專利名稱：抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗櫛孔扇貝(Chlamys farreri)顆粒血細(xì)胞 的單克隆抗體及其制備方法，屬于貝類細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
貝類缺乏免疫球蛋白和特異性免疫，其免疫防御過程是由血細(xì)胞和血淋巴中的體 液因子協(xié)同完成。血細(xì)胞通過自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化殺傷等方式，達(dá)到識(shí)別、包 裹和清除外來異物的目的；血細(xì)胞還能通過釋放溶菌素、凝集素、調(diào)理素等物質(zhì)來調(diào)理輔 助體液因子免疫，其在貝類抵御外界環(huán)境刺激及外來病原微生物侵襲的過程中起著關(guān)鍵作用。目前貝類血細(xì)胞的分類大多根據(jù)形態(tài)及其染色親和性，胞質(zhì)中細(xì)胞器的多寡、顆 粒的有無而將其分為兩大類透明血細(xì)胞和顆粒血細(xì)胞。透明血細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色很淡，幾乎 不含顆粒或含微量顆粒，極少或完全沒有細(xì)胞器。顆粒血細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中含有數(shù)量不等的染 色顆粒，顆粒為由單層或雙層膜包裹的球形小體，其內(nèi)部含有豐富的活性物質(zhì)，如髓過氧化 物酶、酸性磷酸酶、吞噬素、溶菌酶、葡糖苷酸酶等。大量研究表明無論是透明血細(xì)胞還是顆 粒血細(xì)胞其在抵御病原入侵和機(jī)體免疫修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。有些研究認(rèn)為當(dāng)貝類 受寄生蟲入侵時(shí)，顆粒血細(xì)胞會(huì)大量聚集，通過脫顆粒的方式釋放活性物質(zhì)等來改變和調(diào) 理寄生蟲表面分子結(jié)構(gòu)，并形成包繞寄生蟲的內(nèi)芽瘤或包囊；而透明血細(xì)胞則在造血作用 中較為重要，造血組織腫瘤狀物的增生就來源于透明血細(xì)胞。但是，這兩類血細(xì)胞在功能和 發(fā)生等問題中的作用和地位，一直沒有確切的定論，主要是因?yàn)闆]有合適的分子標(biāo)記物跟 蹤其發(fā)生和參加免疫反應(yīng)的過程。單克隆抗體因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、無交叉性等特點(diǎn)被 成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、高等動(dòng)物免疫細(xì)胞的定位、發(fā)生、分化研究中。最近，應(yīng)用該技術(shù)來研究牡 蠣血細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特性，對(duì)蝦血細(xì)胞的分類、免疫特性和貽貝免疫力的報(bào)道不斷出現(xiàn)。 因此制得抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體，有助于研究顆粒血細(xì)胞在扇貝胚胎發(fā)育中 的發(fā)生、分化和分布，以及顆粒血細(xì)胞與其它類型血細(xì)胞免疫功能上的轉(zhuǎn)換和差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單 克隆抗體；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的研制了一種抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞 的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細(xì)胞株《17，保藏號(hào)為CCTCC NO C201042，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2010年04月21日的雜交瘤 細(xì)胞分泌的。長勢(shì)良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，該 培養(yǎng)基中即含有大量由該雜交瘤細(xì)胞分泌的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體。該單克 隆抗體能與櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞特異性結(jié)合，并與其他組織細(xì)胞無交叉反應(yīng)。
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一種抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其步驟如下抽取櫛孔扇貝 血淋巴經(jīng)離心得到全血細(xì)胞；經(jīng)介質(zhì)密度梯度分離法得到櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞；以顆粒血 細(xì)胞為抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞；經(jīng)間接免疫熒光法 篩選、克隆、進(jìn)一步篩選得到一株能分泌抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 OT7 ；其分泌的抗體即為抗顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體，經(jīng)流式免疫熒光法驗(yàn)證其特性。所述的介質(zhì)密度梯度分離法是Percoll介質(zhì)梯度離心法將櫛孔扇貝全血細(xì)胞懸 液置于不連續(xù)Percoll梯度的頂層，離心分離所得的自上而下的第三層細(xì)胞即為顆粒血細(xì) 胞。所述的間接免疫熒光法是將細(xì)胞融合后所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與櫛孔扇 貝全血細(xì)胞懸液或血滴片反應(yīng)；繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；用熒光 顯微鏡在原位的暗視野與明視野下鏡檢，篩選抗顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體，即單克隆抗體 6H7。所述的流式免疫熒光法是將單克隆抗體6H7與櫛孔扇貝全血細(xì)胞懸液于培養(yǎng)板 孔中反應(yīng)；繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)驗(yàn)證單克 隆抗體6H7所抗的細(xì)胞群確為顆粒血細(xì)胞群。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由雜交瘤細(xì)胞6H7分泌的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗 體能與櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞特異性結(jié)合。長勢(shì)良好的該雜交瘤細(xì)胞具有大小均一，外觀飽 滿，渾圓透亮，分裂旺盛，能無限分泌單一、純凈抗體的特點(diǎn)。該雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基中常規(guī) 培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)基中即含有了大量靈敏度高，效價(jià)好，特異性抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞，且 與其他組織細(xì)胞無交叉性的單克隆抗體?？箼笨咨蓉愵w粒血細(xì)胞單克隆抗體的制得為研究 顆粒血細(xì)胞在扇貝胚胎發(fā)育中的發(fā)生、分化和分布，以及顆粒血細(xì)胞與其它類型血細(xì)胞免 疫功能上的轉(zhuǎn)換和差異提供重要的技術(shù)手段。本發(fā)明的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法是將經(jīng)Percoll介質(zhì)梯 度離心分離所得的顆粒血細(xì)胞(而非全血細(xì)胞)作為抗原免疫BALB/c小鼠；細(xì)胞融合、間 接免疫熒光法篩選、克隆、篩選得到抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體；所得的單克隆抗 體再經(jīng)流式免疫熒光法驗(yàn)證其特性。這樣的制備技術(shù)路線嚴(yán)密合理且可行，充分發(fā)揮了現(xiàn) 有免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法的作用和效果。


圖1為本發(fā)明的經(jīng)Percoll分離后三層細(xì)胞帶流式檢測(cè)和吉姆薩染色的結(jié)果圖。圖2為本發(fā)明的單克隆抗體6H7間接免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明的單克隆抗體6H7流式免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果圖。圖1所示A，B，C分別為經(jīng)Percoll介質(zhì)梯度離心分離后所對(duì)應(yīng)的自上而下的第 一層，第二層，第三層細(xì)胞帶懸液的流式檢測(cè)結(jié)果；a，b，c分別為第一層，第二層，第三層細(xì) 胞帶懸液制成的血滴片的吉姆薩染色結(jié)果。其中G為顆粒血細(xì)胞；H為透明血細(xì)胞。圖2所示A為櫛孔扇貝全血細(xì)胞懸液與單克隆抗體6H7反應(yīng)后熒光(暗視野)檢 測(cè)的結(jié)果；B為原位視野下微分干涉(明視野)檢測(cè)的結(jié)果。其中G為顆粒血細(xì)胞；H為透 明血細(xì)胞。圖3所示A為未經(jīng)單克隆抗體6H7反應(yīng)(陰性對(duì)照)的血細(xì)胞懸液流式檢測(cè)的散點(diǎn)圖；B為經(jīng)單克隆抗體6H7反應(yīng)的血細(xì)胞懸液流式檢測(cè)的散點(diǎn)圖；a為A圖對(duì)應(yīng)的熒光 值波峰圖；b為B圖對(duì)應(yīng)的熒光值波峰圖。其中紅色點(diǎn)線為顆粒血細(xì)胞G ；綠色點(diǎn)線為透明 血細(xì)胞H;N為陰性；P為陽性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 :PerColl介質(zhì)不連續(xù)密度梯度分離櫛孔扇貝全血細(xì)胞l.Percoll 市售原液與 10 倍濃度的抗凝劑(0. 14M NaCl,3mM KCl,8mM Na2HP04, 1. 5mMKH2P04, 20mM EDTA, pH 7. 4)按體積比 9 1 的比例配制 Percoll 應(yīng)用液，再將 Percoll 應(yīng)用液用抗凝劑稀釋至不同的梯度50 % (v/v)，40 %，30 %，20 %和10 %，每種梯度2ml，置 于Percoll離心管中，4°C靜置過夜；2.取8-10只活力健康、體質(zhì)正常的櫛孔扇貝，用滅過菌的干凈注射器從閉殼肌抽 取血淋巴，按體積比為1 :1與預(yù)冷抗凝劑混勻，混合液于4°C，760g，離心lOmin，得到的全血 細(xì)胞沉淀再經(jīng)抗凝劑重懸，調(diào)節(jié)全血細(xì)胞懸液濃度為107cells/ml ；3.取部分全血細(xì)胞懸液滴加到干凈的載玻片上，30 u 1/片，置濕盒中沉降45min， 使其自然形成單層細(xì)胞的血滴片。之后再經(jīng)過濾海水沖洗，室溫干燥，甲醇固定5min，所得 的全血細(xì)胞血滴片于-20°C凍存，供間接免疫熒光法中篩選陽性雜交瘤細(xì)胞之用；4.將全血細(xì)胞懸液鋪于Percoll梯度上，置水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)中2500rpm，4°C，離心 30min ；5.用含長細(xì)針頭的干凈注射器依次取出Percoll梯度中自上而下形成的三層獨(dú) 立細(xì)胞帶，2500rpm, 4°C，離心lOmin去除Percoll介質(zhì)，所得的各層細(xì)胞帶沉淀再用抗凝劑
重懸；6.各層細(xì)胞帶懸液經(jīng)200目篩絹網(wǎng)過濾后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各層細(xì)胞帶中透明 血細(xì)胞和顆粒血細(xì)胞的比例；同時(shí)取部分各層細(xì)胞帶懸液制作單層細(xì)胞滴片，吉姆薩染色 染色，觀察各層細(xì)胞帶的形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖1中A，B，C所示第一層，第二層，第三層細(xì)胞帶中G和 H的比例依次為45 55，11 89，90 10 ；吉姆薩染色結(jié)果如圖1中a，b，c所示第一層 細(xì)胞帶中顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞均大量存在，且存在比例也較為一致，第二層細(xì)胞帶主 要為透明血細(xì)胞，而第三層細(xì)胞帶則主要為顆粒血細(xì)胞。實(shí)施例2 制備抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體1.免疫小鼠取經(jīng)Percoll分離后的第三層細(xì)胞帶懸液為抗原免疫4周齡雌性BALB/c小鼠。每 次免疫劑量為0. 1ml，免疫共分4次進(jìn)行，前2次免疫間隔為2周，后2次免疫間隔為1周， 前2次為腹腔注射，后2次為尾靜脈注射。(1)基礎(chǔ)免疫第三層細(xì)胞帶懸液與福氏完全佐劑等比體積混勻作抗原；(2)加強(qiáng)免疫第三層細(xì)胞帶懸液與福氏不完全佐劑等比體積混勻作抗原；(3) 二次加強(qiáng)免疫第三層細(xì)胞帶懸液作抗原；(4)融合前三天的擴(kuò)增免疫第三層細(xì)胞帶懸液作抗原。2.細(xì)胞融合
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(1)脫頸椎法處死免疫小鼠，無菌取出脾臟和胸腺后，分別過100目網(wǎng)篩，用 RPMI-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；(2)分別將脾細(xì)胞懸液和胸腺細(xì)胞懸液lOOOrpm離心3min，棄去上清液，脾細(xì)胞沉 淀用RPMI-1640溶液重懸，胸腺細(xì)胞沉淀用含有HAT的RPMI_1640(含10%胎牛血清) 選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸；(3)取細(xì)胞密度約為3X107的，處于對(duì)數(shù)生長期的P3-X63_Ag8Ul骨髓瘤細(xì)胞， lOOOrpm離心3min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重懸；(4)將脾細(xì)胞懸液與瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，lOOOrpm離心3min，完全吸去上清 液，輕彈離心管底，使兩種細(xì)胞沉淀充分混勻成糊狀；用吸管吸取預(yù)溫到37°C的聚乙二醇 溶液1ml，滴加到離心管內(nèi)，在lmin內(nèi)加完；然后在37°C水浴靜置5min ；(5)繼續(xù)滴加已經(jīng)預(yù)溫到37°C的RPMI-1640溶液15ml，使PEG稀釋而失去作用；(6)補(bǔ)加RPMI-1640溶液至40ml，經(jīng)lOOOrpm離心3min，棄去上清液；(7)將細(xì)胞沉淀用3ml 37°C的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，凍 存 2ml。(8)將剩下的1ml細(xì)胞懸液加入(2)制成的胸腺細(xì)胞懸液，混合均勻后滴加到96 孔培養(yǎng)板中；(9)將培養(yǎng)板放入37°C，C02濃度為4. 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞 生長情況，大約兩周后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)。3.篩選和克隆(1)篩選融合后，等到雜交瘤細(xì)胞群落長到96孔培養(yǎng)板的孔底面積1/3時(shí)開始 檢測(cè)，采用間接免疫熒光法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，步驟如下①取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為第一抗體，滴加在全血細(xì)胞血滴片上，37°C濕盒中 孵育45min ；②取出血滴片，用0. 01M磷酸鹽緩沖液洗3次，5min/次；③洗完后，將異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體，滴加在血滴片上，37°C濕 盒中避光孵育45min ；④取出血滴片，用0. 01M磷酸鹽緩沖液洗3次，5min/次；⑤洗完后，避光干燥，甘油封片，在放大400倍的熒光顯微鏡下觀察。將能使血滴片上的細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光的陽性雜交瘤細(xì)胞群落記錄，作進(jìn)
一步克隆。(2)克隆采用有限稀釋法對(duì)檢測(cè)出的陽性雜交瘤細(xì)胞群落進(jìn)行克隆，步驟如下①脫頸椎法處死小鼠，無菌取出胸腺后，在100目網(wǎng)篩上研磨，用RPMI-1640溶液 吹下形成單細(xì)胞懸液；②將胸腺細(xì)胞懸液lOOOrpm離心3min，細(xì)胞沉淀用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含 10%的胎牛血清)重懸；③待克隆的陽性雜交瘤細(xì)胞孔用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基以 10的整次倍稀釋，取100個(gè)陽性雜交瘤細(xì)胞，加入含有胸腺細(xì)胞的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基懸 液中；④細(xì)胞懸液用滴管吹打均勻，滴加到96孔培養(yǎng)板，使每孔平均含有一個(gè)陽性雜交瘤細(xì)胞，置于37°C，C02濃度為4. 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑤1-2周后再將克隆過的培養(yǎng)板中的各孔雜交瘤培養(yǎng)上清液分別收集，與櫛孔扇 貝全血細(xì)胞懸液反應(yīng)，用間接免疫熒光法篩選抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體。結(jié)果篩選克隆得到1株抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體6H7 (圖2)，該單克隆 抗體能與顆粒血細(xì)胞特異性結(jié)合，但卻不與透明血細(xì)胞反應(yīng)。4.凍存將能分泌單克隆抗體6H7的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待其處于對(duì)數(shù) 生長期時(shí)，用滴管吹打均勻形成細(xì)胞懸液，取900 yl的細(xì)胞懸液與100 yl的凍存液(二甲 基亞砜)混勻，置于2ml凍存管中。將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，置于-80°C超低溫冰 箱中，12h后，浸入液氮內(nèi)長期保存。實(shí)施例3 流式免疫熒光法驗(yàn)證單克隆抗體6H7的特性1.取一干凈的24孔培養(yǎng)板，選2孔，每孔加入細(xì)胞濃度為107cellS/ml的櫛孔扇 貝全血細(xì)胞懸液1ml，繼而分別加入1ml的單克隆抗體6H7和骨髓瘤培養(yǎng)上清液(陰性對(duì) 照)，37°C孵育lh，邊孵育邊吹勻；2.將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4°C，760g，離心5min，細(xì)胞沉淀用抗 凝劑重懸、離心洗滌3次；3.將細(xì)胞懸液再轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板中，再往每孔中加入50 yl的異硫氰熒光素 (FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37°C避光孵育lh，邊孵育邊吹勻；4.將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞懸液再次轉(zhuǎn)移至離心管中，4°C，760g，離心5min，細(xì)胞沉淀 用抗凝劑重懸、離心洗滌3次；5.細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩絹網(wǎng)過濾后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果如圖3所示經(jīng)流式檢測(cè)的全血細(xì)胞懸液明顯可分為兩 群顆粒血細(xì)胞群和透明血細(xì)胞群。全血細(xì)胞懸液在陰性對(duì)照中，熒光值較低；而經(jīng)單克隆 抗體6H7反應(yīng)后，熒光值顯著增加，陽性率高達(dá)86. 8%，其中顆粒血細(xì)胞群高達(dá)71. 8%，而 透明血細(xì)胞群僅為15. 0%，表明單克隆抗體6H7主要與顆粒血細(xì)胞群特異性結(jié)合。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行 修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體是由名稱為小鼠雜交瘤細(xì)胞株6H7，保藏號(hào)為CCTCC NOC201042，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2010年04月21日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。
2.一種如權(quán)利要求1所述的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其特征在 于所述的方法包括如下步驟抽取櫛孔扇貝血淋巴經(jīng)離心得到全血細(xì)胞；經(jīng)介質(zhì)密度梯度 分離法得到櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞；以顆粒血細(xì)胞為抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠 的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞；經(jīng)間接免疫熒光法篩選、克隆、進(jìn)一步篩選得到一株能分泌抗櫛孔 扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞6H7 ；其分泌的抗體即為抗顆粒血細(xì)胞的單克隆 抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的介質(zhì)密度梯度分離法是Percoll介質(zhì)梯度離心法將櫛孔扇貝全血細(xì)胞懸液置于不 連續(xù)Percoll梯度的頂層，離心，自上而下形成的第三層細(xì)胞即為顆粒血細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的間接免疫熒光法是將細(xì)胞融合后所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與櫛孔扇貝全血細(xì) 胞懸液或血滴片反應(yīng)；繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；用熒光顯微鏡在 原位的暗視野與明視野下鏡檢，篩選抗顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體，即單克隆抗體M17。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的雜交瘤細(xì)胞6H7分泌的單克隆抗體經(jīng)流式免疫熒光法驗(yàn)證其特性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的流式免疫熒光法是將單克隆抗體6H7與櫛孔扇貝全血細(xì)胞懸液于培養(yǎng)板孔中反應(yīng)； 繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)驗(yàn)證單克隆抗體 6H7所抗的細(xì)胞群確為顆粒血細(xì)胞群。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為小鼠雜交瘤細(xì)胞株6H7，保藏號(hào)為CCTCC NOC201042，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2010年04月21日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。長勢(shì)良好的該雜交瘤細(xì)胞具有大小均一，外觀飽滿，渾圓透亮，分裂旺盛的特點(diǎn)，其在培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)基中即含有了大量純度高、效價(jià)好、特異性強(qiáng)的單克隆抗體。經(jīng)間接免疫熒光法和流式免疫熒光法檢測(cè)，結(jié)果顯示該單克隆抗體能與櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞特異性結(jié)合。本發(fā)明可用于研究顆粒血細(xì)胞在扇貝胚胎發(fā)育中的發(fā)生、分化和分布，以及顆粒血細(xì)胞與其它類型血細(xì)胞免疫功能上的轉(zhuǎn)換和差異。
文檔編號(hào)C12N5/20GK101863979SQ20101019143
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 林聽聽, 繩秀珍, 婧 邢 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)