專(zhuān)利名稱：金黃色葡萄球菌截短SasA蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一個(gè)金黃色葡萄球菌MsA基因及其編碼蛋白以及作為亞單位疫苗在金黃色葡萄球菌感染預(yù)防方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是一種重要的革蘭氏陽(yáng)性條件致病菌，最常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染是局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心臟內(nèi)膜炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。大面積燒傷、需進(jìn)行血液透析的患者、早產(chǎn)兒及其他免疫力低下的人群是金黃色葡萄球菌的易感人群。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究結(jié)果表明，燒傷面積大于30%者，40%并發(fā)金黃色葡萄球菌引起的膿毒癥，其中20%的患者最終轉(zhuǎn)為多器官功能障礙綜合癥，50%以上死亡。另?yè)?jù)報(bào)道75%的早產(chǎn)兒膿毒癥是由金黃色葡萄球菌引起的。金黃色葡萄球菌感染的經(jīng)典治療是使用抗生素，而多種抗生素抗性菌株的出現(xiàn)，特別是甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌菌株的迅速蔓延和萬(wàn)古霉素抗性金黃色葡萄球菌菌株的出現(xiàn)，使得疫苗的研制變得更為迫切。金黃色葡萄球菌的疫苗研制的最大障礙是金黃色葡萄球菌的毒力因子很多，包括多種毒素、多種粘附分子和莢膜等。金黃色葡萄球菌的MsA蛋白表達(dá)在金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上，全長(zhǎng)由1759個(gè)氨基酸組成，分子量約為193kDa。目前有關(guān)該蛋白的功能報(bào)導(dǎo)還非常少。由于金黃色葡萄球菌毒力相關(guān)蛋白很多，毒力蛋白在臨床分離的菌株中的分布也不一致，目前還沒(méi)有有效的針對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白疫苗。目前進(jìn)入臨床的針對(duì)金黃色葡萄球菌的疫苗是將金黃色葡萄球菌的莢膜多糖CP5和CP8與銅綠假單胞菌的外毒素A偶聯(lián)制成的，在血液透析病人進(jìn)行的三期臨床結(jié)果顯示該疫苗存在一定的有效性。但該疫苗存在的主要問(wèn)題是需要對(duì)莢膜多糖進(jìn)行提取，制備過(guò)程復(fù)雜。選擇金黃色葡萄球菌的保護(hù)性抗原開(kāi)發(fā)基因工程蛋白疫苗是金黃色葡萄球菌疫苗研究的方向。在對(duì)金黃色葡萄球菌的多個(gè)毒力蛋白的免疫保護(hù)效果進(jìn)行分析后，截短&isA被發(fā)現(xiàn)是保護(hù)效果最好的蛋白。本研究擬在大腸桿菌中的可溶性高表達(dá)制備具有天然構(gòu)象的亞單位疫苗，并對(duì)該疫苗的免疫劑量、免疫效價(jià)、保護(hù)效果等方面進(jìn)行研究并進(jìn)一步探索截短的&isA作為亞單位疫苗可行性，為下一步深入制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗奠定基石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)經(jīng)優(yōu)化后可以在大腸桿菌中進(jìn)行高效可溶性表達(dá)且能夠激發(fā)機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的金黃色葡萄球菌截短MsA基因及其編碼蛋白在金黃色葡萄球菌亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的金黃色葡萄球菌截短MsA基因，名稱為tSasA，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No. 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No. 2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID No. 1由882個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第882堿基， 編碼具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。所述金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼的蛋白tSasA，是下述氨基酸殘基序列之1)序列表中的 SEQ ID No. 2 ；2)將序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO. 2由294個(gè)氨基酸殘基組成。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以使非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。含有本發(fā)明基因金黃色葡萄球菌截短MsA基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以pET21a(+)為載體，構(gòu)建的含有金黃色葡萄球菌截短MsA基因tMsA的重組原核表達(dá)載體為pET21a-t&isA。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白tSasA的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)上述金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白t&isA的方法是將上述含有金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼t&isA重的組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白tSasA。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E.coli DH5 α、Ε· coli BL21 (DE3)、Ε· coli BL21 (DE3)pLysS或 Ε. coliToplO 等。上述重組均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有金黃色葡萄球菌截短MsA基因t&isA的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件， 均可為培養(yǎng)出宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌時(shí)需加入誘導(dǎo)劑， 如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0. 1-1. OmM，優(yōu)選為0. 2mM，誘導(dǎo)溫度為16_37°C，優(yōu)選為 37°C，誘導(dǎo)時(shí)間為4-8h，優(yōu)選為他。本發(fā)明提供了一種金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白tSasA的純化方法，可通過(guò)QFF柱和鎳柱兩步純化獲得較高純度的蛋白。本發(fā)明的金黃色葡萄球菌截短MsA基因所編碼的蛋白可用于制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗。需要的時(shí)候，以金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白制備的金黃色葡萄球菌亞單位疫苗還可以融入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激劑因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN- Y )、白介素2 (IL-2)、TGF- β 4等一種或多種細(xì)胞因子的基因或蛋白質(zhì)作為分子免疫佐劑。本發(fā)明的疫苗可以制成注射液、干粉針劑或噴霧劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述亞單位疫苗的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中亞單位疫苗的常規(guī)劑量，如1-10 μ g，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)金黃色葡萄球菌截短&isA基因編碼蛋白的方法。根據(jù)金黃色葡萄球菌S. aureus MASA252株的測(cè)序結(jié)果(GenBank BX571856. 1)，設(shè)計(jì)引物以S. aureus 12598菌株的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到編碼金黃色葡萄球菌&isA 48-333aa的基因，序列如SEQ ID No. 1，其編碼的蛋白序列如SEQ ID No. 2。 在t&isA序列的兩端分別加入NdeI和BioI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增得到的基因經(jīng)雙酶切后連接入表達(dá)載體pET21a(+)中，重組金黃色葡萄球菌tSasA在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了可溶性高表達(dá)，目的蛋白占碎菌上清總蛋白的約30%。經(jīng)QFF柱和鎳柱兩步純化后，目的蛋白純度可達(dá)85 %以上，。通過(guò)本發(fā)明的方法制備的重組蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，抵御致死劑量金黃色葡萄球菌的攻擊。本發(fā)明在金黃色葡萄球菌重組亞單位疫苗的大規(guī)模高效制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為金黃色葡萄球菌tSasA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的可溶性表達(dá)的 SDS-PAGE蛋白電泳圖。其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為表達(dá)金黃色葡萄球菌tSasA的 BL21(DE3)碎菌上清；2為空載體碎菌上清。圖2為經(jīng)QFF柱和鎳柱兩步純化后得到的tSasA的SDS-PAGE蛋白電泳圖。圖3為金黃色葡萄球菌tMsA蛋白免疫BALB/c小鼠后檢測(cè)血清中的抗體滴度。圖4為金黃色葡萄球菌t&isA蛋白免疫后BALB/c小鼠在致死劑量金黃色葡萄球菌感染后的存活曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一、金黃色葡萄球菌截短MsA基因片段獲得根據(jù)報(bào)導(dǎo)的Maphylococcus Aureus MASA252 株的序列(GenBank :ΒΧ571856· 1)， 對(duì)基因編碼的蛋白全長(zhǎng)進(jìn)行分析后，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增142-999bp片段，在tSasA序列的兩端分別加入NdeI和B10I酶切位點(diǎn)，并去除終止密碼子，在3’端引入編碼6個(gè)組氨酸的序列。實(shí)施例二、金黃色葡萄球菌截短&isA表達(dá)載體構(gòu)建將擴(kuò)增得到的t&isA基因用NdeI和XhoI雙酶切后，連接入同樣用NdeI和XhoI 雙酶切后的表達(dá)載體pET21a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單克隆于5mL LB (Amp+)培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，NdeI和XhoI雙酶切鑒定目的基因的插入，并送測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET21a-t&iSA。實(shí)施例三、金黃色葡萄球菌截短MsA的大腸桿菌表達(dá)及western-blot鑒定正確連接入t&isA基因的pET21a(+)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)， 挑取單克隆于5mL LB (Amp+)液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600nm ^0.6時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG，28°C，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)乩。5，000g，4°C離心收集菌體，用PBS重懸后超聲碎菌。12，000g，4°C離心取上清，行SDS-PAGE電泳，以空載體表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照，鑒定大小為40kDa的t&isA蛋白的表達(dá)。Western-blot分析tSasA蛋白與鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體的特異性結(jié)合。將含有 tSasA蛋白的超聲碎菌上清及空載體碎菌上清行SDS-PAGE蛋白電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含3% BSA的PBS室溫封閉Ih后，加入1 1000稀釋的鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體，37°C反應(yīng)lh。將膜用PBST洗滌4遍后，加入1 5000稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗，37 V反應(yīng)Ih后PBST洗滌4遍，采用化學(xué)發(fā)光法顯色、壓片、曝光。從圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，與空載體對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化有pET21a-t&iSA質(zhì)粒的菌株在40kDa左右有明顯的條帶，western-bolt結(jié)果證實(shí)該蛋白可與鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，說(shuō)明該條帶即為tSasA目的條帶。經(jīng)薄層掃描分析目的蛋白約占碎菌上清總蛋白的20%，說(shuō)明t&isA蛋白在大腸桿菌中得到了高效可溶性表達(dá)。實(shí)施例四、金黃色葡萄球菌tSasA的大腸桿菌發(fā)酵及純化表達(dá)tSasA蛋白的種子液1L，轉(zhuǎn)接入30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至0D600nm竺0. 6時(shí)， 加入終濃度為ImM的IPTG，37°C，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)乩。10，000g，4 °C離心收集菌體，用 20mMTris-HCl緩沖液(pH8. 5)重懸后勻漿碎菌。20，000g，4°C離心收集上清。上清液過(guò)QFF 柱進(jìn)行陰離子交換，流出液用20mM NaH2PO4,0. 5M NaCl (pH7. 4) 3倍稀釋后進(jìn)行鎳柱純化，用 20mM NaH2PO4,0. 5M NaCl，0. 5M咪唑(pH7. 4)進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。經(jīng)過(guò)兩步純化后，目的蛋白t&isA得到了很好的純化，純度可達(dá)85%以上(圖2)，目的蛋白最終保存在PBS緩沖液中。實(shí)施例五、tSasA蛋白的免疫原性研究按10μ g/只小鼠的tSasA蛋白與鋁佐劑混勻后，4°C吸附過(guò)夜，腹腔免疫6_8周齡BALB/c小鼠，每?jī)芍苊庖咭淮?，共免疫三次，第二次和第三次免疫?天取血檢測(cè)血清中的抗體滴度；抗體滴度的測(cè)定采用ELISA的方法，金黃色葡萄球菌t&isA蛋白2μ g/mL， 100 μ L/孔包被96孔酶聯(lián)板，4°C包被過(guò)夜。PBST洗滌4次，5min/次。將抗血清用PBST從 1 100依次倍比稀釋后，加入酶聯(lián)板中，37°C反應(yīng)lh，同時(shí)設(shè)PBS免疫后的血清為對(duì)照。 PBST洗滌4次，5min/次。加入HRP-抗小鼠鼠二抗，37°C反應(yīng)30_40min。加入TMB顯色液， 50 μ L/孔，顯色后用2MH2S04終止，酶標(biāo)儀450nm測(cè)定光吸收值。以加入陰性對(duì)照血清孔的顯色值為對(duì)照，以0D450nm大于0. 1且高于陰性孔2倍為陽(yáng)性稀釋滴度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，t&isA組的抗體滴度基本在1 128000以上。實(shí)施例六、tSasA蛋白免疫可避免致死劑量金黃色葡萄球菌引起的小鼠死亡。挑取金黃色葡萄球菌菌株USA300單克隆接種至5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、 220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1 100轉(zhuǎn)種至200mL應(yīng)用肉湯培養(yǎng)基中，37°C、220rpm培養(yǎng)證， SOOOrpm離心收集菌體，菌體沉淀用IOOmL PBS洗滌兩遍，然后用IOmL PBS重懸，用比濁法測(cè)定菌體濃度。調(diào)整菌體濃度為SXlOicVmLt5取tSasA蛋白三次免疫的小鼠，腹腔注射金黃色葡萄球菌USA3003X IO9/只小鼠，觀察小鼠的存活。tMsA蛋白免疫小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)較好， 小鼠存活率顯著高于對(duì)照組，具有很好的預(yù)防效果。SEQ ID No. 1<110>軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>金黃色葡萄球菌截短MsA蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及應(yīng)用<160>權(quán)利要求
1.截短的金黃色葡萄球菌MsA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No. 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No. 2的蛋白序列；3)與序列表中SEQID No. 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID No. 2 ；2)將序列表中SEQID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求2或3所述金黃色葡萄球菌MsA基因編碼蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌MsA基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到金黃色葡萄球菌MsA基因編碼蛋白。
6.權(quán)利要求2或3所述金黃色葡萄球菌MsA基因編碼蛋白在制備破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在大腸桿菌中高效表達(dá)金黃色葡萄球菌截短的SasA(Serine-rich adhesion forplatelets)蛋白的方法。根據(jù)GenBank報(bào)導(dǎo)的金黃色葡萄球菌SasA基因全長(zhǎng)序列(GenBankBX571856.1)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增金黃色葡萄球菌SasA基因的142-999bp，擴(kuò)增得到的基因序列如SEQ ID No.1，其編碼的蛋白序列如SEQ ID No.2。擴(kuò)增得到的SasA基因經(jīng)雙酶切后連接入表達(dá)載體pET21a(+)中，重組SasA蛋白在大腸桿菌中獲得了可溶性高表達(dá)，目的蛋白占碎菌上清總蛋白的約20％。經(jīng)QFF柱、鎳柱純化后，目的蛋白純度可達(dá)85％以上。通過(guò)本發(fā)明的方法制備的重組蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，抵御致死劑量金黃色葡萄球菌引起的小鼠死亡。本發(fā)明在金黃色葡萄球菌重組亞單位疫苗的大規(guī)模高效制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102268444SQ20101019095
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者于婷, 于長(zhǎng)明, 付玲, 任軍, 侯利華, 徐俊杰, 易紹瓊, 陳薇 申請(qǐng)人:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所