專利名稱：乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶啟動(dòng)子及應(yīng)用和構(gòu)建體與載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及圓紅冬孢酵母啟動(dòng)子、終止子及其用途， 包括基因工程菌株構(gòu)建所必需的轉(zhuǎn)化方法等。
背景技術(shù)：
微生物是自然界中分布最廣泛的物種之一，具有卓越的生物合成能力，幾乎能合成地球上所有的有機(jī)化學(xué)品。微生物的種屬多樣性和遺傳多樣性決定了其代謝多樣性。與多細(xì)胞生物相比，微生物的代謝途徑雖然相對(duì)簡(jiǎn)單，但其化合物的生產(chǎn)高效、快捷，并與人類日常生產(chǎn)生活關(guān)系密切。
做為某一化學(xué)品的天然生產(chǎn)菌株或環(huán)境治理應(yīng)用菌株，其特定的生產(chǎn)性能往往并非最優(yōu)化。如何優(yōu)化或改變工業(yè)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以提高生物基產(chǎn)品的積累速度或定向控制靶產(chǎn)品的質(zhì)量，是當(dāng)今生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。實(shí)際上，對(duì)微生物油脂代謝過(guò)程的理解、開發(fā)和利用是否能達(dá)到或者超過(guò)化學(xué)加工水平，也是提高發(fā)酵過(guò)程經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵。全基因組測(cè)序和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，為菌株生理學(xué)特性的認(rèn)識(shí)和菌株改良提供了比傳統(tǒng)誘變技術(shù)更為合理的方法。
代謝工程的實(shí)質(zhì)是利用重組DNA技術(shù)和其它技術(shù)，有目的地改變已有的代謝和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更好地理解和利用細(xì)胞的代謝途徑。代謝工程可以在細(xì)胞與分子水平上認(rèn)識(shí)和改造細(xì)胞過(guò)程，其不僅可以解釋細(xì)胞生理生化特性，而且還可賦于出發(fā)菌株新的性狀和表型(1)擴(kuò)大底物利用范圍；( 生產(chǎn)原來(lái)不存在的新化合物；C3)增強(qiáng)對(duì)環(huán)境中毒害物質(zhì)的降解能力；(4)提高菌體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力；(5)阻斷或降低副產(chǎn)品的生成；(6)代謝產(chǎn)品生產(chǎn)速率和生產(chǎn)性能的提高等(Bailey J Ε. Toward a science ofmetabolic engineering. Science. 1991,252(5013) :1668-1675 ；Aristidou A,Penttila M. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Curr. Opin.Biotechnol.2000，11(2) :187-198)。
圓紅冬孢酵母屬于擔(dān)子菌門異宗配合型真菌，是發(fā)酵工業(yè)中一種極為重要的微生物，可利用源于生物質(zhì)的己糖和戊糖為原料生產(chǎn)重要的生物基產(chǎn)品微生物油脂， 胞內(nèi)油脂可達(dá)細(xì)胞干重的60 %以上(Ratledge C, WynnJ P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv. Appl. Microbiol. 2002, 51 :1-51 ；Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb. Technol. 2007,41 (3) :312-317)；工業(yè)用酶或藥物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸角軍氨酶(Hodgins D S. Yeastphenylalanine ammonia-lyase. Purification, properties, and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine. J Biol.Chem. 1971,246(9) :2977-2985 ；Gilbert H J, Clarke I N, Gibson R K, et al. Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidiumtoruloides in Escherichia coli K-12. JBacteriol. 1985,161 (1) :314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A,PiloneM S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis. J Biol. Chem. 1994,269(27) 17809-17814 ；Liao G J, Lee Y J, Lee Y H, et al. Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl.Biochem. 1998，27 (Pt 1) :55-61)等；β-胡蘿卜素和胞外多糖；并在污水處理和生物制藥中有較廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌可同時(shí)利用五碳糖和六碳糖為底物，抗逆性好，能直接以玉米秸稈酸水解液為碳源積累油脂，可實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)到生物基產(chǎn)品的高效轉(zhuǎn)化 (李永紅，劉波，孫艷，等.廣譜碳源產(chǎn)油酵母菌的篩選.中國(guó)生物工程雜志，2005，25 (12) 39-44)。
雖然圓紅冬孢酵母具有優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)性能，同時(shí)，圓紅冬孢酵母來(lái)源的蛋白酶異源表達(dá)也獲得成功(Pollegioni L，Molla G Campaner S，Cloning，sequencing and expression in Ε.coli of a D—amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C. J Biotechnol. 1997，58(2) 115-123 ；Faulkner J D， Anson J G，Tuite M F，et al. High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system. Gene. 1994,143 (1) 13-20)，但圓紅冬孢酵母自身缺乏相應(yīng)的遺傳操作系統(tǒng)。以圓紅冬孢酵母為宿主菌，無(wú)論是基因工程操作還是代謝工程菌株改良，都受到遺傳操作系統(tǒng)的制約，難以進(jìn)行靶向性的菌株改造。
啟動(dòng)子對(duì)于遺傳操作系統(tǒng)來(lái)說(shuō)必不可少。因此，如果要對(duì)圓紅冬孢酵母進(jìn)行遺傳操作，獲得能在圓紅冬孢酵母中起作用的啟動(dòng)子是該工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，本發(fā)明的主要目的是提供可用于在圓紅冬孢酵母中有效表達(dá)外源基因，并且可通過(guò)遺傳工程技術(shù)進(jìn)行圓紅冬孢酵母菌種改良的啟動(dòng)子和終止子。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人對(duì)圓紅冬孢酵母中的基因表達(dá)情況進(jìn)行了深入研究，在對(duì)圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脫羧酶及其編碼基因Rtura3研究的基礎(chǔ)上(中國(guó)專利，專利申請(qǐng)?zhí)?200710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, Tang W, Zhao Z. Identification of the orotidine-5' -monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008,25 (9) :623-630)，利用染色體步移方法，從圓紅冬孢酵母染色體DNA中成功獲得了包含有效啟動(dòng)子的DNA片段，由此完成了本發(fā)明。
具體講，本發(fā)明包含下述實(shí)施方案(A)到(F) (A)本發(fā)明涉及一種具有圓紅冬孢酵母轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列自3，-末端起900bp以內(nèi)的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的序列，或?qū)EQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動(dòng)子活性的序列。
(B)本發(fā)明涉及一種來(lái)自圓紅冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特征 (1)如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5，-末端的部分序列；(2) 或具有可與如(1)所示序列雜交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。
(C)本發(fā)明涉及一種可完成靶基因在圓紅冬孢酵母中轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止的DNA 分子，它同時(shí)具有如㈧所述序列和如⑶所述序列，且如⑶所述序列位于如㈧所述序列的下游，與其相鄰1-10000個(gè)核苷酸的DNA片段。
(D)本發(fā)明涉及一種可將靶基因與(A)-(C)所述的任一種DNA分子連接的DNA構(gòu)建體，以便于靶基因能夠在圓紅冬孢酵母中表達(dá)的重組DNA。所述靶基因?yàn)榈鞍拙幋a核酸或反義核酸編碼核酸。
(E)本發(fā)明涉及一種攜帶(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一個(gè)的載體。所述載體可以是質(zhì)粒載體或粘粒載體。
(F)本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)入了如⑶所述的DNA分子或如(E)所述載體的圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬(Miodosporidium)真菌。
使用本發(fā)明的具有啟動(dòng)子活性的DNA分子和具有轉(zhuǎn)錄終止子活性的DNA，可實(shí)現(xiàn)外源基因或內(nèi)源基因在圓紅冬孢酵母中的表達(dá)，本發(fā)明提供了用于遺傳工程圓紅冬孢酵母的啟動(dòng)子、終止子和載體。為圓紅冬孢酵母開啟了一條育種新途徑，并因此可以提供具有工業(yè)用途的新型圓紅冬孢酵母。


圖1表示pRtura3啟動(dòng)子DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。
圖2表示Rtura3t終止子DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。
圖3表示Rtura3啟動(dòng)子-ORF-終止子基因全長(zhǎng)片段的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。
圖4表示GFPuv在圓紅冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表達(dá)結(jié)果。
圖5表示pRtura3啟動(dòng)子啟動(dòng)博來(lái)霉素抗性基因ble在紅冬孢酵母ATCC10788的抗生表達(dá)結(jié)果。
圖6表示pRtura3啟動(dòng)子啟動(dòng)遺傳霉素抗性基因kanmx4在紅冬孢酵母ATCC 10788的抗生表達(dá)結(jié)果。
圖7表示重組圓紅冬孢酵母在5’ -FOA上的培養(yǎng)結(jié)果。
圖8是質(zhì)粒pura3gfp的結(jié)構(gòu)圖。
圖9是質(zhì)粒pura3ble的結(jié)構(gòu)圖。
圖10是質(zhì)粒pura3kan的結(jié)構(gòu)圖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式在本文中，“啟動(dòng)子”是指能夠被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”還可理解為包括5’非編碼區(qū)、順式作用元件(如增強(qiáng)子)以及其它能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核苷酸序列。
啟動(dòng)子的存在或強(qiáng)度通常是通過(guò)啟動(dòng)子活性表示，其測(cè)定方法將報(bào)告基因(如綠色熒光蛋白)連接于所述啟動(dòng)子的下游，并將該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)量。如果人們觀察到連接于所述啟動(dòng)子下游報(bào)告基因的表達(dá)，就可以認(rèn)為所述啟動(dòng)子在它所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)有活性。
在本文中，“終止子”是指染色體上提供終止信號(hào)使RNA聚合酶與DNA模板分離而使轉(zhuǎn)錄終止的一段DNA序列?？梢酝ㄟ^(guò)諸如Northern雜交或RT-PCR的方法檢查所轉(zhuǎn)錄 RNA的大小而確認(rèn)終止子的存在?；蛲ㄟ^(guò)“啟動(dòng)子-報(bào)告基因-終止子”構(gòu)建體使報(bào)告基因有效表達(dá)而確定終止子的活性。
本發(fā)明中的“圓紅冬孢酵母”，包括屬于該“物種，，的任何二倍體和單倍體，野生型菌株和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。本發(fā)明中的“紅冬孢酵母屬真菌”，沒(méi)有具體限制，其例子包括歸屬于該屬的真菌，除圓紅冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum, Rhodosporidium bab jevae, I hodosporidiumsphaerocarpum0 本發(fā)明的“目的基因”，包括能夠在圓紅冬孢酵母中表達(dá)的蛋白編碼序列，反義RNA 編碼序列和核酸酶編碼序列。能夠在圓紅冬孢酵母中表達(dá)的蛋白編碼序列的例子包括源于圓紅冬孢酵母的核酸序列，且并不局限于此。本發(fā)明的目的基因還包括來(lái)源于其它微生物、 植物和動(dòng)物的蛋白編碼序列。
本發(fā)明中的啟動(dòng)子具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列 3，-末端的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的序列，或?qū)EQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有 50%以上同源性、且具有啟動(dòng)子活性的序列。
本發(fā)明中的終止子具有如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列 5，-末端的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 2所示序列的全部或其DNA序列5，-末端的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄終止子活性的序列，或?qū)EQ ID NO :2所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :2所示序列具有 50%以上同源性、且具有終止子活性的序列。
本發(fā)明中的啟動(dòng)子-目的基因的構(gòu)建體、目的基因-終止子的構(gòu)建體或啟動(dòng)子-目的基因-終止子的構(gòu)建體，可以直接或經(jīng)載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化圓紅冬孢酵母，以便于目的基因表達(dá)，可以優(yōu)選質(zhì)粒載體作為介導(dǎo)載體。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以按照以下方面從圓紅冬孢酵母中分離。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所有引物合成及測(cè)序工作，如無(wú)特別說(shuō)明則均由大連TaKaRa公司完成。
實(shí)施例1 圓紅冬孢酵母基因組DNA的制備 將新鮮圓紅冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788 (購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心， ATCC)由斜面接種到50ml YEPD液體培養(yǎng)基中，于30°C搖床培養(yǎng)Mh，再以1 50的體積比例將菌液分別轉(zhuǎn)接到IOOml YEPD液體培養(yǎng)基中，于30°C搖床培養(yǎng)1 達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在 4°C下，5000rpm離心％iin，收集菌體。ATCC 10788的基因組DNA提取采用玻璃珠破壁法(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f等譯，科學(xué)出版社出版)。制備好的基因組DNA，利用Nanodrop 1000測(cè)定，測(cè)得0D26(1/0D28(1 = 1. 85，表明基因組DNA質(zhì)量很好?；蚪MDNA濃度為120ng/l·! 1，共500μ 1，凍存于-20°C，備用。
實(shí)施例2 染色體步移獲得Rtura3基因5’翼側(cè)序列(啟動(dòng)子) 本實(shí)施例利用Genome Walking Kit(購(gòu)自 TaKaRa)完成。
根據(jù)已報(bào)道的圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶編碼基因(Rtura3) 的基因組DNA序歹Ij (中國(guó)專利，專利申請(qǐng)?zhí)?200710158415. 1 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z. Identification of theorotidine-5‘ -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides Yeast 2008,25(9) 623-630)，設(shè)計(jì) 3 條 SpecificPrimer(基因特異性引物)分別為 ura3_SPl :5，-TCCCGGT CAAAGTCCTCGACGATGTC-3，， ura3-SP2 :5’ -CTTGATGCAGCAGCAGTACGGGCC-3，和 ura3_SP3 5，-GGCGTAGGTGCGGGTCGTGATGGAC-3，，做為下游引物，按照 Genomeffalking Kit (購(gòu)自 TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行以下操作。
1. IstPCR 反應(yīng) 以實(shí)施例1中精制的基因組DNA為模板，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μ 1 =IOXLA PCR buffer II (Mg2+plus，大連 TakaRa) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l)8. 0μ 1，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/y 1，大連 TakaRa) 1.0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1，大連 TakaRa) 1· 0 μ 1， ura3-SPl (10 μ mol/1) 1.0 μ 1，R. toruloides ATCC 10788 基因組 DNA 模板(120ng/ μ 1)1.0 μ LddH2O加至50 μ 1。反應(yīng)條件先進(jìn)行5個(gè)高溫退火溫度的高特異性反應(yīng)，然后進(jìn)行1個(gè)極低退火溫度的低特異性反應(yīng)；然后進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR :2個(gè)高退火溫度(65°C)的高特異性反應(yīng)和1個(gè)低退火溫度(44°C )的低特異性反應(yīng)交替循環(huán)，共15次。具體參數(shù)如下:94V lmin，98°C Imin ；94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，共 5 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 25°C 3min, 72 "C 2min ；94 "C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，結(jié)束反應(yīng)。
2. 2nd 巢式 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系50 μ 1 10 X LA PCR bufferll (Mg2+plus,大連 TakaRa) 5. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l)8. 0μ 1，TakaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大連 TakaRa) 1.0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1,大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，IstPCR 反應(yīng)產(chǎn)物 1.0 μ 1，ura3-SP2 (10 μ mol/ 1) 1· 0μ 1，ddH20 力口至 50 μ 1。反應(yīng)條件94 °C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30s, 44°C lmin, 72°C 2min,共 15 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin,結(jié)束反應(yīng)。
33rd 巢式 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系50yl:10XLA PCR bufferll (Mg2+plus,大連 TakaRa) 5. 0 μ 1， dNTPs (2. 5mmol/l) 8. 0 μ 1，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1，大連 TakaRa) 1. 0 μ 1， API Primer (100 μ mol/1，大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，2nd 巢式 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 1.0 μ 1， ura3-SP3(10ymol/l)1.0y l，ddH20 加至 50μ 1。反應(yīng)條件:94V 30s,65°C lmin，72°C 2min， 94°C 30s,65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,44°C lmin，72°C 2min，共 15 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin, 結(jié)束反應(yīng)。
3rd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1 % (質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶，利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。純化后的DNA片段經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購(gòu)自I^akaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑
7選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至TaKaRa公司測(cè)序，得到如 SEQ ID NO 1所示的DNA序列，證實(shí)為預(yù)期的pRtura3基因序列。 序列號(hào)1 (SEQ ID NO 1) 序列長(zhǎng)度1529bp 序列類型DNA
來(lái)源圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
來(lái)源菌株特征分類地位擔(dān)子菌門，高產(chǎn)油脂菌株，胞內(nèi)油脂最高達(dá)細(xì)胞干重的 TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60 TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120 CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180 TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240 GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300 GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360 ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420 GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480 CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540 CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600 CATTTGCTG TCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660 AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720 CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780 CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840 TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900 CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960 TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020 GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTAC GGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT1500
實(shí)施例3 染色體步移獲得Rtura3基因3’翼側(cè)序列(終止子) 本實(shí)施例也是利用Genome Walking Kit(購(gòu)自TaKaRa)完成。 已報(bào)道的圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶編碼基因(Rtura3) 因組DNA序列(中國(guó)專禾丨J，專禾U申請(qǐng)?zhí)?00710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, W, Zhao Z. Identification of the orotidine-5' —monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008, 25(9) :623-630)，設(shè)計(jì) 3 條 Specific Primer(基因特異性引物)分別為 ura3_SPll 5’ -GGAGGGTGGACGAGCGGGAAGAGAC-3’， ura3-SP22 :5’ -GTCATCATGACGC CCGGCGTCGGACT-3’ 和 ura3-SP33 :5，-GCGTACGAGGACAGGCTG AGGCAGT-3，，做為上游引物，按照 GenomeWalking Kit (購(gòu)自TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行3，翼側(cè)染色體步移操作，除Specif icl^rimer分別由 ura3-SPl，ura3-SP2，ura3-SP3 依次更換為 ura3-SPll，ura3-SP22，ura3_SP33 外，其它同實(shí)施例2。
3rd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化，經(jīng) TA克隆插入pMD18-T載體(購(gòu)自TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至TaKaRa公司測(cè)序， 得到如SEQ ID NO 2所示的DNA序列，證實(shí)為預(yù)期的Rt ura3t基因序列。
實(shí)施例4 =Rt ura3啟動(dòng)子-ORF-終止子全長(zhǎng)序列的獲得 以實(shí)施例1中制備的R. toruloides基因組DNA為模板，根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例 3 獲得的序列信息，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，pRtura3t-pl :5，-TGACCGGAGCAACAAGACGTGGG-3，和 pRtura3t-p2 :5，-AAGCAGGAGGAGGAGAAGCGGAGG-3，，進(jìn)行 Rtura3 啟動(dòng)子-ORF-終止子全長(zhǎng)序列的 PCR擴(kuò)增。PCR 體系(50 μ 1) 10 X Speed buffer (大連 TakaRa) 5. O μ 1, dNTPs (lOmmol/ 1)1. O μ 1，上游引物(10ymol/l)2. Ομ 1，下游引物(10 μ mol/1) 2. O μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(擴(kuò)增速度快，ΙΙΛ/lOs，購(gòu)自大連TaKaRa公司)0. 5 μ 1，基因組DNA模板(120ng/ μ 1)2 μ 1，ddH20;to 至 50μ 1。反應(yīng)條件98 °C lmin，98°C 10s, 65 °C 1. 0min,30 個(gè)循環(huán)， 68°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用 PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。片段經(jīng)TA克隆插入pMDIS-T載體(購(gòu)自 TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞；其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至TaKaRa公司測(cè)序，得到如SEQ ID NO :3所示的DNA序列，證實(shí)為預(yù)期的pRtura3t全長(zhǎng)序列，該重組載體命名為T-pRtura3t。
實(shí)施例5 圓紅冬孢酵母特異性綠色熒光蛋白表達(dá)盒ura3gfp的構(gòu)建 ura3gfp圓紅冬孢酵母特異性綠色熒光蛋白表達(dá)盒的構(gòu)建利用的是RF克隆(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning :A restriction-free method forinserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67 :67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z, 2008. Identification of theorotidine-5 ' -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides. Yeast 25(9) :623-630)的方法。
pRtura3t全長(zhǎng)序列擴(kuò)增和克隆見實(shí)施例4。
1.綠色熒光蛋白編碼基因GFPuv的獲得 以pGFPuv質(zhì)粒(購(gòu)自BD Biosciences)為模板，利用一對(duì)引物gfp-pl 5，-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 ‘和 gfp_p2 :5，-TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3，，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。體系(50 μ 1) :5XPrimebuffer (大連 TakaRa) 10.0 μ 1，dNTPs (大連 TakaRa，2. 5mmol/ 1)4. 0μ 1，上游引物 gfp-pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1,下游引物 gfp-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1,PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，pGFPuv 質(zhì)粒 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應(yīng)條件95°C 3min，98°C 8s，49°C 15s，72°C lmin，；35 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，利用taq DNA聚合酶進(jìn)行DNA片段3，末端加 A，體系(50 μ 1) 10 X PCR buffer5. Ομ 1, dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，純化后的 GFPuv DNA片段30μ l，ddH20加至50μ 1。反應(yīng)條件72°C 30min，4°C結(jié)束反應(yīng)。3，末端加A后的 GFPuv DNA片段利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，克隆入pMD18_T載體，送TaKaRa公司測(cè)序，得到如SEQ ID NO 4所示的DNA序列，證實(shí)為預(yù)期的GFPuv基因序列。
2.參照文獻(xiàn)方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設(shè)計(jì) RF 克隆引物ura3-gfp-pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgagtaaaggagaagaact-3 ‘ 禾口 ura3_gfp_p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCGCGCCAT tcatttgtagagctcatccat-3‘(其中大寫字母部分序列與pRtura3t克隆載體中原有的ura30RF翼側(cè)序列互補(bǔ)，小寫字母部分序列與綠色熒光蛋白 GFPuv ORF 互補(bǔ))。
3. RF I反應(yīng)體系及流程以本實(shí)施例操作項(xiàng)1中構(gòu)建的GFPuvTA克隆載體為模板，利用ura3gfp-pl和ura3gfp-p2為引物，進(jìn)行RF第一輪擴(kuò)增。體系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物 (10ymol/l)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，T-GFRiv 質(zhì)粒(源自實(shí)施例 4，100ng/y 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50μ 1。反應(yīng)條件:95V 3min，98°C 8s,49°C 15s, 72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)。RF I反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4. RF II 反應(yīng)5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，實(shí)施例 4 中構(gòu)建的T-pRtura3t質(zhì)粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本實(shí)施例前述步驟中RFI反應(yīng)產(chǎn)物(IOOng/ μ 1)5. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應(yīng)條 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 個(gè)循環(huán)，接下來(lái)再進(jìn)行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)。
5. DpnI消化和電擊轉(zhuǎn)化取8μ 1 RF II反應(yīng)產(chǎn)物加入Ιμ DpnI (購(gòu)自New England Biolabs)禾口 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura;3t質(zhì)粒后，分別取2μ1電擊轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)方法制備(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，并利用RF I反應(yīng)所用引物ura3gfp-p 1和ura3gfp-p2進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定陽(yáng)性的重組載體送TaKaRa進(jìn)行測(cè)序， 得到5’端和3’端分別為ura3啟動(dòng)子和ura3終止子的ura3gfp表達(dá)盒，同時(shí)，該重組載體命名為Pura3gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO :4所示；完整的ura3gfp表達(dá)盒如SEQ ID NO 5所示。
實(shí)施例6 利用ura3gfp表達(dá)盒進(jìn)行Rtura3基因敲除兼綠色熒光蛋白表達(dá) 1. Rtura3gfp敲除盒的制備 以實(shí)施例5構(gòu)建的PUra3gfp載體為模板，以實(shí)施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2為引物，進(jìn)行Rtura3gfp敲除盒的大量制備。PCR體系(500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. O μ 1，下游引物(10ymol/l)20. Ομ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(擴(kuò)增速度快， lkb/10s，購(gòu)自大連 TaKaRa 公司)5. O μ 1，基因組 DNA 模板(120ng/μ 1) 15. 0 μ 1，ddH20 加至 500 μ I0 反應(yīng)條件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1 % (質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。純化后的DNA片段濃度在400ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細(xì)胞制備 R. toruloides npll 感受態(tài)細(xì)胞的制備R. toruloides ATCC 10788(購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接種10ml YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20. Og/Ι，酵母提取物 10.0g/l，蛋白胨 20.0g/l，pH 6. 0)，30°C，200rpm，培養(yǎng) 20h ；培養(yǎng)物 1 50 比例轉(zhuǎn)接新鮮YEPD培養(yǎng)基，100ml (500ml錐形瓶，裝液量100ml) ,30 °C, 200rpm,培養(yǎng)6_9h，OD值達(dá)到 0. 6-1.2 ；培養(yǎng)物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 離心 5min，棄上清；0°C無(wú)菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定 Rtura3gfp 敲除盒的電擊轉(zhuǎn)化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態(tài)細(xì)胞，加入Rtura3gfp敲除盒5 μ 1 (總共2 μ g)，混勻后冰移入預(yù)冷至0°C的電擊杯中，電擊參數(shù)電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時(shí)間4-lOms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C溫育1- ；涂布YEPD平板，10 μ 1/平板，30°C培養(yǎng)觀_3乩；逐一挑單克隆利用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，陽(yáng)性重組子ATCC 10788Aura3::gfp的熒光相片如圖4所示。
3株重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Aura3: :gfp YEPD培養(yǎng)24h的培養(yǎng)物，利用生理鹽水(0.9% NaCl緩沖液)進(jìn)行倍比稀釋，選擇其10-3、10-4、10_5、10-6四個(gè)稀釋度，分另Ij 移取10 μ 1菌液于含5’ -FOA (5’ -氟乳清酸，購(gòu)自上海金和生物技術(shù)有限公司)的SC固體培養(yǎng)基(0. 2% 5' -F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4 0. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L， MgSO4 ·7Η201. 5g/L，pH 6. 0)平板，待液體吸收完全，于30°C倒置培養(yǎng)3天，發(fā)現(xiàn)重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3::gfp具備5，-FOA抗性，而對(duì)照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788 則無(wú)菌落生長(zhǎng)。
以上結(jié)果說(shuō)明，Rtura3gfp敲除盒(表達(dá)盒)在啟動(dòng)綠色熒光蛋白在圓紅冬孢酵母中的整合性表達(dá)的同時(shí)，可以滅活整合位置ura3基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設(shè)計(jì)有利于后期的遺傳操作。
實(shí)施例7 圓紅冬孢酵母特異性博來(lái)霉素抗性表達(dá)盒ura3ble的構(gòu)建 ura3ble圓紅冬孢酵母特異性博來(lái)霉素表達(dá)盒的構(gòu)建，同樣是利用RF克隆的方法。
pRtura3t全長(zhǎng)序列擴(kuò)增和克隆見實(shí)施例4。
1.參照文獻(xiàn)方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Arestriction-free method for inserting target genes into ρlasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設(shè)計(jì) RF 克隆引物ura3_ble_pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3 ‘ 禾口 ura3_ble_p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCATtcagtcctgctcctcggccacg-3 ‘(其中大寫字母部分序列與pRtura3t克隆載體中原有的ura30RF翼側(cè)序列互補(bǔ)，小寫字母部分序列與博來(lái)霉素抗性基因ble ORF互補(bǔ))。
2. RF I反應(yīng)體系及流程以PPICZaA質(zhì)粒(購(gòu)自^witrogen公司)為模板，利用 ura3ble-pl 和 ura3ble-p2 為引物，進(jìn)行 RF 第一輪擴(kuò)增。體系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. Ομ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1· 0 μ 1，pPICZ α A 質(zhì)粒(lOOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反應(yīng)條件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)。RF I反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C 保存?zhèn)溆谩?br> 3. RF II 反應(yīng)5 XPrime buffer 10. O μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，實(shí)施例 4 中構(gòu)建的T-pRtura3t質(zhì)粒(lOOng/μ 1) 1. O μ 1，本實(shí)施例前述步驟中RF I反應(yīng)產(chǎn)物(lOOng/ μ 1)5. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. O μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應(yīng)條 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 個(gè)循環(huán)，接下來(lái)再進(jìn)行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)。
4. DpnI消化和電擊轉(zhuǎn)化取8μ 1 RF II反應(yīng)產(chǎn)物加入Ιμ DpnI (購(gòu)自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer混勻后在37°C作用 120min去除原T_pRtura3t質(zhì)粒后，分別取2μ1電擊轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)方法制備(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，并利用RF I反應(yīng)所用引物ura3ble-pl和ura3ble-p2進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定陽(yáng)性的重組載體送TaKaRa進(jìn)行測(cè)序，得到5’端和3’端分別為ura3啟動(dòng)子和ura3終止子的urdble表達(dá)盒，同時(shí)，該重組載體命名為Pura3ble。ble ORF序列如SEQ ID NO :6所示；完整的ura3ble表達(dá)盒如SEQ ID NO 7 所示。
實(shí)施例8 利用urdble表達(dá)盒進(jìn)行Rtura3基因敲除兼博來(lái)霉素抗性表達(dá) 1. RturaiBble敲除盒的制備 以實(shí)施例5構(gòu)建的PurUble載體為模板，以實(shí)施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2為引物，進(jìn)行Rtura3ble敲除盒的大量制備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0 μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5. 0 μ 1，基因組 DNA 模板(120ng/y 1)15. 0 μ 1, ddH20 加至 500 μ 1。反應(yīng)條件98°C lmin，98°C 10s,65°C 60s, ；35個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。純化后的DNA片段濃度在300ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細(xì)胞制備 R. toruloides npll感受態(tài)細(xì)胞的制備同實(shí)施例6中的操作項(xiàng)3。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定 Rtura3ble 敲除盒的電擊轉(zhuǎn)化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態(tài)細(xì)胞，加入Rtura3ble敲除盒10 μ 1 (總共3 μ g)，混勻后移入預(yù)冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時(shí)間4_10ms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C溫育 l-2h ；涂布含 20 μ g/ml Zeocin (購(gòu)自 Invitrogen 公司)的 YEPD 平板，200 μ 1/ 平板，30°C 培養(yǎng)2-10d，約有100個(gè)轉(zhuǎn)化子陸續(xù)出現(xiàn)。
挑取4個(gè)kocin抗性轉(zhuǎn)化子于YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，培養(yǎng)物利用生理鹽水 (0.9% NaCl緩沖液)進(jìn)行倍比稀釋，選擇其10_3、10_4、10_5、10_6四個(gè)稀釋度，分別移取 10 μ 1菌液點(diǎn)樣于含5’ -FOA(購(gòu)自上海金和生物技術(shù)有限公司)的SC固體培養(yǎng)基(0. 2% 5，_F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 ·7Η20 1. 5g/ L，pH 6. 0)平板，待液體吸收完全后，于30°C倒置培養(yǎng)3天，發(fā)現(xiàn)重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3: :ble具備5，_F0A抗性，而對(duì)照菌株圓紅冬孢酵母ATCC10788則無(wú)菌落生長(zhǎng)。
以上結(jié)果說(shuō)明，RturUble敲除盒(表達(dá)盒)在啟動(dòng)博來(lái)霉素抗性基因在圓紅冬孢酵母中整合性表達(dá)的同時(shí)，可以滅活整合位置ura3基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設(shè)計(jì)有利于后期的遺傳操作。
實(shí)施例9 圓紅冬孢酵母特異性遺傳霉素抗性表達(dá)盒ura3kan的構(gòu)建 ura3kan圓紅冬孢酵母特異性遺傳霉素抗性表達(dá)盒的構(gòu)建，同樣是利用RF克隆的方法。
pRtura3t全長(zhǎng)序列擴(kuò)增和克隆見實(shí)施例4。
1.參照文獻(xiàn)方法(Van den Ent，F(xiàn).，Lowe，J.，2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into ρlasmi ds. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設(shè)計(jì) RF 克隆引物ura3_kan_pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3 ‘ 禾口 ura3_kan-p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCAT ttagaaaaactcatcgagcatc-3‘(其中大寫字母部分序列與pRtura3t克隆載體中原有的ura30RF翼側(cè)序列互補(bǔ)，小寫字母部分序列與遺傳霉素抗性基因kanmx4 ORF互補(bǔ))。
2. RF I反應(yīng)體系及流程以pFA6-kanmx4質(zhì)粒(購(gòu)自EUR0SCARF)為模板，利用 ura3kan-pl 和 ura3kan-p2 為引物，進(jìn)行 RF 第一輪擴(kuò)增。體系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. 0 μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1· 0 μ 1，pFA6_kanmx4 質(zhì)粒(llOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反應(yīng)條件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)。RF I反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C 保存?zhèn)溆谩?br> 3. RF II 反應(yīng)5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，實(shí)施例 4 中構(gòu)建的T-pRtura3t質(zhì)粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本實(shí)施例前述步驟中RFI反應(yīng)產(chǎn)物(IOOng/ μ 1)5. 0 μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 1. 0μ l，ddH20 加至 50 μ 1。反應(yīng)條件:95 V 3min, 68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s (-1 °C /cyc)，68°C 12min，15 個(gè)循環(huán)，接下來(lái)再進(jìn)行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)。
4. DpnI消化和電擊轉(zhuǎn)化取8μ 1 RF II反應(yīng)產(chǎn)物加入Ιμ DpnI (購(gòu)自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura;3t質(zhì)粒后，分別取2μ1電擊轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)方法制備(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)2200-2500V，400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，并利用RF I反應(yīng)所用引物ura3kan-p 1和ura3kan-p2進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定陽(yáng)性的重組載體送TaKaRa進(jìn)行測(cè)序， 得到5’端和3’端分別為ura3啟動(dòng)子和ura3終止子的ura3kan表達(dá)盒，同時(shí)，該重組載體命名為Pura3kan。kanmx ORF序列如SEQID NO :8所示；完整的ura3kan表達(dá)盒如SEQ ID NO 9所示。
實(shí)施例10 利用ura3kan表達(dá)盒進(jìn)行Rtura3基因敲除兼遺傳霉素抗性表達(dá) 1. Rtura3kan敲除盒的制備 以實(shí)施例9構(gòu)建的PUra3kan載體為模板，以實(shí)施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2為引物，進(jìn)行Rtura3kan敲除盒的大量制備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0 μ 1，下游引物(10ymol/l)20. 0μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5. 0 μ 1，基因組 DNA 模板(120ng/y 1)15. 0 μ 1, ddH20 加至 500 μ 1。反應(yīng)條件98°C lmin，98°C 10s,65°C 60s, ；35個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1 % (質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。純化后的DNA片段濃度在320ng/yl，共40μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細(xì)胞制備 R. toruloides npll感受態(tài)細(xì)胞的制備同實(shí)施例6中的操作項(xiàng)3。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定 Rtura3kan 敲除盒的電擊轉(zhuǎn)化取 100μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態(tài)細(xì)胞，加入Rtura3kan敲除盒10 μ 1 (總共3. 2 μ g)，混勻后移入預(yù)冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時(shí)間4_10ms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C溫育1-池；涂布含50yg/ml G418(購(gòu)自北京舟鼎國(guó))的YEPD平板，200 μ 1/平板，30°C培養(yǎng) 2-10d,約有60個(gè)轉(zhuǎn)化子陸續(xù)出現(xiàn)。
挑取3個(gè)G418抗性轉(zhuǎn)化子于YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，培養(yǎng)物利用生理鹽水(0. 9% NaCl緩沖液)進(jìn)行倍比稀釋，選擇其10_3、10_4、10_5、10_6四個(gè)稀釋度，分別移取10 μ 1菌液點(diǎn)樣于含5’-FOA(購(gòu)自上海金和生物技術(shù)有限公司)的SC固體培養(yǎng)基(0.2% 5’-F0A， 葡萄糖 70g/L, (NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 · 7H20 1. 5g/L， PH 6.0)平板，待液體吸收完全后，于30°C倒置培養(yǎng)3天，發(fā)現(xiàn)重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3: :kan具備5，_F0A抗性，而對(duì)照菌株圓紅冬孢酵母ATCC10788則無(wú)菌落生長(zhǎng)。
以上結(jié)果說(shuō)明，Rtura3kan敲除盒(表達(dá)盒)在啟動(dòng)遺傳霉素抗性基因在圓紅冬孢酵母中整合性表達(dá)的同時(shí)，可以滅活整合位置的ura3基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設(shè)計(jì)有利于后期的遺傳操作。
實(shí)施例11 :PRtura3啟動(dòng)子和Rtura3t終止子的屬內(nèi)(不同種間)活性測(cè)定 也即ura3gfp、ura3ble、ura3kan 等表達(dá)盒在 R. babjevae 的功能驗(yàn)證。
在此利用^SrDNA基因做為整合位點(diǎn)，通過(guò)融合PCR方法使每個(gè)整合表達(dá)盒5’末端攜帶有約500bp的^SrDNA基因同源重組臂，分別進(jìn)行ura3gfp表達(dá)盒、urdble表達(dá)盒、 ura3kan表達(dá)盒在R. babjevae中的整合性表達(dá)。
1.根據(jù) NCBI 公布的 R. babjevae 26SrDNA 序列(NO. :EF595746)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Rb26S-Rtura3-pl :5’ -AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3，和 Rb26S_Rtura3_p2 :5’ -cccacgtcttg ttgctccggtcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3，(其中大寫字母部分序列與R. babjevae 26SrDNA 序列3’端同源，小寫字母部分序列與圓紅冬孢酵母pura3啟動(dòng)子5’端互補(bǔ))。
2. Rb26S-Rtura3gfp、Rb26S_Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan 的構(gòu)建 分別利用實(shí)施例5、實(shí)施例7和實(shí)施例9中的Pura3gfp、Pura3ble和Pura3kan載體為模板，分別進(jìn)行 M^6S-Rtura3gfb、M^6S-Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan 等 3 個(gè)融合表達(dá)盒的構(gòu)建。PCR體系(各 500 μ 1) 10 X Speedbuffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1， 上游引物(10μπιο1/1)20. 0μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5.0 μ 1，DNA 模板質(zhì)粒 Rira3gfp 或 Pura3ble 或 Rira3kan (均 120ng/y 1)15.0 μ l,ddH20 加至 500 μ 1。反應(yīng)條件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C 結(jié)束反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。純化后的Rl^6S-Rtura3gfp、Rb26S-Rtura3ble和 Rb26S-Rtura3kan 表達(dá)盒濃度分別為 300ng/μ l、280ng/y 1 和 ^Ong/μ 1，均 40μ 1,-20 °C
保存?zhèn)溆谩?br> 3. R. babjevae ATCC90942 感受態(tài)細(xì)胞制備 R. babjevae ATCC90942購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。首先，挑菌落接種 IOml YEPD培養(yǎng)基，觀°C，200rpm，培養(yǎng)24h ；培養(yǎng)物1 50比例轉(zhuǎn)接新鮮YEPD培養(yǎng)基， 100ml (500ml 錐形瓶，裝液量 100ml)，28°C，200rpm,培養(yǎng) 7-10h, OD 值達(dá)到 0. 6-1. 2 ；培養(yǎng)物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 離心 5min，棄上清；0°C無(wú)菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1 山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。
4. R. babjevae ATCC90942的電擊轉(zhuǎn)化和表達(dá)結(jié)果觀察 取3 份 100 μ 1 R. babjevae ATCC90942 感受態(tài)細(xì)胞，分別加入 Rl^6S-Rtura3gfp、 Rb26S-Rtura3ble和Rl^6S-Rtura3kan表達(dá)盒各10 μ 1，混勻后移入預(yù)冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時(shí)間4-lOms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C 溫育 1- ；Rb26S-Rtura3gfp 轉(zhuǎn)化液涂布 YEPD 平板，10 μ 1/ 平板；Rb26S-Rtura3ble 轉(zhuǎn)化液涂布含20 μ g/mlZeocin (購(gòu)自hvitrogen公司)的YEPD平板，200 μ 1/平板； Rb26S-Rtura3kan轉(zhuǎn)化液涂布含50 μ g/ml G418 (購(gòu)自北京舟鼎國(guó))的YEPD平板，200 μ 1/ 平板；均培養(yǎng)2-10d。
R. babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura3gfp 轉(zhuǎn)化子逐一挑單克隆利用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，每30個(gè)轉(zhuǎn)化子中可有一個(gè)熒光表達(dá)的陽(yáng)性重組子，熒光相片略; Rb26S-Rtura3ble轉(zhuǎn)化液涂布含20 μ g/ml Zeocin的YEPD平板，培養(yǎng)5d時(shí)可觀察到大小不一的抗性重組子，平均200個(gè)/平板，轉(zhuǎn)化重組效率400個(gè)重組子/ μ g表達(dá)盒DNA ； Rb26S-Rtura3kan轉(zhuǎn)化液涂布含50 μ g/ml G418的YEPD平板，培養(yǎng)6d時(shí)可觀察到大小不一的抗性重組子，平均100個(gè)/平板，轉(zhuǎn)化重組效率200個(gè)重組子/ μ g表達(dá)盒DNA。
各表達(dá)盒在R. babjevae ATCC90942的表觀轉(zhuǎn)化重組效率，比在R. toruloides ATCC10788中的表觀轉(zhuǎn)化重組效率高，可能是由于在R. babjevaeATCC90942進(jìn)行的是單位點(diǎn)同源重組，而在R. toruloides ATCC 10788進(jìn)行的是雙位點(diǎn)同源重組的原因。
以上實(shí)施例證明，ura3啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)綠色熒光蛋白基因、博來(lái)霉素抗性基因和遺傳霉素抗性基因在R. toruloides ATCC 10788中和R. bab jevaeATCC90942中的整合性表達(dá)，具有屬內(nèi)啟動(dòng)子活性；ura3gfp表達(dá)盒、ura3ble表達(dá)盒、ura3kan表達(dá)盒為基礎(chǔ)構(gòu)建的線性DNA敲除盒，能夠敲除圓紅冬孢酵母基因組上的ura3靶基因。
使用本發(fā)明的啟動(dòng)子和終止子，可實(shí)現(xiàn)目的基因在圓紅冬孢酵母中的表達(dá)或特定靶基因的選擇性敲除，本發(fā)明提供了用于遺傳工程圓紅冬孢酵母的啟動(dòng)子、終止子和一系列DNA構(gòu)建體。為圓紅冬孢酵母開啟了一條育種新途徑，并因此可以提供具有工業(yè)用途的新型圓紅冬孢酵母。并為紅冬孢酵母屬的其它酵母菌的遺傳操作提供了方法和平臺(tái)。
本發(fā)明的有益效果是 為圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬的酵母菌提供了啟動(dòng)子、終止子、選擇性標(biāo)記基因表達(dá)盒和遺傳轉(zhuǎn)化方法，將有力促進(jìn)今后的圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬的酵母菌的菌株改良研究，加快圓紅冬孢酵母代謝工程研究。
0158]SEQ ID NO10159]TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC600160]TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC1200161]CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC1800162]TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT2400163]GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG3000164]GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG3600165]ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC4200166]GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC4800167]CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG5400168]CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA6000169]CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM6600170]AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT7200171]CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG7800172]CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT8400173]TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT9000174]CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC9600175]TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG10200176]GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC10800177]GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT11400178]CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC12000179]ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGAACGCGACGAGCTGGGGGTTGTGAACA TCGGGCGGAG12600180]CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT13200181]GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA13800182]AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTAC GGGACTGCTT14400183]TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT15000184]CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG15290185]SEQ ID NO2
16 ATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTGTMGGCTATCTTGACAACMCATGCA60 CMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGG120 ACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCMTGGC180 TGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGGAMCMGAGMGGGMGGGCGATGGC240 TGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGG300 GCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGMGTAC360 GACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGG420 GCGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATC480 GTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACC540 TCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTC600 GATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMGGCGATCTGTACGAG660 CGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMGGGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTC720 ATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCG780 GCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCG840 MCGMGGMMGACCGGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCAC900 CCGCCTCCGCTTCTCCTCCT CCTGCTT927 SEQ ID NO 3 (圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動(dòng)子、圓紅冬孢酵母乳清畫I核苷-5'-磷酸脫羧酶終止子) TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60 TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120 CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180 TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240 GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300 GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360 ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420 GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480 CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540 CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600 CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660 AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720 CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780 CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840 TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900 CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960 TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020 GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMC MTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500 CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGCCGTCCATCACGACCCGCACCTACGCCG1560 MCGGGCTGCCMGCACCCCGTCCCGGTCGCAMGCAGTTGCTCGACATCTGCGACCGCA1620 AAMGACCMCCTCTGCGTTTCAGTCGACGTGACGAGCMGGCGGGCCTGCTCAGGATCG1680 CAGAGGCTGCCGGCCCGTACTGCTGCTGCATCMGGTAGGTTGTACCGGCGCTGMGTAA1740 TCCGAGGACCGCAGCTGACAGACCGAGACACCGACGATAGACCCACATCGACATCGTCGA1800 GGACTTTGACCGGGATCTCGTTCAGCMCTGCAGGCTCTC GCAGACAAGCACGATTTTCT1860 GATTTGGGAGGACCGCMGTTTGCCGACATCGGTGCGTCAATCGAGACTCCCGACTACCT1920 TCCCCGCTGATGGCCCGCGAGACGACAGGCMCACCGTTCGGCTGCAGTACTCGTCCGGT1980 ATCTACAAGATCGCATCCTGGGCGCACATCACCMCGCCCACTTGGTCCCCGGCGAGGGC2040 ATCCTGACGGGCCTCGCATCCGTCGGTCTGCCCCTTGGCCGCGGTCTCCTGCTTCTCGCC2100 GAGATGAGCGCCMGGGCMCCTCGCGACTGGCGAGTACACGGCCMGMTGTCGAGGCG2160 GCGAGGCGGCATCCTGMTTCGTGATGGGCTTCGTTGCGATGCGGAGGGTGGACGAGCGG2220 GAAGAGACGGCTGGCGGTGTTGCGCCGGGAGMGGGGTGCGTCCCATCTCACTCTTTTCC2280 GCTCMCTTCAGCTGACTCCGTGCTCCACCAGGCCGACTACGTCATCATGACGCCCGGCG2340 TCGGACTCGACTCGMGGGCGACGGCATGGGCCAGCAGTACCGTACACCC GACGAGGTCA2400 TCCGCGAGTCCGGCTGCGACGTTATCATCGTCGGTCGGGGTATCTACGGCGGCGGCGACG2460 GCMCCCTMCGMGAGATCGTCMGCAGTGCMGCGGTATCAGGAGGCGGGCTGGMGG2520 CGTACGAGGACAGGCTGAGGCAGTGAATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTG2580 TAAGGCTATCTTGACAACMCATGCACMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCT2640 TCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGGACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACT2700 TGTCGCTCGAACTCTTCGCCAATGGCTGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGG2760 AAACMGAGAAGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMG2820 MGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGGCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCG2880 CCTTAGCCGACGACGACGCGAAGTACGACG ACTCGACGAT CTCGACGTCGCTGCTGTCGT2940 CGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCAACCTCT3000 GCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCT3060 CGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCT3120 TCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAG3180 AGGGAGGTGAAGGCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMG3240 GGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTCATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGA3300 CGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCGGCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCA3360 CATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCGMCGMGGAAMGACCGGGCCACGCACGTCGGCT3420 TCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCCTCCTCCTGCTT3473 SEQ ID NO :4(綠色熒光蛋白編碼基因) ATGAGTAMG GAGMGMCTTTTCACTGGA GTTGTCCCMTTCTTGTTGA ATTAGATGGT60GATGTTMTG GGCACAMTT AMCTTACCC TTAMTTTAT GTCACTACTT TCTCTTATGG CATGACTTTT TCMGAGTGC AMGATGACG GGMCTACM MTCGTATCG AGTTAAMGG CTCGAGTACA ACTATMCTC ATCAMGCTA ACTTCAAMT CATTATCMC AAMTACTCC CTGTCGACAC MTCTGCCCT CTTGAGTTTG TMCTGCTGC SEQ ID NO :5(綠色熒光蛋白編碼基因) TGACCGGAGC TTGCACAMT CGCTTTCGAC TCCATATACA GCCCACTGGC GTCTACGAGA ACTGGCTTGT GGMCGCCGT CACGCTGTGC CATCCGTCGC CATTTGCTGT AGACGAGCGA CGMCCACTC CMGACCGTC TCGCCGTCCA CCCACCTTGC TGTGGGAGAC GCGCAGACAT GTCGCTCGCT CACGCAGCCA ATTCCTGGCC CGGGGGTGCT GAGCTCCTGG AGAGMGGTT TCCGAGTCTA CTCCTCCTCC TTGTCCCMT
TTCTGTCAGTGGAGAGGGTGMGGTGATGCMCATACGGA120TTGCACTACTGGAAMCTACCTGTTCCATGGCCMCACTT180TGTTCMTGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAMCGG240CATGCCCGMGGTTATGTACAGGMCGCACTATATCTTTC300GACGCGTGCTGMGTCMGTTTGMGGTGATACCCTTGTT360TATTGATTTTAMGMGATGGAMCATTCTCGGACACAM420ACACMTGTATACATCACGGCAGACAMCAAMGMTGGA480TCGCCACMCATTGMGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC540MTTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACMCCATTAC600TTCGAMGATCCCMCGAMAGCGTGACCACATGGTCCTT660TGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAMTM717
MCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60AGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120TCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180CCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240CCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360CGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420AGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480AGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540AGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660GACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900TCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960GGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020CGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080GCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGAAGCGACT1140CCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC1200GTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGG GTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260CGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320CATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTAC TGATGMGTC GAGGAGAGGA1380GTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT1440TCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT1500TCCCGCTCCATCCGTCGAGATGAGTAMGG AGMGMCTTTTCACTGGAG1560TCTTGTTGMTTAGATGGTGATGTTMTGG GCACAMTTTTCTGTCAGTG1620
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19GAGAGGGTGA GAAMCTACC TTTCCCGTTA GTTATGTACA MGTCMGTT MGMGATGG ACATCACGGC TTGMGATGG GCCCTGTCCT CCMCGAAM ATGGCATGGA TAAGGCTATC TCACGGACCG TGTCGCTCGA AAACMGAGA MGAGACGTT CCTTAGCCGA CGTCATTCCG GCTCTTCTCG CGTCATCGCT TCTTCGTTGG AGGGAGGTGA GGMGGAGGT CGATGCCGCG CATCGTCTGT TCGTACCGCT SEQ ID NO； ATGGCCMGT GAGTTCTGGA GTGGTCCGGG MCACCCTGG GTCGTGTCCA CCGTGGGGGC GAGGAGCAGG SEQ ID NO； TGACCGGAGC TTGCACAMT CGCTTTCGAC TCCATATACA
AGGTGATGCAACATACGGMMCTTACCCTTAMTTTATTTGCACTACTG1680TGTTCCATGGCCMCACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCMTGCT1740TCCGGATCATATGAMCGGCATGACTTTTTCMGAGTGCCATGCCCGMG1800GGMCGCACTATATCTTTCAMGATGACGGGMCTACMGACGCGTGCTG1860TGMGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAMGGTATTGATTTTA1920AMCATTCTCGGACACAMCTCGAGTACMCTATMCTCACACAATGTAT1980AGACAAACMMGMTGGMTCAMGCTMCTTCAAMTT CGCCACMCA2040ATCCGTTCMCTAGCAGACCATTATCMCAAMTACTCCA ATTGGCGATG2100TTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAMGATC2160GCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTMCTGCTGCTGGGATTACAC2220TGAGCTCTACAMTGAATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTG2280TTGACAACMCATGCACMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCT2340CTTCGGACCTGTCTGGACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACT2400ACTCTTCGCCAATGGCTGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGG2460AGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGAAG2520CGACAGGCTGTTGTGGGCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCG2580CGACGACGCGAAGTACGACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGT2640CGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATT CTCCATCTCCCTCAACCTCT2700CACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCT2760GTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCT2820CGAGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAG2880AGGCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMG2940GGAGGGGTTGTCGGTCATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGA3000CTTCGCTCGCAGCTCGGCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCA3060TAGCTCGACTAGTGCGMCGMGGAAMGACCGGGCCACGCACGTCGGCT3120TGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCCTCCTCCTGCTT3173:6(博來(lái)霉素抗性基因ble)TGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTC60CCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGT120ACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGAC180CCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAG240CGMCTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAG300GGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCC360ACTGA375:7(博來(lái)霉素抗性基因ble)
MCMGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC60
AGCAGACCTG CGMCGMCT CTTCGTCAGC TCGMGCTTG AMGACTCGC120
TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC180
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CN 102268431 A
說(shuō)明書20/21頁(yè)
012345678901234567890123456789012345678 888888888899999999990000000000111111111 333333333333333333334444444444444444444
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22 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTGTACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCATCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGAGACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTCGAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500 CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGGGTMGGAAMGACTCACGTTTCGAGGC1560 CGCGATTAMTTCCMCATGGATGCTGATTTATATGGGTATAMTGGGCTCGCGATMTG1620 TCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGMGCCCGATGCGCCAGAGTTGT1680 TTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAA1740 ACTGGCTGACGGMTTTATGCCTCTTCCGACCATCMGCATTTTATCCGTACTCCTGATG1800 ATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGMGMT1860 ATCCTGATTCAGGTGAAMTATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATT1920 CGATTCCTGTTTGTMTTGTCCTTTTMCAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGC1980 MTCACGMTGMTMCGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCT2040 GGCCTGTTGAACMGTCTGGAMGAAATGCATMGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAG2100 TCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAMTTMTAG2160 GTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTAT2220 GGMCTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAMCGGCTTTTTCAAAMTATGGTA2280 TTGATMTCCTGATATGMTAMTTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAA2340 TGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGAACGAGTGTAAGGCTATCTTGACMCMCATGCAC2400 MTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGGA2460 CGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCAATGGCT2520 GTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGGAAACMGAGMGGGMGGGCGATGGCT2580 GCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGG2640 CGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGAAGTACG2700 ACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGG2760 CGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCG2820 TTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCT2880 CGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTCG2940 ATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMGGCGATCTGTACGAGC3000 GCGAGGAGGCCGTGCGCTTGAACTGGCGCGMGGGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTCA3060 TAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCGG3120 CAACTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCGA3180 ACGMGGAMAGACCGGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACC3240 CGCCTCCGCTTCTCCTCCTC CTGCTT326權(quán)利要求
1.乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動(dòng)子，簡(jiǎn)寫為pRtUra3，其核苷酸序列具有如SEQID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列自3，-末端起900bp以內(nèi)的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的序列，或?qū)EQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動(dòng)子活性的序列。
2.—種權(quán)利要求1所述乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列可作為啟動(dòng)子用于構(gòu)建新型酵母遺傳操作系統(tǒng)及新的重組工程菌株，所得到的基因工程菌株攜帶相應(yīng)的PRtura3序列。
3.按照權(quán)利要求2所述乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于所述基因工程菌株為紅冬孢酵母屬(Miodosporidium)基因工程菌株，所述新型酵母遺傳操作系統(tǒng)為圓紅冬孢酵母遺傳操作系統(tǒng)。
4.一種DNA構(gòu)建體，含有權(quán)利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列，或同時(shí)含有權(quán)利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列和如SEQ ID NO :2所示的脫氧核苷酸序列，且SEQ ID NO :1所示序列位于SEQ ID NO :2所示序列的上游，SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO 2之間為一編碼基因的開放閱讀框架。
5.按照權(quán)利要求4構(gòu)建體，其特征在于所述的SEQID NO :2所示序列為一種乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脫羧酶終止子Rtura3t。
6.一種攜帶權(quán)利要求1啟動(dòng)子PRtFBA或權(quán)利要求4構(gòu)建體的載體。
7.按照權(quán)利要求6載體，其特征在于所述載體為質(zhì)粒載體。
全文摘要
通過(guò)擴(kuò)增圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因組DNA上下游序列，進(jìn)行生物學(xué)信息分析和功能驗(yàn)證，獲得可有效表達(dá)目的基因于圓紅冬孢酵母，并因此能夠用于圓紅冬孢酵母遺傳工程操作和菌株改良的啟動(dòng)子和終止子。本發(fā)明還涉及包含這些元件的DNA構(gòu)建體和載體。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102268431SQ20101018972
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者趙宗保, 楊帆, 張素芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所