專利名稱：玉米Opaque5基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米0paque5基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米(Zea mays)是世界上分布最廣的糧食作物之一，栽培面積僅次于小麥和水 稻，位居世界第三位。它是全世界同時(shí)也是我國主要的糧食和飼料作物。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，從 1998年起，玉米總產(chǎn)量已超過小麥和水稻成為世界第一大糧食作物。玉米的主要生產(chǎn)性狀 包括產(chǎn)量和品質(zhì)兩個(gè)方面。由于玉米的主要用途是作為飼料，因此籽粒的營養(yǎng)品質(zhì)是更為 重要的指標(biāo)。玉米籽粒的營養(yǎng)品質(zhì)主要是在蛋白方面。玉米籽粒含有約10%的蛋白，但由 于儲(chǔ)藏蛋白氨基酸種類上的偏好，因此有些必需氨基酸比較缺乏，其中最重要的是賴氨酸 的含量。因此一般玉米籽粒的蛋白品質(zhì)較差，只有高賴氨酸的玉米才具有較好的蛋白品質(zhì)。 此外，玉米籽粒的含油量也是一個(gè)重要的營養(yǎng)品質(zhì)。從飼料的角度，在蛋白和淀粉含量較為 一致的情況下，含油量越高的玉米則具備越好的營養(yǎng)品質(zhì)。玉米在品質(zhì)性狀的改造上有賴于一些籽粒的突變體。在玉米中有一類與蛋白品質(zhì) 相關(guān)的突變體，被稱為高賴氨酸突變體。這類突變體一般具有不透明或粉質(zhì)的籽粒，在玉米 遺傳上被稱為Opaque或Floury突變體。這類突變體能夠顯著改善玉米籽粒中賴氨酸等必 需氨基酸的含量，從而顯著提高玉米在蛋白水平的營養(yǎng)品質(zhì)。其中最為有名的是0paqUe2 突變體(02)，02已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在高賴氨酸玉米的育種實(shí)踐中。此外，0paqUe5(簡稱05) 也是一個(gè)類似的高賴氨酸突變體。對(duì)05突變體的遺傳學(xué)分析，表明05是單基因控制的隱 性突變，能夠引起玉米籽粒的不透明(Opaque)性狀(見附圖3和圖4)。由圖可知，與野生 型籽粒相比，05突變體籽粒總油量提高約30%，籽粒中高含量的主要油脂種類(棕櫚酸、油 酸和亞油酸)其含量也普遍高于野生型籽粒，其中棕櫚酸、油酸和亞油酸分別比野生型提 高25%、38%和22%。05突變體籽粒中其它重要油脂種類含量也顯著比野生型籽粒高，其 中最明顯的是硬脂酸C18:0提高約55%，亞麻酸C18:3含量提高一倍。與在高賴氨酸玉米 育種中已經(jīng)廣泛應(yīng)用的02 —樣，研究發(fā)現(xiàn)05突變體籽粒的賴氨酸含量也明顯高于野生型 籽粒，因此也是一個(gè)能提高籽粒蛋白品質(zhì)的重要突變體。同時(shí)我們實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明， 05不僅可以提高籽粒的賴氨酸含量，而且也能顯著提高籽粒的含油量。我們用高效液相色 譜方法分別測(cè)定了 05突變體和野生型籽粒的油脂含量，研究發(fā)現(xiàn)05突變體的油脂含量普 遍高于野生型，尤其是C18 0硬脂酸，C18 3亞麻酸等脂肪酸鏈的含量顯著高于野生型。這 為高油玉米的育種提供了一個(gè)新的途徑。如能將05突變體引入生產(chǎn)品種，則能進(jìn)一步提高 籽粒的含油量，培育出高油脂含量的玉米新品種。因此，05突變體可以同時(shí)改善玉米籽粒 的蛋白和油脂含量品質(zhì)，對(duì)培育綜合品質(zhì)更高的玉米油很好的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)典的遺傳學(xué)研究將05基因定位在第7號(hào)染色體長臂的Bin7. 02。目前05基因 尚未被克隆，而且05基因至今尚未通過雜交育種被很好地利用，主要是因?yàn)?5由隱性基因 突變引起，通過雜交選育需要較長的時(shí)間。DNA分子標(biāo)記輔助育種是一項(xiàng)新的育種技術(shù)，該 技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對(duì)控制目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，不僅可在早期進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇， 而且可克服再度利用隱性基因識(shí)別難的問題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。與常規(guī)育 種相比，該技術(shù)可提高育種效率2-3倍。DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵是(1)獲得的分子標(biāo)記應(yīng)該是能夠區(qū)分育種 過程中雜交親本(純合05類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性 標(biāo)記；(2)獲得的共顯性分子標(biāo)記位于該基因在染色體物理位置的兩側(cè)；(3)兩側(cè)的DNA分 子標(biāo)記都應(yīng)該與控制目標(biāo)性狀的基因緊密連鎖。但是，以往研究中并沒有獲得位于05基因 染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，故無法對(duì)該基因所控制的目 標(biāo)性狀進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助選擇。所以，對(duì)于該種標(biāo)記的獲得和鑒定是對(duì)控制玉米籽粒 含油量農(nóng)藝性狀的05基因進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供玉米0paqUe5基因的分子標(biāo)記。本發(fā)明的目的之二在于提供該分子標(biāo)記的用途。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種玉米0paque5基因的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增DNA片斷SSR9890的特異性引物及堿基序列為正向引物從5'端至 3'端為CATGCACCCTTTAGTGTAACAC ；反向引物從5 ‘端至 3 ‘端為GGTACATACATGCAATTTTCGT ；擴(kuò)增DNA片斷SSR7673的特異性引物及堿基序列為正向引物從5'端至 3,端為GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT ；反向引物從5'端至 3'端為GCATTGGCAAGAGCACACTA。一種上述的玉米0paqUe5基因的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親 本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。本發(fā)明中使用的遺傳資源玉米0paque5突變體是上海大學(xué)宋任濤教授在2004年 6月回國時(shí)向美國美國伊利諾伊大學(xué)厄本那香檳分校的玉米遺傳學(xué)合作中心索取的。經(jīng)查 證該遺傳種質(zhì)為美國伊利諾伊大學(xué)厄本那香檳分校的艾爾.皮特爾博士和馬蒂薩克斯博 士于1993年1月向玉米遺傳學(xué)合作中心捐贈(zèng)的。本發(fā)明利用高油玉米(05/05)與其他具 優(yōu)良性狀的玉米雜交獲得Fl代，F(xiàn)l代自交后篩選具有目的性狀的高油玉米F2，F(xiàn)2代多次 自交，最終獲得穩(wěn)定的純合體。本發(fā)明提供的2個(gè)位于05基因染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性DNA 分子標(biāo)記，以及利用這兩個(gè)共顯性DNA分子標(biāo)記對(duì)05基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的方法。 利用這兩個(gè)分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種 子代各單株中05基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高，操作簡 單，為利用05基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。


圖1是玉米籽粒野生型(+/+)圖2為玉米籽粒純合突變體外形圖(05/05)；
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圖3比較了 05和野生型籽粒中含量較高的主要油脂種類C16:0(棕櫚酸)、 〇18:1(油酸)、(18:2(亞油酸)和總OIL的含量變化圖；圖4比較了 05和野生型籽粒中其它重要油脂種類C14:0 (豆蔻酸)、C16:1 (棕櫚 油酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:3(亞麻酸)、C20:0(花生酸)、C20:1(花生油酸)、C22:0(山 崳酸)、C24:0 (木焦油酸)共8種植物中主要脂肪酸的含量變化。圖5是用于進(jìn)行05基因定位的BC群體構(gòu)建路線；圖6是標(biāo)記SSR9890在BC群體中的分離情況，其中05/05為純合體；05/+為雜合 體；-為負(fù)對(duì)照；圖7是標(biāo)記SSR7673在BC群體中的分離情況，其中05/05為純合體；05/+為雜合 體；-為負(fù)對(duì)照；圖8是本發(fā)明中分子標(biāo)記在玉米七號(hào)染色體長臂上的示意位置，其中CEN7代表七 號(hào)染色體著絲粒，TEL代表端粒；圖9是標(biāo)記SSR9890在不同自交系間的多態(tài)情況；-為負(fù)對(duì)照；圖10是標(biāo)記SSR7673在不同自交系間的多態(tài)情況。-為負(fù)對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施事例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常 規(guī)條件,如分子克隆(Molecular Cloning =A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生 物學(xué)一實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-Α Laboratory Manual, Melody S. Clark 編， Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一利用05突變體(05/05)培育高油玉米把05突變純合體(05/05)與其他具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的玉米雜交，然后Fl代自交， 在F2代中分離出高油玉米籽粒的雙隱性純合體。該雙隱性純合體經(jīng)多代自交，輪回選擇， 逐代選擇籽粒發(fā)育好，含油量高的種子，最終獲得穩(wěn)定的雙隱性純合體，高油分自交系或群 體。利用不同親緣關(guān)系的但都為同類高油雙隱性材料作為親本，組配雜交種。Fl雜交種經(jīng) 隔離種植，即獲得高油商品玉米。由于05突變體的特性，該高油品質(zhì)同時(shí)也具有高賴氨酸 品質(zhì)。實(shí)施例二 兩個(gè)共顯性分子標(biāo)記的獲得及與05連鎖關(guān)系的確定圖1和圖2為玉米籽粒野生型(+/+)與玉米籽粒純合突變體外形圖。通過純合突 變體(05/05)與純合野生型(+/+)雜交獲得Fl (05/+)，然后以Fl為母本，純合突變體為父 本進(jìn)行回交構(gòu)建回交(BC)群體，參見圖5。BC群體中出現(xiàn)了基因型分離，包含05/+與05/ 05兩種基因型，具有05/+基因型的與+/+基因型的籽粒均為非Opaque的野生型類型幼苗 正常，具有05/05基因型的籽粒為Opaque的突變體類型。本發(fā)明通過經(jīng)典的遺傳定位獲知05基因定位在玉米第7號(hào)染色體的長臂上 (Bin7.02)。通過在05位點(diǎn)附近為純合突變體和純合野生型的植株構(gòu)建的回交群體(BC)， 提取純合突變體、野生型以及BC群體各單株的基因組DNA。在前人粗定位的基礎(chǔ)上，通過 篩選已有的SSR分子標(biāo)記，獲取有多態(tài)性的SSR類型分子標(biāo)記(umc2092與umcl393)，將05 基因定位于分子標(biāo)記umc2092與umcl393之間。然而這兩個(gè)標(biāo)記和05的連鎖性并不十分
5緊密，在實(shí)際使用上仍有一定的問題。因此根據(jù)umc2092與umcl393之間已知的B73基因 組序列(http://www. genome, arizona. edu/fpc/maize)，設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增 DNA 片斷 SSR9890 的特異性引物及堿基序列為正向引物從5'端至 3'端為CATGCACCCTTTAGTGTAACAC ；反向引物從5 ‘端至 3 ‘端為GGTACATACATGCAATTTTCGT ；擴(kuò)增DNA片斷SSR7673的特異性引物及堿基序列為正向引物從5'端至 3,端為GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT ；反向引物從5'端至 3'端為GCATTGGCAAGAGCACACTA。通過測(cè)序以及序列比對(duì)，獲得純合突變體與純合野生型親本間的序列差異，并通 過所測(cè)序列開發(fā)標(biāo)記，獲得能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合05類型和純合野生型類 型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性分子標(biāo)記SSR9890與SSR7673。以遺傳學(xué)中兩點(diǎn)與三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)對(duì)這2個(gè)共顯性分子標(biāo)記與05基因的遺傳連鎖關(guān)系 進(jìn)行分析表明，這兩個(gè)標(biāo)記位于05基因染色體物理位置的兩側(cè)，并且均與該基因緊密連鎖 (見附圖 8)。以 SSR9890 與 SSR7673 對(duì) 05 與 B73、Mol7、W22、W64A 和 BSSS53 進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增和凝膠電泳分析表明，SSR9890在05與Mol7、W22都具有多態(tài)性(見附圖9)，SSR7673在 05與Mol7、W22、W64A和BSSS53都具有多態(tài)性(見附圖10)。使用這對(duì)標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇 準(zhǔn)確度很高，在背景Mol7和05純合野生型中，標(biāo)記SSR9890的交換率為9. 52X10—4，標(biāo)記 SSR7673的交換率為9. 52 X 10_4，使用這兩個(gè)標(biāo)記確定05基因的錯(cuò)選率僅為9. 06X 10_7。分子標(biāo)記在不同的基因組背景下PCR擴(kuò)增，觀察帶型，判斷與05的連鎖關(guān)系，參見 圖6和圖7。實(shí)施例三分子標(biāo)記在不同親本間的多態(tài)性鑒定提取05、野生型和五種育種中廣泛使用的自交系B73、W22、Mo 17、W64A和BSSS53的 基因組DNA，通過PCR反應(yīng)分析在不同品種間的多態(tài)性。結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的分子標(biāo) 記SSR7673可以區(qū)別05與Mol7、W22、W64A和BSSS53這四種自交系。在以W22、Mol7、W64A 和BSSS53這四種自交系為背景導(dǎo)入05基因進(jìn)行優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種時(shí)，分子標(biāo)記SSR7673 可以起到對(duì)05基因進(jìn)行輔助選擇的作用，參見圖7。分子標(biāo)記SSR9890可以區(qū)別05與W22、 M017這兩種自交系，參見圖8。實(shí)施例四SSR9890和SSR7673對(duì)05基因分子標(biāo)記輔助選擇的方法利用這兩個(gè)共顯性分子標(biāo)記SSR9890和SSR7673，可以鑒定05的基因型。分子標(biāo) 記SSR9890和SSR7673對(duì)某一雜交組合中的子代進(jìn)行分析，兩側(cè)標(biāo)記同為野生型(Mol7)類 型條帶植株的基因型即為野生型，兩側(cè)的分子標(biāo)記同為雜合體(如Fl)類型條帶植株的基 因型即為雜合體，兩側(cè)的分子標(biāo)記同為05/05純和突變體類型條帶植株的基因型即為突變 體。通過這兩個(gè)分子標(biāo)記對(duì)雜交育種時(shí)子代各個(gè)單株進(jìn)行基因型鑒定的準(zhǔn)確性很高，錯(cuò)選 概率僅為9. 06X10_7，所以這兩種分子標(biāo)記對(duì)利用05基因進(jìn)行育種時(shí)具有重要的輔助作 用。
權(quán)利要求
一種玉米Opaque5基因的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增DNA片斷SSR9890的特異性引物及堿基序列為正向引物從5′端至3′端為CATGCACCCTTTAGTGTAACAC；反向引物從5′端至3′端為GGTACATACATGCAATTTTCGT；擴(kuò)增DNA片斷SSR7673的特異性引物及堿基序列為正向引物從5′端至3′端為GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT；反向引物從5′端至3′端為GCATTGGCAAGAGCACACTA。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米0paqUe5基因的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過 程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米Opaque5基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本分支標(biāo)記擴(kuò)增DNA片斷SSR9890的特異性引物及堿基序列為正向引物從5′端至3′端為CATGCACCCTTTAGTGTAACAC；反向引物從5′端至3′端為GGTACATACATGCAATTTTCGT；擴(kuò)增DNA片斷SSR7673的特異性引物及堿基序列為正向引物從5′端至3′端為GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT；反向引物從5′端至3′端為GCATTGGCAAGAGCACACTA。利用這兩個(gè)分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種子代各單株中O5基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高，操作簡單，為利用O5基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101948830SQ20101019317
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者劉虎, 宋任濤, 張曉維, 王剛, 王桂鳳, 王飛, 陳超, 高強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海大學(xué)