出版86-23修訂1985)來進(jìn)行。1.按照對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只裸鼠,每只裸鼠左右脅腹部皮下各注射IX IO7個(gè) 細(xì)胞;2.在注射腫瘤細(xì)胞成瘤2周或3周后,通過瘤內(nèi)注射shRNA和/或阿霉素(20ug/ kg)來觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響,每周2次;3.定時(shí)觀察并測(cè)量所形成腫瘤的大小,腫瘤大小按照如下公式計(jì)算腫瘤體積=(LXW2)/2其中,L是指腫瘤最寬徑,W是指與L相垂直的最大徑;4.實(shí)驗(yàn)終止當(dāng)日,處死裸鼠并取腫瘤秤重;部分實(shí)驗(yàn)中,腫瘤固定后用于TUNEL實(shí) 驗(yàn)檢測(cè)凋亡DNA片斷。TUNEL實(shí)驗(yàn)方法如下(1) PBS浸洗腫瘤組織5min ;(2)置于4%多聚甲醛溶液的PBS溶液中固定15min ;(3) PBS 浸洗二次,每次 5min ;(3)將載玻片取出,置于水平表面上,用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體,滴加 100 μ L新配制的蛋白酶K工作溶液覆蓋在樣本區(qū)域上,室溫下放置30min ;(4) PBS 浸洗二次,每次 5min ;(5)制備TUNEL反應(yīng)混合液(購(gòu)自Roche公司),用50 μ 1 TdT與450 μ 1熒光素 標(biāo)記的dUTP液(購(gòu)自Roche公司)混勻;(6)玻片干后,加50 μ 1 TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒 中反應(yīng)37°C反應(yīng)Ih;(7) PBS 漂洗 3 次;(8)加50 μ 1 5 μ g/ml DAPI反應(yīng)液于標(biāo)本上,室溫反應(yīng)5min ;(9) PBS 漂洗 3 次;(10)熒光顯微鏡下拍照,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。
      14
      采用如下公式計(jì)算腫瘤的抑制率
      抑制率% =細(xì)月中麵只一冶細(xì)中麵只x 100%
      對(duì)照組腫瘤體積采用金式公式判斷聯(lián)合使用RACKl的shRNA與阿霉素(Dox)對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)是否 具有協(xié)同效果(參考文獻(xiàn)金正均,合并用藥中的相加。中國(guó)藥理學(xué)報(bào)1980 ;1 70-76)q 值=Ea+b/ (Ea+Eb-Ea X Eb),其中,Ea、Eb和Ea+b分別代表A藥物單獨(dú)、B藥物單獨(dú)和它們組合使用時(shí)所產(chǎn)生的 不同治療效果。當(dāng)計(jì)算所得的9值> 1. 15時(shí),表明兩藥有協(xié)同作用。試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖4a和圖4b所示,單獨(dú)使用shRNA抑制RACKl的表達(dá),或者使用阿霉素 (Dox)均可以不同程度的抑制腫瘤的生長(zhǎng);將兩者聯(lián)合使用則對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的 協(xié)同效應(yīng)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示未使用任何治療方法時(shí),腫瘤體積為3200mm3 ;使用阿霉素治療 后,腫瘤直徑為2500mm3,其抑制率為21.875 % ;使用RACKl的shRNA治療,腫瘤直徑為 1300mm3,抑瘤率為59. 375% ;同時(shí)使用阿霉素和shRNA治療,腫瘤直徑為7500mm3,抑瘤率為 76. 5625% ο由此,聯(lián)合使用RACKl的shRNA與阿霉素的q值可計(jì)算如下q 值=76. 5625% /[21. 875% +(1-59. 375% )*21· 875% ] = 2. 49 > 1. 15該結(jié)果證明了 RACK1的shRNA與阿霉素的聯(lián)用具有較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)野生型RACK1、DE突變體和相應(yīng)空載的Huh7細(xì)胞株 (使用 LipofectAMINE 2000 將 pcDNA3. 1 空載體、pcDNA3. I-RACKlwt 和 pcDNA3. 1-RACK1DE 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染24h后,加入終濃度為800ug/ml的G418篩選2周。然后 在挑取單克隆細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng),并通過免疫印跡分析選取陽(yáng)性的Huh7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系),然 后利用這三種細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下腫瘤移植實(shí)驗(yàn)(方法同上)去驗(yàn)證其成瘤性的差異。在成瘤2周后,發(fā)明人通過瘤內(nèi)注射阿霉素(20ug/ml,注射量2mg/kg)來觀察在體 內(nèi)RACKl的核糖體定位對(duì)化療敏感性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4c_e所示。結(jié)果顯示,野生型RACKl在體內(nèi)明顯促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng);而DE突變體對(duì)腫瘤生長(zhǎng) 則沒有明顯的影響。相比較對(duì)照組(P < 0. 05),阿霉素并不能明顯抑制過表達(dá)野生型RACKl 的腫瘤生長(zhǎng)(P = 0. 8),而卻顯著抑制了過表達(dá)DE突變體的腫瘤生長(zhǎng)(ρ < 0. 001)。利用TUNEL實(shí)驗(yàn)(同上)檢測(cè)凋亡DNA片斷證實(shí),過表達(dá)野生型RACKl明顯促進(jìn) 了腫瘤對(duì)阿霉素的化療抵抗,而過表達(dá)DE突變體則增強(qiáng)了腫瘤對(duì)阿霉素的敏感性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
      1權(quán)利要求
      活化蛋白激酶C的抑制劑或活化蛋白激酶C受體1的抑制劑在制備降低或消除腫瘤治療中的耐藥性的藥物中的用途。
      2.如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述抑制劑選自抗活化蛋白激酶C或抗活 化蛋白激酶C受體1的抗體、針對(duì)活化蛋白激酶C或活化蛋白激酶C受體1編碼序列的RNA 干擾分子或反義寡核苷酸。
      3.如權(quán)利要求2所述的用途,其特征在于,所述抑制劑是選自下組的RNA干擾分子 shRNA、siRNA、miRNA 或 dsRNA。
      4.如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述抑制劑作用于活化蛋白激酶C受體1或 其編碼序列的核糖體定位序列。
      5.如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸 癌、子宮頸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。
      6.如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述腫瘤治療所采用的治療劑選自烷化 劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑。
      7.一種藥物組合物,所述藥物組合物包含(i)活化蛋白激酶C受體1的抑制劑或活化蛋白激酶C的抑制劑;(ii)腫瘤治療劑;(iii)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
      8.一種藥盒,所述藥盒包含(A)容納有活化蛋白激酶C受體1的抑制劑和/或活化蛋白激酶C的抑制劑的容器;(B)容納腫瘤治療劑的容器;和(C)使用說明書。
      9.一種篩選抗耐藥的腫瘤治療藥物的方法,所述方法包括(a)提供表達(dá)活化蛋白激酶C受體1及其配體的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物;(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物接觸,作為給 藥組;(c)檢測(cè)給藥組中活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達(dá)水平,并與未給予候選藥物的 對(duì)照腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物的活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達(dá)水平進(jìn) 行比較;如果檢測(cè)結(jié)果顯示,給藥組的活化蛋白激酶C受體1和/或其配體的表達(dá)水平顯著低 于對(duì)照組,則表明該候選藥物是抗耐藥的腫瘤治療藥物。
      10.如權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,所述活化蛋白激酶C受體1的配體是 PKCβ IIo
      全文摘要
      本發(fā)明涉及活化蛋白激酶C受體1作為抗腫瘤耐藥靶點(diǎn)的用途。具體而言,本發(fā)明中揭示了活化蛋白激酶C及其受體——活化蛋白激酶C受體1(RACK1)對(duì)腫瘤藥物治療的影響,并由此提供了活化蛋白激酶C的抑制劑或活化蛋白激酶C受體1的抑制劑在制備降低或消除腫瘤化療耐藥性的藥物中的用途、它們作為腫瘤耐藥標(biāo)志物及其作為耐藥腫瘤預(yù)測(cè)、診斷以及耐藥腫瘤藥物設(shè)計(jì)和篩選的靶點(diǎn)的應(yīng)用。本發(fā)明為克服腫瘤耐藥、提高療效提供新的機(jī)理,為抗腫瘤耐藥提供新的靶點(diǎn)。
      文檔編號(hào)C12Q1/68GK101985037SQ20101018888
      公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
      發(fā)明者惲小婧, 阮元元, 顧建新 申請(qǐng)人:上海醫(yī)學(xué)生命科學(xué)研究中心有限公司
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