專(zhuān)利名稱(chēng)：軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，具體為一種特別適合臨床標(biāo)本中軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)，在標(biāo)本采集運(yùn)送過(guò)程中減少雜菌污染，但能保持軍團(tuán)菌適當(dāng)生長(zhǎng)，從而提高軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)陽(yáng)性率的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
據(jù)軍團(tuán)菌檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)工S。1173l19981美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)和我國(guó)衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《軍團(tuán)病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》wS—195—200l規(guī)定，對(duì)軍團(tuán)菌病的診斷，細(xì)菌培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)。但對(duì)軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)，要求營(yíng)養(yǎng)豐富的選擇性分離培養(yǎng)基，技術(shù)難度大1耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，經(jīng)常延誤了臨床對(duì)軍團(tuán)菌病的準(zhǔn)確診斷和及時(shí)采取有效的治療措施，而造成軍團(tuán)菌病的病死率增高。其中最主要的是臨床標(biāo)本軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)難，在標(biāo)本采集和運(yùn)送過(guò)程中，由于雜菌生長(zhǎng)，軍團(tuán)菌受抑制，而導(dǎo)致軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性率偏低的對(duì)整個(gè)軍團(tuán)菌病的診斷影響巨大。至今，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)一種可用于軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)的運(yùn)送增菌培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了克服臨床標(biāo)本軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)難，在標(biāo)本采集和運(yùn)送過(guò)程中，由于雜菌生長(zhǎng)，軍團(tuán)菌受抑制，而導(dǎo)致軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性率偏低的問(wèn)題，提供了一種目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基在BCYE o一基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化組合，添加了適當(dāng)濃度的選擇性抗生素，使軍團(tuán)菌培養(yǎng)的臨床標(biāo)本在運(yùn)送過(guò)程中減少雜菌污染1但保持軍團(tuán)菌適當(dāng)生長(zhǎng)，從而提高軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)陽(yáng)性率。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，既可以用作軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)標(biāo)本的運(yùn)送，又可使軍團(tuán)菌在運(yùn)送過(guò)程中增殖，其是在軍團(tuán)菌BCYE o一基礎(chǔ)液中添加了軍團(tuán)菌選擇成分甘氨酸(GlyCine)1萬(wàn)古霉素(VanC0myCin)1多粘菌素B(p。lymiXin B)和放線菌酮(CyCl。heXimide)。
所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，一基礎(chǔ)液中添加了如下重量份的成分
萬(wàn)古霉素o．0005一o．OOl5，
多粘菌素Bo．005一o．012，
放線菌酮o．005一o．012，
甘氨酸2．o一4．o。[OO10] 所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其包括的組份重量份數(shù)如下[OO11] 基礎(chǔ)液[OO12] 酵母粉6一15，
ACES6一15，[OO14] a一酮戊二酸o．5一1．5，[OO15] 焦磷酸鐵o．2一o．3，
氨基酸蛋白液甘氨酸L-半胱氨酸白蛋白
2. 0 4. 0， 0. 3 0. 7， 0. 05 0. 15，抗生素液萬(wàn)古霉素0. 0005 0. 0015，多粘菌素B 0. 005 0. 012，放線菌酮0. 005 0. 012 ；制備步驟包括如下(1)基礎(chǔ)液中的酵母粉、ACES和α _酮戊二酸按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中，加 水900 1000份，用KOH將ρΗ值調(diào)至6. 85 ；煮沸1分鐘，然后在121°C蒸汽中滅菌15min ； 將焦磷酸鐵溶于8 12份水中，過(guò)濾滅菌；將滅菌后的酵母粉、ACES和α -酮戊二酸溶液 冷卻至55°C，加入過(guò)濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入25 35 份水進(jìn)行溶解，過(guò)濾滅菌；(3)將萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、放線菌酮按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入8 12份水中進(jìn)行溶解，過(guò)濾滅菌；(4)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步 驟得到的溶液中混勻。(5)無(wú)菌操作分裝培養(yǎng)基，5ml/支，2°C _8°C，保存，有效期6個(gè)月。本發(fā)明在包括以酵母粉、ACES (N-2-乙酰氨基_2_氨基乙烷磺酸)緩沖劑、α -酮 戊二酸、可溶性焦磷酸鐵以及L-半胱氨酸等軍團(tuán)菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分的基礎(chǔ)配方上， 添加選擇性甘氨酸(Glycine)以及萬(wàn)古霉素(vancomycin)、多粘菌素B (polymixin B)和 放線菌酮(Cycloheximide)等抗生素，以抑制非軍團(tuán)菌屬細(xì)菌如革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性 桿菌和霉菌類(lèi)生長(zhǎng)，使軍團(tuán)菌培養(yǎng)的臨床標(biāo)本在運(yùn)送過(guò)程中減少雜菌污染、但保持軍團(tuán)菌 適當(dāng)生長(zhǎng)，從而提高軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)陽(yáng)性率。在BCYEa-基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加的萬(wàn)古霉素 (vancomycin)、多粘菌素B(polymixin B)和放線菌酮(Cycloheximide)可抑制非軍團(tuán)菌屬 細(xì)菌如革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌和霉菌類(lèi)生長(zhǎng)，但對(duì)軍團(tuán)菌并不影響其生長(zhǎng)繁殖，從而 提高軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)陽(yáng)性率?？偟膩?lái)說(shuō)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下(1)調(diào)整選擇性抗生素濃度，提高對(duì)非軍團(tuán)菌屬及雜菌類(lèi)的抑制能力，降低對(duì)軍團(tuán) 菌種的抑制性，從而提高了對(duì)軍團(tuán)菌屬分離培養(yǎng)陽(yáng)性率；(2)采集的臨床標(biāo)本(痰、支氣管 抽出物等)直接種人運(yùn)送增菌培養(yǎng)基在室溫(25°C )或保溫箱(35°C )中運(yùn)送，非軍團(tuán)菌屬 細(xì)菌受抑制，軍團(tuán)菌屬可在運(yùn)送過(guò)程中生長(zhǎng)，提高軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性率，填補(bǔ)了一項(xiàng)軍團(tuán) 菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基的國(guó)內(nèi)外空白。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明軍團(tuán)菌的運(yùn)送增菌培養(yǎng)基進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1
軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其包括的組份·t量份類(lèi)妙口下
基礎(chǔ)液
酵母粉6，
ACES6，
a-酮戊二酸0. 5，
焦磷酸鐵 0.2，
氨基酸蛋白液
甘氨酸2. 0，
L-半胱氨酸0. 3，
白蛋白0. 05，
抗生素液
萬(wàn)古霉素0.0005，
多粘菌素B0. 005，
放線菌酮0. 005。
實(shí)施例2
軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其包括的組份量份_女如下
基礎(chǔ)液
酵母粉15，
ACES15，
a-酮戊二酸1. 5，
焦磷酸鐵0. 3，
氨基酸蛋白液
甘氨酸4. 0，
L-半胱氨酸0. 7，
白蛋白0. 15，
抗生素液
萬(wàn)古霉素 0.0015，
多粘菌素B 0 012，
放線菌酮 0.012。
實(shí)施例3
軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其包括的組份I■量份 &如下
基礎(chǔ)液
酵母粉 8 12，
ACES 8 12，
a-酮戊二酸0. 8 1. 2，
焦磷酸鐵0. 24 0. 28，
氨基酸蛋白液
甘氨酸2 · 5 3 · 5 j
L-半胱氨酸0. 4 0. 6，
(3)將萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、放線菌酮按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入10份 水中進(jìn)行溶解，過(guò)濾滅菌；(4)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步 驟得到的溶液中混勻；(5)無(wú)菌操作分裝培養(yǎng)基，5ml/支，2°C _8°C，保存，有效期6個(gè)月。以上所述的過(guò)濾滅菌可以是在在121°C蒸汽中滅菌15min。本發(fā)明軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基在BCYE α-基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了軍團(tuán)菌選擇性 成分甘氨酸(Glycine)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)、多粘菌素B (polymixinB)和放線菌酮 (Cycloheximide)。本培養(yǎng)基既可以當(dāng)作軍團(tuán)菌增菌培養(yǎng)基使用，防止培養(yǎng)過(guò)程中，其他細(xì) 菌的污染，另一方面又可作為軍團(tuán)菌臨床標(biāo)本運(yùn)送培養(yǎng)基應(yīng)用，其中添加的抗生素可以抑 制雜菌生長(zhǎng)，提高軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性率。在軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基中，添加選擇性抗生素可抑制非軍團(tuán)菌屬細(xì)菌如革蘭 陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌和霉菌類(lèi)生長(zhǎng)，從而提高軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性率。其中甘氨酸 (glycine)對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為1280μ g/ml和160 μ g/ml ；對(duì)痢疾 桿菌的最低抑菌濃度為640 μ g/ml，對(duì)傷寒桿菌的最低抑菌濃度分別為1280 μ g/ml和 640 μ g/ml，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為1280μβ/πι1 ；萬(wàn)古霉素(vancomycin)對(duì)金黃色 葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用；多粘菌素B(p0lymiXin B)對(duì)綠膿桿菌和其他革蘭陰性桿 菌有明顯抑制作用；放線菌酮(Cycloheximide)對(duì)霉菌類(lèi)有明顯抑制作用。將檢測(cè)樣品(痰、支氣管抽出物等)約1ml，加入該運(yùn)送增菌培養(yǎng)基中，于室溫 (250C )或保溫箱(35°C )中運(yùn)送，經(jīng)18h 24h，一般情況下非軍團(tuán)菌屬細(xì)菌如革蘭陽(yáng)性球 菌、革蘭陰性桿菌和霉菌類(lèi)生長(zhǎng)受抑制，而軍團(tuán)菌仍可生長(zhǎng)繁殖。取運(yùn)送增菌培養(yǎng)物0. 1ml，接種軍團(tuán)菌選擇性分離培養(yǎng)基(BCYE α -DGVPC)進(jìn)行 軍團(tuán)菌常規(guī)分離培養(yǎng)，置5% C02孵育箱48-72h，也可培養(yǎng)至1周，觀察菌落形態(tài)。根據(jù)菌 落形態(tài)和顏色，鑒定和區(qū)分軍團(tuán)菌屬目標(biāo)菌。本發(fā)明經(jīng)臨床應(yīng)用考證，基對(duì)軍團(tuán)菌分離培養(yǎng) 樣品，在運(yùn)送過(guò)程中可減少雜菌污染，而且能保持軍團(tuán)菌適當(dāng)生長(zhǎng)，從而提高軍團(tuán)菌的分離 培養(yǎng)陽(yáng)性率，填補(bǔ)了一項(xiàng)軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基的國(guó)內(nèi)外空白。臨床試驗(yàn)應(yīng)用本發(fā)明軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基分別在兩個(gè)醫(yī)院(A、B)進(jìn)行臨床應(yīng)用試驗(yàn)，同 時(shí)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法比較A醫(yī)院采集275例呼吸道感染病人的痰液標(biāo)本1ml，放置本 運(yùn)送增菌培養(yǎng)基中，室溫(25°C )運(yùn)送，再行分離培養(yǎng)，結(jié)果分離到1株嗜肺軍團(tuán)菌，這是我 國(guó)近10多年來(lái)非常罕見(jiàn)的從臨床痰液標(biāo)本中分離到的嗜肺軍團(tuán)菌；B醫(yī)院采集325例呼吸 道感染病人的痰液標(biāo)本lml，未用本運(yùn)送培養(yǎng)基處理、直接進(jìn)行分離培養(yǎng)，未檢出軍團(tuán)菌陽(yáng) 性菌株。通過(guò)臨床實(shí)際應(yīng)用表明，該軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基確實(shí)有利于軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)。
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權(quán)利要求
軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征在于在軍團(tuán)基礎(chǔ)液中添加了甘氨酸、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B和放線菌酮。
2.如權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征在于其包括有如下重量份數(shù) 組份萬(wàn)古霉素 0. 0005 0. 0015， 多粘菌素B 0.005 0.012， 放線菌酮 0. 005 0. 012，甘氨酸2. 0 4.0。
3.如權(quán)利要求2所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征在于其包括的組份重量份數(shù) 如下基礎(chǔ)液酵母粉6 15，ACES6 15，a_酮戊二酸 0.5 1.5， 焦磷酸鐵 0.2 0.3， 氨基酸蛋白液 甘氨酸2.0 4.0，L-半胱氨酸 0.3 0.7， 白蛋白0.05 0.15，制備步驟包括如下(1)基礎(chǔ)液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中，加水 900 1000份，用KOH將ρΗ值調(diào)至6. 85 ；煮沸1分鐘，然后在121°C蒸汽中滅菌15min ；將 焦磷酸鐵溶于8 12份水中，過(guò)濾滅菌；將滅菌后的酵母粉、ACES和α -酮戊二酸溶液冷 卻至55°C后加入過(guò)濾滅菌的焦磷酸鐵溶液中混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入25 35份水 進(jìn)行溶解，過(guò)濾滅菌；(3)將萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、放線菌酮按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入8 12份 水中進(jìn)行溶解，過(guò)濾滅菌；(4)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得 到的溶液中混勻。
4.如權(quán)利要求3所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征在于其包括的組份重量份數(shù) 如下抗生素液 萬(wàn)古霉素 多粘菌素B 放線菌酮·0. 0005 0. 0015， 0. 005 0. 012， 0. 005 0. 012 ；基礎(chǔ)液 酵母粉 ACES·8 12， 8 12，a_酮戊二酸 0.8 1.2，焦磷酸鐵 氨基酸蛋白液 甘氨酸0. 24 0. 28，2 · 5 “ 3 · 5 jL-半胱氨酸 0.4 0.6，白蛋白 抗生素液 萬(wàn)古霉素 多粘菌素B 放線菌酮0. 08 0. 12，0. 0008 0. 008 ‘ 0. 008 --0.0012， 0. 010， 0. 010。
5.如權(quán)利要求4所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征在于其包括的組份重量份數(shù)如下基礎(chǔ)液酵母粉ACESa-酮戊二酸 焦磷酸鐵 氨基酸蛋白液 甘氨酸 L-半胱氨酸 白蛋白 抗生素液 萬(wàn)古霉素 多粘菌素B 放線菌酮10， 10， 1. 0，3. 0， 0. 5， 0. 1，0. 25，0. 001， 0. 008， 0. 008。
6.如權(quán)利要求3所述的軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征在于制備步驟包括如下(1)基礎(chǔ)液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中，加水 950份，用KOH將ρΗ值調(diào)至6. 85 ；煮沸1分鐘，然后在121 °C蒸汽中滅菌15min ；將焦磷酸鐵 溶于10份水中，過(guò)濾滅菌；將滅菌后的酵母粉、ACES和α -酮戊二酸，冷卻至55°C，加入過(guò) 濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入30份水進(jìn)行 溶解，過(guò)濾滅菌；(3)將萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、放線菌酮按上述重量份數(shù)稱(chēng)量放置容器中加入10份水中 進(jìn)行溶解，過(guò)濾滅菌；(4)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得 到的溶液中混勻。全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種軍團(tuán)菌運(yùn)送增菌培養(yǎng)基，其特征是在軍團(tuán)菌BCYEα-基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備過(guò)程中添加了軍團(tuán)菌選擇成分甘氨酸、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B和放線菌酮。其中添加特定優(yōu)化量的抗生素，既可以用作軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)標(biāo)本的運(yùn)送，又可使軍團(tuán)菌在運(yùn)送過(guò)程中增殖。有益效果如下一是提高對(duì)非軍團(tuán)菌屬及雜菌類(lèi)的抑制能力，減少雜菌污染，二是降低對(duì)軍團(tuán)菌的抑制性，從而提高了對(duì)軍團(tuán)菌屬分離培養(yǎng)陽(yáng)性率。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101921719SQ20101019227
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者劉洋敏, 朱慶義, 王娟, 胡朝暉, 趙利偉 申請(qǐng)人:廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司