專利名稱：植物種子攜帶細(xì)菌性黑斑病致病菌的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病菌檢測，特別是一種植物種子攜帶細(xì)菌性黑斑病菌快速檢測的 方法。
背景技術(shù)：
十字花科細(xì)菌性黑斑病是由丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種引起(Pseudomonas syringaepv. maculicola)，屬于原核生物細(xì)菌界，變形桿菌門，假單胞菌科。該菌短桿狀，大 小為1. 3-3. OymXO. 7-0. 9 μ m，有1_5根極生鞭毛，革蘭氏染色為陰性。寄主主要是十字花 科蔬菜，如白菜、花椰菜、蘿卜等，同時也可為害辣椒、番茄。Pseudomonas syringae pv. maculicola是一種特殊的變種，同其他丁香假單胞桿 菌有較接近的營養(yǎng)需求、致病性和相似的起源，特別是與引起番茄細(xì)菌性病害的丁香假單 胞菌番茄致病變種(P. syringae pv. tomato)在營養(yǎng)條件、致病性和遺傳特征上有著相似 性，寄主范圍重疊，所以在研究初期很難將它們區(qū)別開，傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒別方法如選擇性培養(yǎng) 基篩選基本不起作用。目前較為常見的丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種鑒定方法有脂肪酸分析、LOPAT測試、 Biolog-GN板測試碳源氧化利用、r印-PCR基因指紋分析、RFLP技術(shù)、DNA配對分析、RAPD 和AFLP技術(shù)等。脂肪酸分析表明丁香假單胞菌番茄致病變種、丁香致病變種(P. syringae pv. syringae)、大豆致病變種(P. syringae pv. glycinea)和斑點(diǎn)致病變種的相似系數(shù)最接 近，不易鑒別。而LOPAT測試、Biolog-GN板測試碳源氧化利用和r印-PCR都可用來鑒定丁 香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種。碳源氧化的聚類分析得出丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種和番茄 致病變種被列入了同一組，相似性為79. 5%，但通過碳源氧化GN數(shù)據(jù)無法區(qū)分這2個菌。 rep-PCR遺傳指紋分析有利于快速鑒定分離菌株，對丁香假單胞菌斑點(diǎn)變種的鑒定也較為 準(zhǔn)確。除了丁香假單胞菌番茄致病變種的DC3000菌株和0H314菌株的表型識別與斑點(diǎn)致 病變種的相似外，番茄致病變種的其他菌株可以通過MP-PCR與斑點(diǎn)致病變種區(qū)分。RFLP 技術(shù)也可來分析細(xì)菌種類和致病變種的親緣關(guān)系。防治十字花科細(xì)菌性黑斑病最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一就是播種無菌種。種子帶菌檢 測需要快速、可靠、靈敏的檢測方法。近年來人們主要應(yīng)用PCR的方法來對病菌進(jìn)行鑒定和 檢測。PCR方法敏感度高，特異性強(qiáng)，操作簡單方便，并且PCR產(chǎn)物的生成以指數(shù)方式增加， 能將極微量的靶DNA成百萬倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA。所以理論上它可對單 拷貝基因、單個病菌等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。但在種子帶菌檢測方面，PCR技術(shù)也有其不可否 認(rèn)的局限性，如直接將樣品浸泡液加入反應(yīng)體系，由于種子浸泡液中含有病原細(xì)菌濃度較 低，反應(yīng)體系小，就有可能未使病原菌參與到PCR反應(yīng)中，造成PCR反應(yīng)假陰性。磁性免疫微球(immunomagnetic microsphere-IMMS)是近年發(fā)展起來的一類新型 功能性材料，它是磁性微球(magnetic microsphere-MMS)載體表面通過化學(xué)或物理方法連 接上具有一定免疫活性的物質(zhì)作為配體而研制成的。由于磁性微球粒徑一般很小，比表面 積大，故而偶聯(lián)容量較高，懸浮穩(wěn)定性較好，便于各種反應(yīng)高效而方便的進(jìn)行；又因其具有順磁性，在外電場的作用下固液相的分離十分簡單，可省去過濾、離心等繁雜操作，并可在 磁場作用下定位，方便地進(jìn)行分離同配體相對應(yīng)的物質(zhì)。目前在植物病原菌檢測領(lǐng)域所使用的Real-time PCR (實(shí)時定量PCR)主要是應(yīng)用 TaqMan水解探針作為熒光基質(zhì)的Real-time PCR系統(tǒng)。在TaqMan系統(tǒng)中，使用一個寡核苷 酸探針序列一般長度為25 30核苷酸，其5 ’末端有一個熒光報(bào)告集團(tuán)，通常為6-羥基熒 光素(6-FAM)。3'端有一個熒光淬滅集團(tuán)，通常為6-羥基-4-甲基若丹明(TAMRA)。當(dāng)探 針完整時，由于淬滅熒光集團(tuán)與報(bào)告熒光集團(tuán)彼此接近，可以極大地減少后者發(fā)射出的熒 光。在反應(yīng)的每個循環(huán)，當(dāng)沒有與探針互補(bǔ)的目的序列存在時，探針保持游離。由于TaqDNA 聚合酶的5'核酸外切酶活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針仍保持完整時的熒光信號 不變。當(dāng)有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)時，探針在PCR的變性階段可與其雜交。當(dāng)TaqDNA聚合酶 引導(dǎo)引物向下游延伸時，TaqMan探針因5' -3'外切酶活性而被水解(切口平移效應(yīng))，熒 光集團(tuán)被釋放，從而產(chǎn)生熒光，熒光信號就可以被儀器檢測
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的空白和需求，結(jié)合免疫磁珠吸附技術(shù)和實(shí)時熒光定量 PCR，提供一種植物種子細(xì)菌性黑斑病菌的檢測方法。與單一的種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA 的檢測方法比，更能夠省時、省空間、特異、靈敏。植物種子攜帶細(xì)菌性黑斑病致病菌的快速檢測方法，步驟如下(1)采用免疫磁珠富集待測植物種子浸泡液中的細(xì)菌性黑斑病致病菌；(2)以第(1)所得的富集液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測；所述免疫磁珠上包被的抗體為抗丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種(Pseudomonas syringae pv. maculicola)的Jitf本；所述PCR擴(kuò)增的引物如下正向引物Tl :5，TGCTTTGCACACCCGATTT 3，，反向引物T2 :5，CCCCAAGCAATCTAGGT 3，擴(kuò)增產(chǎn)物為454bp的單一條帶。所述抗體為分離自抗丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種(Pseudomonas syringae pv. maculicola)的抗血清；所述待測種子浸泡液指水浸泡或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液。所述液體培養(yǎng)基指丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種的選擇性培養(yǎng)基。所述選擇性培養(yǎng)基為含有2. 0mg/L利福平、30mg/L氯霉素的KB培養(yǎng)基。所述步驟2之前先將所述富集液煮沸5 15分鐘。所述PCR擴(kuò)增指實(shí)時定量熒光PCR。所述實(shí)時定量PCR的標(biāo)記探針序列為TGCTTTGCACACCCGATTTGG。所述植物種子指十字花科植物種子。本發(fā)明提供植物攜帶細(xì)菌性黑斑病菌的檢測方法，通過制備識別并結(jié)合細(xì)菌性 黑斑病致病致病菌菌的抗體，將該抗體包被磁珠獲得免疫磁珠；采用該免疫磁珠收集待測 種子浸泡液中的靶標(biāo)致病菌，在磁力作用下使其與種子初步分離并得到富集，然后再進(jìn)行 PCR反應(yīng)，通過PCR反應(yīng)步驟的特異性引物進(jìn)行精確判斷，這樣在保證了檢測速度的情況 下，提高了檢測的靈敏度和可靠性。本發(fā)明通過采用DNAssist 2.0對丁香假單胞屬各亞種16S-23S rDNA ITS進(jìn)行序列比對，運(yùn)用Primer Premier5. O和Oligo 6. O軟件進(jìn)行引物設(shè) 計(jì)，獲得特異性引物(SEQID N01)為正向引物Tl :5，TGCTTTGCACACCCGATTT 3，反向引物 T2 :5，CCCCAAGCAATCTAGGT 3’，實(shí)施例2檢測了特異性引物的特異性，結(jié)果見圖5。同時實(shí) 施例2、3、4的檢測數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明檢測方法的菌的濃度的檢出臨界值是103CFU/ml。即 對于1粒帶菌種子/1000粒健康種子的帶菌比例的檢測仍呈陽性反應(yīng)，結(jié)果如圖13所示。 因此本發(fā)明提供的檢測方法結(jié)合免疫磁珠與PCR特異性擴(kuò)增技術(shù)，克服了目前檢測種子帶 菌方面的局限性，并能夠區(qū)分丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種與其它細(xì)菌性黑斑病致病菌變 種，具有高度靈敏度、準(zhǔn)確性和便捷性，在細(xì)菌性黑斑病防治和種子帶菌檢測方面，具有很 高的應(yīng)用價值，與單一的種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA的檢測方法相比，更能夠省時、省空 間、準(zhǔn)確、靈敏，對于綜合防治植物細(xì)菌性黑斑病至關(guān)重要，可為安全生產(chǎn)、種子引進(jìn)和外銷 提供技術(shù)保障，對其他病害的種子帶菌檢測具有指導(dǎo)、借鑒意義。本發(fā)明中，免疫磁珠的作用在于富集種子浸泡液中的致病菌，因此包被磁珠的抗 體只要是能識別并結(jié)合丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種即可，在抗體的特異性，純度方面沒 有嚴(yán)格的要求，因?yàn)?，本發(fā)明的檢測方法還采用特異性PCR來擴(kuò)增富集到的致病菌，PCR步 驟起到了特異性檢測致病菌的作用。因此，本發(fā)明優(yōu)選采用丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種 作為半抗原制備的抗血清作為包被磁珠的原材料，不需要制備特異性高的單克隆抗體或多 克隆抗體，因此本發(fā)明的檢測方法無論具有很強(qiáng)的實(shí)用性，便捷性。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以 采用高質(zhì)量高純度的單克隆抗體來制備磁珠。
本發(fā)明中，檢測前須將待檢測種子進(jìn)行浸泡處理，可直接用無菌水浸泡使種子上 的致病菌脫落到水中便于磁珠收集；也可以采用目前已知的適合于丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致 病變種的液體培養(yǎng)基對種子進(jìn)行培養(yǎng)，使致病菌增殖，起到擴(kuò)大檢測模板的信號的作用。本 發(fā)明例5中，采用丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種的選擇性液體培養(yǎng)基，使得千分之一帶菌 比例的種子都能被檢測出來。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選采用實(shí)時定量PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并提供了特異性熒光標(biāo)記探 針序列。使本發(fā)明的檢查方法集合了熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)，更快速，靈敏。本發(fā)明提供的檢測方法，主要用于檢測植物種子上細(xì)菌性黑斑病致病菌丁香假單 胞桿菌斑點(diǎn)致病變種的攜帶情況，本發(fā)明的檢測方法的靶標(biāo)致病菌為丁香假單胞桿菌斑點(diǎn) 致病變種，該菌種的主要寄主植物為十字花科植物，十字花科植物中很多種都是人們?nèi)粘?生活所依賴的蔬菜種類如白菜、花椰菜、蘿卜等，因此本發(fā)明的檢測方法對于種子檢測上防 治十字花科植物細(xì)菌性黑斑病的發(fā)生，對于食品安全以及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)都有十分重要的作用。


圖1試管凝集法測菌體蛋白抗血清效價。其中，1至10管依次為1 20 1 10240。圖2間接ELISA法對不同濃度丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種抗原的檢測結(jié)果。其中，從1到8為菌懸液濃度梯隊(duì)(IO8到IO1)，9為空白對照。圖3靶標(biāo)菌與部分非靶標(biāo)菌間接ELISA結(jié)果。其中，A1、A2都為靶標(biāo)菌丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種，從A3-A10、B1-B10和C1-C10 均為非靴標(biāo)菌，A5 為 2814，A7 為 Pst42，B3 為 ISL-4，B6 為 3023，B8 為 3183，All、Bll、Cll為陰性對照。圖4靶標(biāo)菌和部分非靶標(biāo)菌DNA提取及丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種、PSL-2、 SM-15ITS 擴(kuò)增。其中，Ml為λ DNA/Hind III，1為丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種DNA，2至8為部分 非靶標(biāo)菌DNA，9為丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種ITS，10為Psl-2ITS，11為SM-15ITS，M2為 DNA Marker II。圖5黑斑病菌引物的專一性檢測結(jié)果。其中，M為DNA Maker II，1為丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種，2為sm_15，3為psl_2， 4-9為部分非靶標(biāo)菌，10為CK。圖6濃度梯度菌體PCR結(jié)果。 其中，M為DNA Maker II (天為時代)，1為丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種DNA PCR, 2 9為3X IO8 3X IO1CFUAiI菌懸液，CK為無模板對照。圖7IMS-PCR模擬種子帶菌檢測結(jié)果。其中，M為 DNA Maker II, 1 % 3X108CFU/ml 菌體 PCR, 2-6 分別為 IO5 IO1CFU/ ml模擬種子帶菌懸液IMS-PCR結(jié)果，7為CK。圖8多菌株及種浸液配制的多菌株菌懸液進(jìn)行IMS-PCR的檢測結(jié)果。其中，M為DNA Maker II，1為丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種的3X 103CFU/ml菌懸液， 為含有丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種及非靶標(biāo)菌的3 X 103CFU/ml菌懸液，3為僅含有非靶標(biāo) 菌的3X 103CFU/ml菌懸液，4為含有丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種及非靶標(biāo)菌的3 X IO3CFU/ ml種子浸泡液，5為僅含有非靶標(biāo)菌3X 103CFU/ml種子浸泡液，6為無菌種子浸泡液。圖9以丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種DNA為模板進(jìn)行Real-time PCR的熒光曲線。其中，藍(lán)色曲線代表丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種菌株，枚紅色線代表CK。圖10 丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種和非靶標(biāo)菌的3 X 108CFU/ml菌懸液進(jìn)行 Real-time PCR0其中，藍(lán)色曲線代表丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種菌株，紫色線代表非靶標(biāo)菌。圖llReal-time PCR模擬種子帶菌檢測。其中，曲線由高往低排列依次代表的濃度為3 X 108CFU/ml、3 X 107CFU/ml、 3 X 106CFU/ml、3 X 105CFU/ml、3 X 104CFU/ml、3 X 103CFU/ml，、3 X IO2 lOtFU/ml 及 CK。圖 12IMS-PCR 電泳結(jié)果。其中，M為 DNA Maker II，1 為 1/1000，2 為 5/1000，3 為 10/1000，4 為 CK。圖13IMS-realtime_PCR檢測中的熒光曲線。其中，曲線由高往低排列依次代表10/1000、5/1000、1/1000、CK。
具體實(shí)施例方式微生物來源及發(fā)放聲明表1、表2所列菌種均為目前已知菌種(來源見表1表2)， 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所冰核研究組有保存，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)施例1.十字花科蔬菜細(xì)菌性黑斑病菌的抗血清獲得參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》和《植病研究方法》中的方法進(jìn)行菌體細(xì)胞 (去鞭毛)抗原的制備、菌體全蛋白抗原的制備、免疫家兔、測定血清效價和抗體專一性(試管凝集法、間接ELISA法)、間接ELISA法測定抗原的檢測精度。(1)菌體細(xì)胞(去鞭毛)抗原的制備將培養(yǎng)48h的丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種(表1中3935)菌株用生理鹽水(等滲 鹽水0. 85% )配成終濃度3X IO8 3X109CFU/ml的菌懸液，100°C沸水煮Ih0(2)菌體全蛋白抗原的制備 將培養(yǎng)48h的丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種(表1中3935)菌株用生理鹽水(等滲 鹽水0. 85% )配成終濃度3 X IO8 3X 109CFU/ml的菌懸液。100°C沸水煮2h，于20000g、 4°C下離心15min，收集上清。調(diào)pH至7. 0，加硫酸銨至飽和產(chǎn)生沉淀，4°C下過夜使之沉淀 完全。再于20000g、4°C下離心15min，收集沉淀，無菌水重懸。將透析管剪成10 20cm的小段，于2 % (w/v)NaHCO3和EDTA(pH 8. 0)中煮沸 lOmin，蒸餾水徹底清洗，再于lmmol/L的EDTA (pH 8. 0)中煮沸l(wèi)Omin，冷卻后存放于4°C 下，確保透析管始終浸沒在溶液內(nèi)。(從此時起取用透析管時總需戴手套)。使用前在透析 管內(nèi)裝滿水，然后排出并清洗干凈。將透析袋一端打好結(jié)，裝入生理鹽水，以檢測是否漏水。(不漏，則倒出生理鹽水， 擠出氣泡)將所制得菌體蛋白抗原裝入袋中擠壓使透析袋充分與溶液接觸，然后將另一端 打好結(jié)，放入2000ml燒杯中(盛有IOOOml以上的生理鹽水)，加入小轉(zhuǎn)子，置于4°C冰箱中 慢慢攪拌，透析72h，期間更換透析液4次。透析完畢，將透析袋內(nèi)的液體小心注入已濕熱 滅菌并硅烷化的4ml離心管中，置于-20°C冰箱中凍實(shí)，真空冷凍干燥后得到干燥的菌體蛋 白。將得到的干燥的菌體蛋白配成濃度300yg/ml的蛋白溶液，即為注射用蛋白抗原。(3)參照《植病研究方法》，采用制得的蛋白抗原免疫家兔，制備抗血清。(4)試管凝集法測定血清效價(圖1)步驟把抗血清依次稀釋成1 20 1 10240，各取Iml與丁香假單胞菌斑點(diǎn) 致病變種(表1中代號3935) 3X 108CFU/ml菌懸液Iml充分混合，50 56°C恒溫水浴2h， 在室溫或4°C冰箱中放置過夜記載，得到效價為1280的抗血清，凝集效果比較好，滿足實(shí)驗(yàn) 要求。(5)間接ELISA法(圖2)確定合適待測菌懸液濃度和檢測抗體專一性，試劑配方包被緩沖液NaHC032.93g，Na2CO3L 59g，800ml 蒸餾水。封閉液0. OlM PBS其中含0. 牛血清蛋白。洗凈緩沖液(PBST)=PBS 加 0. 2% Tween20。一抗稀釋液:NaCl 8. Og, ΚΗ2Ρ043· 0g, Na2HPO4 · 12Η20 29. 0g, KCl 2. 0g, NaN3O. 2g, 乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone-PVP) 5· 0 或 20. 0g, Tween-20 0. 5ml，調(diào) pH 至 7· 4， 蒸餾水定容至1L。二抗稀釋液0· OlM TBS 加 0. 05% Tween-20 ρΝΡΡ (對硝基苯磷酸二鈉)底物溶解液二乙醇胺(Dietanolamine) 97ml，蒸餾水 800ml, NaN3O. 2g，用HCl調(diào)pH 9. 8，定容至1L。分裝濕熱滅菌后室溫保存。步驟用包被緩沖液將靶標(biāo)菌和非靶標(biāo)菌(表2中)配成3 X 108CFU/ml的菌懸液，再將靶標(biāo)菌株丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種(表1中代號3935)稀釋成濃度約為3X 108、3X 107、 3 X io6……3 X Io1CFUAiI,吸取50 μ 1加入聚苯乙烯微量滴定板的單孔中，37°C包被30min。 在每孔中緩慢加入封閉緩沖液200 μ 1，室溫孵育30min。用洗凈緩沖液沖洗3次、拍干，再加 入50 μ 1稀釋過的抗血清(1 320)輕搖30s，室溫孵育30min。再用洗凈緩沖液洗3次、 拍干，每孔加入50 μ 1抗-抗血清(羊抗兔IgG-AP，1 1000稀釋)，孵育30min。用洗凈 緩沖液洗3次、吹干，加50 μ 1 pNPP，37°C下反應(yīng)30min，直到變色，加入IN HCl 50 μ 1終止 反應(yīng)，用酶聯(lián)讀數(shù)儀于405nm波長讀取數(shù)值。以CK的OD值為標(biāo)準(zhǔn)，若樣品OD彡(2 X ODck) 為視為陽性反應(yīng)，OD < (2XODck)視為陰性。結(jié)果表明最小檢測濃度可以達(dá)到3X 105CFU/ml。血清對十字花科蔬菜細(xì)菌性黑斑 病菌(Pseudomonas syringae pv. maculicola) (丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種菌株)呈陽性 反應(yīng)，而對部分非靶標(biāo)菌株呈假陽性反應(yīng)(圖3)。說明所獲得的血清直接作用于病菌的檢 測存在著假陽性的風(fēng)險，但對于本發(fā)明來說只是利用抗血清的免疫分離作用，完全可以利 用所獲得的抗血清。實(shí)施例2.十字花科蔬菜細(xì)菌性黑斑病菌的常規(guī)PCR檢測采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取所有靶標(biāo)及非靶標(biāo)細(xì)菌(表1和表2)的染 色體DNA，見圖4，1-8為部分菌體染色體DNA。表1供試細(xì)菌性黑斑病(靶標(biāo))菌株 表2供試非靶標(biāo)菌株
XV14 X. campestris ρν. vesicatoria油菜黃單胞菌疤斑致病中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研
變種究所冰核組 008 X campestris pv. campestris 油菜黃單胞菌油菜致病中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研
變種究所冰核組步驟1采用DNAssist 2. 0對丁香假單胞屬各亞種16S-23S rDNA ITS進(jìn)行序列 比對，運(yùn)用Primer Premier5. 0和Oligo 6. O軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得特異性引物(SEQ ID N01)為正向引物Tl :5，TGCTTTGCACACCCGATTT 3，反向引物T2 5，CCCCAAGCAATCTAGGT 3，步驟2對所設(shè)計(jì)的細(xì)菌性黑斑病菌特異性引物進(jìn)行專一性檢測，以表1靶標(biāo)菌和 表2的非靶標(biāo)菌的染色體DNA為模板，使用Promega公司的Taq DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增， 采用50 μ 1反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 2min、95°C lmin、55°C 30s、72°C 40s,35循 環(huán)、72°C 5min。反應(yīng)終止后，用agarose, TBE緩沖液進(jìn)行電泳，EB染色后，在凝膠成像 儀中檢測擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果見圖5。靶標(biāo)菌丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種呈陽性反應(yīng)，擴(kuò)增出 ITS中的454bp (見Sequence ID No. 3中第76 530bp)條帶，非靶標(biāo)菌均呈陰性(Psl_2 成兩條帶，引物對其不特異)。步驟3用無菌水配制黑斑病菌株丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種的3X108 3 X Io1CFUAiI菌懸液，吸取Iml置于1. 5ml離心管中，沸水煮15min。分別取2 μ 1作為菌體 PCR的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用50 μ 1反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為預(yù)變性95121^11、951 Imin, 550C 30s,720C 40s、35循環(huán)、72°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后，用1 % agarose，TBE緩沖液進(jìn)行電泳， EB染色后，在凝膠成像儀中檢測擴(kuò)增結(jié)果。確定以丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種進(jìn)行直接菌 體PCR，其反應(yīng)呈陽性的最小菌濃度約為3X104CFU/ml，如圖6所示。實(shí)施例3.免疫吸附PCR(IMS-PCR)檢測十字花科蔬菜細(xì)菌性黑斑病菌溶液配制飽和硫酸銨溶液(SAS)在990ml H2O中加1. 219g Tris，調(diào)pH 7. 0，并定容終體積 到1L，配制成0. 01mol/L Tris -Cl溶液。稱量767g (NH4) 2S04，攪拌并稍微加熱將其溶于IL 0. Olmol/LTris · Cl，調(diào)pH至7. 0，并于4°C貯存。在4°C貯存時應(yīng)可見瓶底出現(xiàn)(NH4)2SO4 晶體。33% (v/v) SAS 溶液:33ml SAS 溶液加 67ml PBS，調(diào) ρΗ7· 0。 (IMBs) =Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG (Dynal &司，2ml/ 瓶)。PBS-BSA :PBS 中含 0. 牛血清蛋白。步驟1.抗血清純化.在4°C不斷攪拌下，往2體積的抗血清中，逐滴加入1體積pH 7. 0的SAS溶液。力口 完后置于4°C，不間斷地?cái)嚢璐嘶旌衔? 4h以形成沉淀，12000g離心20min。用預(yù)冷的 33% SAS溶液在旋渦混合器上振蕩洗滌沉淀，所用溶液的體積與原抗血清等體積。12000g離心20min，盡棄上清，加入與抗血清等體積的PBS (pH7. 4)，在旋渦混合器上溫和振蕩以將 沉淀溶解。4°C透析抗體溶液48h以上，期間換3次透析緩沖液(每次換4L)。將透析管內(nèi) 溶物分裝于1. 5ml印pendorf管，真空冷凍干燥獲得純化的IgG，_20°C冷凍保存?zhèn)溆谩２襟E2，包被磁珠將免疫磁珠(IMBs)充分震蕩2min至磁性液體變?yōu)榫粦覞嵋海瑥闹形?50 μ 1 (約3. 35 X IO7個磁珠)，放入2ml離心管。用PBS (pH 7. 4)洗滌IMBs 3 4次，每次 洗滌后將離心管放在磁性分離架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗滌完畢，加入2ml PBS重 懸磁珠，加入步驟1獲得的純化的IgGlOO μ g于4°C緩慢搖動孵育24h。用2ml PBS-BSA洗 滌IMBs 3 4次，并將Bffis重懸于2ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最終濃度約為1. 7 X IO7 個/ml，待用。步驟3，磁珠檢測 吸取包被過抗體的IMBs 50 μ 1，置于含有io5 Io1CFUAiI菌懸液的1.5ml離心管 中，室溫緩慢搖動孵育lh，將離心管置于磁性分離架上，靜置5min，吸去上清液，用PBS-BSA 洗滌2遍，無菌水洗滌1遍，用50 μ 1無菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15min，取2 μ 1用于 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系與實(shí)施例2步驟3相同。反應(yīng)終止后，用agarose、 TBE緩沖液進(jìn)行電泳，EB (溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測擴(kuò)增結(jié)果，由圖7可知， 菌的濃度從105CFU/ml到103CFU/ml都有特異性條帶，帶的亮度隨菌的濃度增加而變亮；而 雜菌和空白對照都沒有帶(圖8)，也就是說IMS-PCR的檢出臨界值是103CFU/ml。實(shí)施例4.實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測十字花科細(xì)菌性黑斑病依據(jù)細(xì)菌性黑斑病菌16S-23S ITS序列區(qū)如Seq ID No. 3，進(jìn)行探針設(shè)計(jì) (5' TGCTTTGCACACCCGATTTGG 3')。采用丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種的染色體DNA為模板 進(jìn)行Real-time PCR，采用50 μ 1反應(yīng)體系，反應(yīng)條件步驟1為95°C 30s，步驟2為95°C 5s， 55°C 30s 40個循環(huán)，每循環(huán)結(jié)束時收集熒光信號，結(jié)果如圖9所示，表明熒光探針可以正常 使用。以同樣條件進(jìn)行專一性測定，以2μ 1煮沸15min的丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種菌株 和非靶標(biāo)菌3 X 108CFU/ml的菌懸液為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，結(jié)果顯示，只有丁香假單 胞菌斑點(diǎn)致病變種呈陽性反應(yīng)，而各非靶標(biāo)菌均呈陰性，其熒光曲線如圖10所示。用種子的水浸泡液配制不同濃度的菌懸液，煮沸15min后，吸取2μ 1溶液作為 Real-timePCR反應(yīng)的模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。其檢測最小濃度約為3 X 103CFU/ml如 圖11所示。實(shí)施例5.哈密瓜種子帶菌快速檢測方法的建立帶菌種子檢測，將甘藍(lán)種子1000粒置于50ml三角瓶，121°C滅菌20min，待用。制 備丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種3X108CFU/ml菌懸液，浸泡無菌種子30min，于超凈臺吹干。 將不同數(shù)量的種子放入三角瓶中，模擬0/1000，1/1000, 5/1000,10/1000帶菌種子樣本。向 含有不同帶菌種子樣本的三角瓶中加入PBS 20ml，室溫?fù)u動培養(yǎng)4h。吸取培養(yǎng)液lml，置 于IOml液體選擇性培養(yǎng)基內(nèi)(2. Omg/L利福平和30mg/L氯霉素的KB培養(yǎng)基)，28°C搖動培 養(yǎng)8h。吸取Iml培養(yǎng)液，置于2ml EP管中。加入包被過的IMBs 50 μ 1，室溫緩慢搖動孵育 Ih,將離心管置于磁性分離架上，靜置5min，吸取上清液，用PBS-BSA洗滌2次，無菌水洗滌 1次，用50 μ 1無菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15min，取2 μ 1上清液用于常規(guī)PCR和實(shí)時 熒光定量PCR。經(jīng)過分離、培養(yǎng)、IMS-PCR，發(fā)現(xiàn)每千粒種子中含有一粒病種子仍可以檢測到(見圖12)。經(jīng)過分離、培養(yǎng)、IMS-realtime-PCR，仍可以檢測出每千粒種子中含有的一粒病種子，即1粒帶菌種子/1000粒健康種子仍呈陽性反應(yīng)，結(jié)果如圖13所示。
權(quán)利要求
植物種子攜帶細(xì)菌性黑斑病致病菌的快速檢測方法，步驟如下(1)采用免疫磁珠富集待測植物種子浸泡液中的細(xì)菌性黑斑病致病菌；(2)以第(1)所得的富集液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測；所述免疫磁珠上包被的抗體為抗丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗體；所述PCR擴(kuò)增的引物如下正向引物T15’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’，反向引物T25’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為454bp的單一條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測方法，所述抗體為分離自抗丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致 病變禾中(Pseudomonas syringae pv. maculicola)的抗血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測方法，所述待測種子浸泡液指水浸泡或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測方法，所述液體培養(yǎng)基指丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病 變種的選擇性培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測方法，所述選擇性培養(yǎng)基為含有2.Omg/L利福平、 30mg/L氯霉素的KB培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測方法，所述步驟2之前先將所述富集液煮沸5 15 分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一所述的快速檢測方法，所述PCR擴(kuò)增指實(shí)時定量熒光PCR。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速檢測方法，所述實(shí)時定量PCR的標(biāo)記探針序列為 TGCTTTGCACACCCGATTTGG。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測方法，所述植物種子指十字花科植物種子。
全文摘要
本發(fā)明“植物種子攜帶細(xì)菌性黑斑病致病菌的快速檢測方法”，涉及植物病菌生物檢測。步驟如下(1)采用免疫磁珠富集待測植物種子的浸泡液中的細(xì)菌性黑斑病致病菌；(2)以第(1)所得的富集液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測；所述免疫磁珠上包被的抗體為抗丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗體；所述PCR擴(kuò)增的引物如下正向引物T15’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’，反向引物T25’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’擴(kuò)增產(chǎn)物為454bp。該檢測方法結(jié)合免疫磁珠吸附技術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR，與單一的種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA的檢測方法比，更能夠省時、省空間、特異、靈敏，尤其對植物綜合防治植物細(xì)菌性黑斑病至關(guān)重要，可為安全生產(chǎn)、種子引進(jìn)和外銷提供技術(shù)保障，尤其適合于十字花科植物種子的檢測。
文檔編號C12N1/20GK101838703SQ20101019152
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者王華杰, 胡俊, 趙廷昌 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所