專利名稱：一種基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf因子的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)菌復(fù)活促進(jìn)因子(Rpf因子)的表達(dá)與純 化，特別涉及一種基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、Rpf因子的功能與結(jié)構(gòu)Rpf (Resuscitation-promoting factor, Rpf)是一種細(xì)菌復(fù)活促進(jìn)因子，其功能 類似于真核生物的生長因子，可以在皮克(10_12)水平以自分泌和旁分泌形式促進(jìn)休眠菌的 復(fù)活和生長，所以被稱為細(xì)菌的生長因子。該因子最初是在藤黃微球菌(M. luteus)中發(fā) 現(xiàn)，Rpf因子除能促使休眠菌復(fù)活和生長以外，對正常生長的細(xì)菌也有相應(yīng)的效果；其機(jī)制 可能是參與了細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前已查明了 Rpf氨基酸順序并確定了編碼這種蛋白的 基因，相似的Rpf基因廣泛分布在高G+C%含量的革蘭氏陽性菌中。藤黃微球菌Rpf蛋白理論上是一個分子量為19kD的蛋白質(zhì)，氨基端是由75個氨 基酸殘基組成的保守區(qū)，三級結(jié)構(gòu)具有溶菌酶樣折疊，形成一個能與寡聚糖結(jié)合的裂隙，在 第54位有一個非常保守的谷氨酸殘基，推測其有催化功能。保守區(qū)氨基酸序列與結(jié)核分枝 桿菌Rpf樣蛋白相似(75%的氨基酸殘基相同)；羧基端是可變區(qū)，由109個氨基酸殘基組 成，包括與細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)合的LysM結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域有結(jié)合細(xì)胞壁的能力；兩個結(jié)構(gòu)域由 較短的連接區(qū)連接。Viktoria等研究琥珀中分離的藤黃微球菌發(fā)現(xiàn)它的Rpf的保守區(qū)和 可變區(qū)與實(shí)驗(yàn)室保存菌株區(qū)別不大，但連接區(qū)區(qū)別較大，保存菌株的連接區(qū)只有10個氨基 酸而分離菌有120個氨基酸之多，推測可能是環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果；分離菌另一個特點(diǎn)是Rpf結(jié) 合到細(xì)胞壁上，而不釋放到周圍環(huán)境，分離菌抗溶菌酶能力也比保存菌強(qiáng)。Mukamolova等通過實(shí)驗(yàn)證明了藤黃微球菌Rpf蛋白具有胞壁溶解活性當(dāng)表達(dá)并 分泌到細(xì)胞質(zhì)中能夠引起大腸埃希氏菌裂解；能夠從熒光胺標(biāo)記的細(xì)胞壁上釋放熒光；能 水解人工合成的溶菌酶底物；能水解藤黃微球菌細(xì)胞壁粗提物；使含有細(xì)胞壁粗提物的聚 丙烯酰胺凝膠形成透明圈。他們測定的Rpf溶菌活性只有溶菌酶的五十分之一，另外，藤黃 微球菌Rpf還有弱的胰蛋白酶樣活性；當(dāng)改變Rpf多肽鏈的第54位的谷氨酸時，其水解肽 聚糖的活性降低。大腸桿菌表達(dá)體系中獲得的Rpf往往以包涵體形式存在，純化過程必須先變性再 復(fù)性才能得到該蛋白，這樣劇烈的條件難以保證Rpf的生物活性。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近 年發(fā)展起來的高效分泌表達(dá)系統(tǒng)，可對目的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾。該表達(dá)系統(tǒng)不含有特異 性的病毒，不產(chǎn)生毒素，基因工程操作簡便，大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，成本低廉。畢赤酵母表達(dá) 系統(tǒng)的另一優(yōu)越性就是系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，不需復(fù)雜的破菌過程，且上清 中雜蛋白含量很低，這不但使目的蛋白易于純化，同時也有益于保持目的蛋白的生物學(xué)活 性。目前已有200多種重組蛋白在該系統(tǒng)中表達(dá)。2、結(jié)核病臨床診斷中存在的問題目前我國常規(guī)的TB診斷方法仍是結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)合抗酸染色和分離培養(yǎng)。結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)合抗酸染色的方法準(zhǔn)確率較高，但漏檢率亦高，其主要原因是人群普遍接種BCG 后，結(jié)核菌素試驗(yàn)的診斷價值已大大降低，常用的涂片染色鏡檢法是抗酸染色法，屬低敏感 性方法，陽性率不到40%。另外，抗酸性是分枝桿菌屬的特征，并非結(jié)核菌種的特性。因此， 涂片染色鏡檢陽性時，應(yīng)僅報告抗酸桿菌陽性，但臨床上往往是將“抗酸桿菌陽性”等同于 “結(jié)核菌陽性”，這實(shí)際上是臨床醫(yī)生結(jié)合其它有關(guān)的臨床資料的綜合診斷，并非細(xì)菌學(xué)的 認(rèn)定。有報道指出，臨床診斷為TB的細(xì)菌分離株中，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)有2% 5%為非結(jié)核分 枝桿菌。分離培養(yǎng)的檢出率也很低，尤其對于持留菌、休眠菌及代謝異質(zhì)菌無法成功培養(yǎng)。國內(nèi)外近年來嘗試建立了幾種新的診斷方法，如通過檢測抗MTB抗體或通過PCR 法檢測MTB的核酸等來輔助診斷結(jié)核病，這些方法的敏感性較前述方法高，但檢出率一般 也僅在70%左右，而且假陽性率亦較高。同時由于耐藥菌株的大量出現(xiàn)，治療需要藥物敏感 實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)，雖然利用基因芯片、單鏈構(gòu)象多態(tài)性等方法可以進(jìn)行快速耐藥菌株鑒定，但由 于一些引起耐藥的基因突變位點(diǎn)尚不清楚、一些突變位點(diǎn)為無意義突變、新抗生素使用等， 使其敏感性不足80%，且試驗(yàn)結(jié)果必須用表型方法驗(yàn)證。所以常規(guī)藥物敏感實(shí)驗(yàn)仍是臨床 上最常采用的方法。目前國內(nèi)尚無適用于臨床TB病人的簡便、敏感、特異的檢驗(yàn)方法。一些新的檢驗(yàn) 方法雖然敏感性提高，但特異性下降，同時這些方法多針對結(jié)核分枝桿菌的，因此僅適用于 開放性活動性結(jié)核，而不適用于非開放感染。目前MTB感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是細(xì)菌培養(yǎng)和 痰涂片直接鏡檢。分離培養(yǎng)是較敏感的方法，可檢出菌量為100菌落形成單位/毫升(cfu/ mL)的細(xì)菌，MTB的培養(yǎng)檢查常常作為TB診斷的參照方法或金標(biāo)準(zhǔn)。 因此，無論是要進(jìn)行TB診斷還是有關(guān)的藥物敏感實(shí)驗(yàn)，都首先要分離到MTB。臨床 檢驗(yàn)上常規(guī)MTB的分離培養(yǎng)存在的主要問題是敏感性低和所需時間太長。MTB生長緩慢，普 通細(xì)菌約20分鐘分裂一次，MTB則需20小時才繁殖一代，MTB培養(yǎng)要4 6周時間，很多 臨床分離株、特別是耐藥株原代培養(yǎng)結(jié)束、觀察報告最后為陰性結(jié)果的時間延長到8周。所 以，有必要建立MTB簡便、快速、特異性高的檢測方法，尤其是縮短檢出時間和提高敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種分泌型Rpf因子的制備方法及其應(yīng)用，通過構(gòu)建 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備分泌型的Rpf因子，該蛋白能夠促進(jìn)恥垢分枝桿菌休眠菌的復(fù)蘇和 MTB減毒株H37Ra的生長，能夠促進(jìn)臨床TB病人痰標(biāo)本中MTB的生長，縮短臨床TB診斷的 時間。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種基于酵母表達(dá)系統(tǒng)的分泌型Rpf因子的制備方法，包括以下步驟1)以藤黃微球菌(M，luteus)基因組為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增Rpf 基 因；所述的引物對P為上游弓丨物 P1 gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac ；下游弓|物 P2tcaggcctga ggcaggacga gctcc；2)將PCR擴(kuò)增的Rpf基因用Xhol和NotI雙酶切得到線性化的片段；并將該線性 化片段與被Xhol和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接得到重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf ； 將重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的畢赤酵母，篩選得到整合了目的基因的陽性轉(zhuǎn)化子；3)將陽性轉(zhuǎn)化子在BMGY培養(yǎng)基中30°C、200r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)0D600達(dá)到 2. 0 6. 0時，離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度 為0. 5%,30°C,200r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)96 120h后收集培養(yǎng)上清液；4)將收集的培養(yǎng)上清液通過層析分離純化得到Rpf因子。所述的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf包含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf轉(zhuǎn)染感受態(tài)畢赤酵母為將酶切線性化的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf與感受態(tài)畢赤酵母混合后，滴加于 0. lcm電轉(zhuǎn)杯中，冰水浴5min，于電壓1800V，電容25uF，電阻200 Q條件下電擊轉(zhuǎn)化；電擊后，立即加入lmL濃度為1M預(yù)冷的山梨醇，混勻，30°C條件下靜置2h，涂布于 MD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，直至出現(xiàn)菌落。所述的培養(yǎng)上清液通過凝膠層析分離純化為將收集的培養(yǎng)上清液濃縮后洗脫除鹽，收集包含Rpf因子主峰的粗純化洗脫液； 將收集的粗純化洗脫液經(jīng)濃縮、透析后上樣于陰離子交換層析柱，用含0 lmol/L NaCl的 pH 8.0、20mmol/L Tris-HCl洗脫分離，收集包含純化Rpf因子主峰的洗脫液。一種轉(zhuǎn)化體，宿主細(xì)胞為畢赤酵母Pichia pastoris SMD1168，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外 源性表達(dá)載體是包含Rpf基因的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf。所述的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf是以包含Rpf基因的載體為模板，以引物對P 為引物，PCR擴(kuò)增Rpf基因，然后將Rpf基因用Xhol和NotI雙酶切得到線性化的片段，并 將該線性化片段與Xhol和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接而得到。分泌型的Rpf因子應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)的復(fù)蘇和促生長。所述的結(jié)核分枝桿菌是臨床痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌。分泌型的Rpf因子的濃度為10 1000pM。分泌型的Rpf因子應(yīng)用于恥垢分枝桿菌休眠菌的復(fù)蘇和結(jié)核減毒株H37Ra的促生長。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明通過構(gòu)建包含Rpf因子的畢赤酵母表達(dá)體系，成功表達(dá)出分泌型Rpf因 子；該Rpf因子能夠在PM水平促進(jìn)結(jié)核減毒株的生長。在已完成的40例病人痰標(biāo)本中，當(dāng)培養(yǎng)基中加入Rpf因子后其培養(yǎng)時間比常規(guī)方 法平均縮短一周以上，而且細(xì)菌數(shù)量明顯增加；Rpf因子對結(jié)核減毒株和TB病人痰標(biāo)本最 適作用濃度在100pM范圍內(nèi)。本發(fā)明提供的分泌型Rpf因子有利于建立結(jié)核分枝桿菌快速、敏感的檢測方法， 解決結(jié)核菌生長緩慢和敏感性低的問題，有利于改進(jìn)臨床檢驗(yàn)上常規(guī)MTB的分離培養(yǎng)和藥 物敏感實(shí)驗(yàn)方法，縮短結(jié)核菌檢測所需時間。2、Rpf因子在大腸桿菌表達(dá)體系中往往以包涵體形式存在，純化過程必須先變性 再復(fù)性才能得到該蛋白，這樣劇烈的條件難以保證Rpf因子的生物活性。本發(fā)明通過構(gòu)建 持續(xù)分泌Rpf因子的畢赤酵母表達(dá)體系，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了凝膠層析分離純化，整個過 程沒有使蛋白變性，保證了 Rpf完整的生物活性；本發(fā)明制備的Rpf可以在pM水平促進(jìn)恥垢休眠菌的復(fù)蘇和生長；Rpf對恥垢休眠菌作用的最適濃度在100pM范圍內(nèi)。3、利用本發(fā)明能夠篩選到高表達(dá)的重組酵母菌，重組pPIC-Rpf酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá) 的Rpf因子約占總分泌蛋白量的35% ；目的蛋白的經(jīng)過兩次凝膠層析能夠分離到純度在 90%以上的Rpf因子；而且將篩選得到的高表達(dá)菌株通過5L貝朗發(fā)酵罐誘導(dǎo)表達(dá)，能夠獲得大量的具 有較高生物活性的Rpf因子。


圖1是PCR擴(kuò)增Rpf基因片段的電泳檢測結(jié)果圖；圖2是pPIC9K載體的質(zhì)粒圖譜；圖3是pPIC-Rpf載體經(jīng)XhoI/NotI雙酶切結(jié)果圖；圖4是pPIC-Rpf載體經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果圖；圖5是pPIC-Rpf轉(zhuǎn)染陽性的酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果；圖6是pPIC-Rpf酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清的SDS-PAGE電泳；圖7是pPIC-Rpf酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清的Western-blot分析結(jié)果；圖8是Rpf因子作用下恥垢分枝桿菌的生長曲線；圖9是Rpf因子作用下MTB H37Ra的生長曲線；圖10是痰涂片陽性的TB患者標(biāo)本在Rpf因子作用下的生長曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種分泌Rpf因子(Rpf蛋白)的畢赤酵母表達(dá)體系，在構(gòu)建外源性表 達(dá)載體pPIC-Rpf的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母制備重組子，經(jīng)過抗性篩選得到分泌Rpf蛋 白的畢赤酵母重組子；并對目的基因的表達(dá)和Rpf促M(fèi)TB復(fù)蘇和生長的效果進(jìn)行驗(yàn)證。下 面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。1、Rpf基因的克隆及表達(dá)載體pPIC-Rpf的構(gòu)建根據(jù)GenBank 中的 Rpf 基因序列(NC_012803. 1，GenelD 7985360)設(shè)計并人工合 成引物對P:上游弓丨物 P1 gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac 40;下游弓|物 P2tcaggcctga ggcaggacga gctcc35;其中，上游引物PI包含Xhol酶切位點(diǎn)(ctcRaR)和分泌表達(dá)所需的序列，下游引 物P2包含NotI酶切位點(diǎn)(rcrrccrc)和終止子，由寶生物工程(大連)有限公司合成。以藤黃微球菌(M，luteus)基因組為模板(來自第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院臨床 檢驗(yàn)科)為模板，以引物對P為引物擴(kuò)增目的基因Rpf。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min; 94°C 30s,55°C 40s,72°C 50s，共30個循環(huán)；再于72°C延伸5min?；厥誔CR產(chǎn)物后，進(jìn)行 10g/L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，泳道M為Marker，泳道1為擴(kuò)增的Rpf基 因片段，可以看出PCR擴(kuò)增的Rpf基因片段約為672bp。將Rpf基因片段克隆入pMD18-T載體，送寶生物工程(大連)有限公司測序，Rpf 基因的測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. 1所示，經(jīng)過比較與GenBank報道的完全一致；將測序正確的 載體命名為pMD18-T-Rpf。
將pMD18-T_Rpf質(zhì)粒經(jīng)XhoI/NotI雙酶切回收后用連接試劑盒連接入同樣經(jīng)過 XhoI/NotI 雙酶切的 pPIC9K(Invitrogen.，Catalog no. V175-20 ；pPIC9K 載體質(zhì)粒圖譜如 圖2所示)載體回收連接后的片段，并電轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素100mg/L的LB平板，37°C培養(yǎng)，在同一 平板上隨機(jī)篩選4個菌落，分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過 夜，收菌后提取質(zhì)粒DNA;將提取的質(zhì)粒DNA用Xhol和NotI雙酶切，37°C反應(yīng)兩小時，然后進(jìn)行10g/L的瓊 脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示，泳道M為Marker，泳道1 2為陽性克隆提取質(zhì)粒的 雙酶切，可以看到出現(xiàn)了 672bp的目的基因片段；以提取的質(zhì)粒DNA為模板，以引物對P為引物，按照Rpf基因擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖4所示，泳道M為Marker，泳道1 2為 陽性克隆提取質(zhì)粒的PCR結(jié)果，可以看到出現(xiàn)了 672bp的目的基因片段；將構(gòu)建正確的包含 目的基因片段的載體命名為重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf。2、酵母宿主菌的轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選畢赤酵母(Pichia pastoris)基因表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種新型外源 基因表達(dá)系統(tǒng)，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)易于遺傳操作和培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，又具有對重組蛋白進(jìn) 行正確的折疊和翻譯后加工修飾(如糖基化)等特點(diǎn)，而且畢赤酵母自身分泌的蛋白質(zhì)較 少，有利于外源蛋白的分離純化，蛋白表達(dá)水平高，適宜高密度培養(yǎng)，且具有分泌型表達(dá)的 優(yōu)勢，為工業(yè)化生產(chǎn)和純化提供了極大便利。因此，本發(fā)明采用畢赤酵母作為宿主細(xì)胞。Rpf 因子的畢赤酵母高效真核表達(dá)系統(tǒng)的建立具體為本發(fā)明首先將重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf經(jīng)Sal I酶切(pPIC9K載體中的一個 酶切位點(diǎn))線性化，并應(yīng)用乙醇沉淀法濃縮線性化的pPIC-Rpf載體，使之濃度達(dá)到1 P g/ y L ；然后取80 y L酵母菌感受態(tài)細(xì)胞(His營養(yǎng)缺陷株)與10 y g線性化的重組酵母 表達(dá)載體pPIC-Rpf混合，用加樣器將其滴加于0. lcm電轉(zhuǎn)杯中，冰水浴5min，用Bio-Rad GenePuLser II電轉(zhuǎn)儀于電壓1500V，電容25 y F，電阻200 Q條件下電轉(zhuǎn)化，將pPIC-Rpf 轉(zhuǎn)化到Pichiapastoris SMD1168的基因組中；電擊后，立即加入lmL濃度為1M冰預(yù)冷的山梨醇，混勻，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中， 30°C，靜置2h ；分別取重組的酵母菌液涂布于MD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，直至出現(xiàn)菌落， 篩選得到His+重組克隆(由于畢赤酵母菌在組氨酸脫氫酶位點(diǎn)His4有突變，因而不能合成 組氨酸，不能在不含組氨酸的MD平板上生長，而pPIC9K載體上含有His4基因可與宿主進(jìn) 行互補(bǔ)，使重組轉(zhuǎn)化子獲得合成組基酸的能力，通過不含組氨酸的培養(yǎng)基來選擇轉(zhuǎn)化子)。將篩選得到His+重組克隆分別涂布于G418濃度逐漸升高(0. 25 2. 0mg/ml)的 YPD(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)平板上，涂布0. 25的濃度后再劃線涂布于 更高濃度的平板上，每次涂布30°C培養(yǎng)2 3天，挑取具有G418抗性的菌落，在YPD (含 G418)平板上劃線進(jìn)行純化，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，作為誘導(dǎo)表達(dá)的候選菌株。挑取G418抗性的菌落，以P1和P2為引物，PCR檢測G418抗性的菌落中是否含有 重組的表達(dá)載體，驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)展產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖5所示，泳道M為Marker， 泳道1 2為陽性酵母轉(zhuǎn)化子的PCR結(jié)果，可以看到泳道1 2均出現(xiàn)了 672bp的目的基因片段。本發(fā)明中外源基因是以整合的方式插到酵母的染色體上，PPIC9K含有卡那霉素抗 性基因，在酵母中則抗G418，有文獻(xiàn)報道在大多數(shù)情況下外源基因表達(dá)量與拷貝數(shù)成線性 關(guān)系，故用其篩選導(dǎo)入酵母的多拷貝的重組質(zhì)粒。若多拷貝的表達(dá)單元整合入酵母基因組 中，其對G418的抗性能力就會加強(qiáng)，篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化菌株是期望其分泌的目的蛋白量增 加。本發(fā)明通過提高培養(yǎng)基中G418的濃度來篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化菌株，最終在4mg/mLG418 的平板篩選到工程菌株。3、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與高表達(dá)菌株的篩選將篩選出的酵母轉(zhuǎn)化子接種于250ml BMGY培養(yǎng)基(1 %酵母提取物，2 %胰蛋白 胨，100mmol/L磷酸鉀，p H 6. 0，1. 34% YNB，4X 生物素，1 %甘油)中，30°C、200r/min 培養(yǎng)至0D6QQ = 2. 0 6. 0，在室溫下于1500 3000 Xg離心5min收集菌體；將收集的菌體用BMMY培養(yǎng)基(1 %酵母提取物，2%胰蛋白胨，lOOmmol/L磷酸鉀， pH 6.0，1.34%YNB，4X1(T5%生物素，0.5%甘油)懸浮，30°C、200r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)(BMMY 中 含有甲醇，可以啟動A0X1從而誘導(dǎo)蛋白表達(dá))，每24h取樣并補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5%， 誘導(dǎo)96 120h后收集培養(yǎng)上清液；不同的重組pPIC-Rpf酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，挑選目的蛋白 Rpf因子(20kDa)表達(dá)量大的重組轉(zhuǎn)化子，重組表達(dá)的Rpf因子大于總分泌蛋白量的35% 作為生產(chǎn)菌株。重組pPIC-Rpf酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖6所示，其中， 泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Maker，泳道1 2為正常酵母發(fā)酵液上清；泳道3為BMMY中的 甲醇誘導(dǎo)前發(fā)酵液上清；泳道4為BMMY中的甲醇誘導(dǎo)后的發(fā)酵液上清；經(jīng)過對比可以發(fā) 現(xiàn)，重組轉(zhuǎn)化子在被誘導(dǎo)表達(dá)后，目的蛋白Rpf因子以分泌的形式被表達(dá)，而且其分子量約 為20kDa，同預(yù)計的目的蛋白大小相吻合。經(jīng)凝膠薄層掃描檢測蛋白含量，結(jié)果表明重組 pPIC-Rpf酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)的Rpf因子約占總分泌蛋白量的35%。為了得到大量的Rpf因子，將篩選得到的高表達(dá)菌株通過5L貝朗發(fā)酵罐誘導(dǎo)表 達(dá)，能夠獲得大量的具有較高生物活性的Rpf因子。4、表達(dá)產(chǎn)物Rpf因子的分離純化發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液4000r/min離心30min，收集上清液。上清液用300K超濾膜 超濾，收集濾過液，300K濾膜可以除去發(fā)酵液中的大分子的核酸和蛋白。收集濾過液再用 5K濾膜將濾過液，體積濃縮至發(fā)酵液體積的1/5。發(fā)酵過程中培養(yǎng)基加入了部分無機(jī)鹽，為 了對下一步純化減少影響，使用G25除掉發(fā)酵液中殘留的金屬離子。將濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行S印hadeX-G25柱除鹽用10倍柱體積的10mmol/L、pH8. 0 的磷酸緩沖液平衡S印hadeX-G25柱后上樣，上樣量為柱體積的1/3，然后用相同緩沖液淋 洗，收集包含Rpf 因子主峰的粗純化洗脫液(第一個洗脫峰)；將粗純化洗脫液用PEG20000進(jìn)一步濃縮，透析后上樣于平衡的DEAES印harose Fast Flow陰離子交換層析柱，用含0 lmol/L NaCl的pH 8. 0、20mmol/L Tris-HCl洗脫 目的蛋白，收集主蛋白峰。5、表達(dá)產(chǎn)物Rpf因子的Western-blot鑒定將收集純化的Rpf蛋白與抗Rpf的單克隆抗體(由第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院臨
8床檢驗(yàn)科樊愛林博士饋贈)做免疫印跡檢測，化學(xué)發(fā)光法顯色。結(jié)果如圖7所示，其中，泳 道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Maker，泳道1在相對分子量為20kDa處有一條帶，表明純化的Rpf 因子含有能與Rpf單抗特異性相結(jié)合的表位。6、純化產(chǎn)物Rpf因子對恥垢休眠菌的復(fù)蘇和促生長作用Wayne [Wayne LG. Dormancy of Mycobacterium tuberculosis andlatency of disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1994，13 (11) :908_914.]報道的方法，將 乏氧休眠狀態(tài)的恥垢分支桿菌以1 100比例接種到含有10pM、100pM、1000pM Rpf因子的 LB液體培養(yǎng)基中，同時以不含Rpf因子的培養(yǎng)作為對照；每隔4小時測定培養(yǎng)液的0D_值， 連續(xù)測定44小時，根據(jù)測定結(jié)果繪制生長曲線，結(jié)果如圖8所示橫坐標(biāo)為檢測的時間(h)，縱坐標(biāo)為表示菌含量的0D_檢測值，與對照相比，可 以看出Rpf蛋白能夠促進(jìn)恥垢休眠菌的復(fù)蘇和生長，濃度在100pM時復(fù)蘇作用明顯，且與 1000pM無顯著差別。7、Rpf對MTB H37Ra的復(fù)蘇和促生長作用取羅氏培養(yǎng)基中保存的MTB H37Ra株接種到Sauton’ S培養(yǎng)基中，37°C密封培養(yǎng)2 個月備后，取100iiL轉(zhuǎn)接到5mL 7H9培養(yǎng)基中，加入不同濃度(10pM、100pM、1000pM) Rpf， 37°C條件下培養(yǎng)40天，同時以添加PBS的7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照，每5天測定培養(yǎng)液的 0D600值，根據(jù)測定結(jié)果繪制生長曲線，結(jié)果如圖9所示橫坐標(biāo)為檢測的時間(d)，縱坐標(biāo)為表示細(xì)菌含量的0D600檢測值，與對照相比， 很明顯可以看出Rpf因子能夠促進(jìn)MTB H37Ra的復(fù)蘇和生長；當(dāng)Rpf因子濃度為lOOpmol/ L時，刺激的MTB復(fù)蘇和生長作用明顯，且與lOOOpmol/L無顯著差別。8、Rpf因子對臨床痰標(biāo)本中MTB促生長作用收集痰涂片陽性的TB臨床患者標(biāo)本，用2% NaOH和N_乙酰_L_半胱氨酸消化去 污法處理；加入不同濃度(10pM、100pM、1000pM)Rpf，37°C條件下在Sauton’ S培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，同時以添加PBS的Sauton’ S培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照，每5天測定培養(yǎng)液的0D600值(連 續(xù)觀察40天)，繪制生長曲線，觀察Rpf因子對臨床標(biāo)本分離的MTB促生長作用；結(jié)果如圖 10所示橫坐標(biāo)為檢測的時間(d)，縱坐標(biāo)為表示菌含量的0D600檢測值，與對照相比，可 以看出Rpf因子能夠促進(jìn)臨床標(biāo)本中MTB的生長；當(dāng)Rpf因子濃度為lOOpmol/L時，刺激 MTB臨床標(biāo)本復(fù)蘇和生長作用明顯，且與1000pM無顯著差別。在已完成的40例病人標(biāo)本檢 測中，當(dāng)培養(yǎng)基中加入Rpf因子后其培養(yǎng)時間比常規(guī)方法平均縮短一周以上，這樣就縮短 了 TB診斷中分離、培養(yǎng)MTB的時間，有利于TB的簡便、快速鑒定。核苷酸序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)<120> 一種基于酵母表達(dá)系統(tǒng)的分泌型Rpf因子的制備方法及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>672<212>DNA<213> 藤黃微球菌(M. luteus)
<400>1
atggacaccatgactctctt caccacttccgccacccgct cccgccgtgccaccgcctcg60
atcgtcgcgggcatgaccct cgccggcgccgccgccgtgg gcttctccgccccggcccag120
gccgccaccgtggacacctg ggaccgcctcgccgagtgcg agtccaacggcacctgggac180
atcaacaccggcaacggctt ctacggcggcgtgcagttca ccctgtcctcctggcaggcc240
gtcggcggcgaaggctaccc gcaccaggcctcgaaggccg agcagatcaagcgcgccgag300
atcctccaggacctgcaggg ctggggcgcg tggccgctgt gctcgcagaagctgggcctg360
acccaggctgacgcggacgc cggtgacgtg gacgccaccg aggccgccccggtcgccgtg420
gagcgcacggccaccgtgca gcgccagtccgccgcggacg aggctgccgccgagcaggcc480
gctgccgcggagcaggccgt cgtcgccgag gccgagacca tcgtcgtcaagtccggtgac540
tccctctggacgctcgccaa cgagtacgag gtggagggtg gctggaccgccctctacgag600
gccaacaagggcgccgtctc cgacgccgccgtgatctacg tcggccaggagctcgtcctg660
ccgcaggcctga67權(quán)利要求
一種基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf因子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)以包含Rpf基因的載體或基因組為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增Rpf基因；所述的引物對P為上游引物P1gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac 40；下游引物P2tagcggccgc tcaggcctga ggcaggacga gctcc 35；2)將PCR擴(kuò)增的Rpf基因用XhoI和NotI雙酶切得到線性化片段；并將該線性化片段與被XhoI和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接得到重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf；將重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的畢赤酵母，篩選得到整合了目的基因的陽性轉(zhuǎn)化子；3)將陽性轉(zhuǎn)化子在BMGY培養(yǎng)基中30℃、200r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到2.0～6.0時，離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5％，30℃、200r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)96～120h后收集培養(yǎng)上清液；4)將收集的培養(yǎng)上清液通過層析分離純化得到Rpf因子。
2.如權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf因子的制備方法，其特征在于，重組酵 母表達(dá)載體PPIC-Rpf包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf因子的制備方法，其特征在于，重組酵 母表達(dá)載體pPIC-Rpf轉(zhuǎn)染感受態(tài)畢赤酵母為將酶切線性化的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf與感受態(tài)畢赤酵母混合后，滴加于0. Icm 電轉(zhuǎn)杯中，冰水浴5min，在電壓1800￥、電容251^、電阻200 0條件下電擊轉(zhuǎn)化；電擊后，立即加入Iml濃度為IM預(yù)冷的山梨醇，混勻，30°C條件下靜置2h，涂布于MD平 板，30°C培養(yǎng)2 3天，直至出現(xiàn)菌落。
4.如權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf因子的制備方法，其特征在于，所述的 培養(yǎng)上清液通過凝膠層析分離純化為將收集的培養(yǎng)上清液濃縮后洗脫除鹽，收集包含Rpf因子主峰的粗純化洗脫液；將收 集的粗純化洗脫液經(jīng)濃縮、透析后上樣于陰離子交換層析柱，用含O lmol/L NaCl的pH 8. 0、20mmol/L Tris-HCl洗脫分離，收集包含純化Rpf因子主峰的洗脫液。
5.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，該轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞為畢赤酵母Pichia pastoris SMDl 168，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體是包含Rpf基因的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的重組酵母表達(dá)載體pPIC-Rpf是以 包含Rpf基因的載體為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增Rpf基因，然后將Rpf基因用XhoI 和NotI雙酶切得到線性化的片段，并將該線性化片段與XhoI和NotI雙酶切的pPIC9K載 體片段連接而得到。
7.分泌型的Rpf因子應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的復(fù)蘇和促生長。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的結(jié)核分枝桿菌是臨床痰標(biāo)本中的結(jié) 核分枝桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，分泌型的Rpf因子的濃度為10 ΙΟΟΟρΜ。
10.分泌型的Rpf因子應(yīng)用于恥垢分枝桿菌(Msmegmatis)和結(jié)核休眠菌的復(fù)蘇與促 生長。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于轉(zhuǎn)化體的分泌型Rpf因子的制備方法及其應(yīng)用，在構(gòu)建外源性表達(dá)載體pPIC-Rpf的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母制備重組子，經(jīng)過抗性篩選得到分泌Rpf蛋白的畢赤酵母重組子。該畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠持續(xù)分泌具有生物活性的Rpf蛋白，該蛋白能夠促進(jìn)恥垢分枝桿菌休眠菌的復(fù)蘇和結(jié)核分枝桿菌H37Ra的生長，促進(jìn)臨床TB病人痰標(biāo)本中MTB的生長，可用于臨床TB的快速診斷。
文檔編號C12N15/31GK101864433SQ20101019109
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者師長宏, 張海, 李倫, 趙勇 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)