專利名稱：用于檢測食品和飲料中胡蘿卜成分的引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用核酸擴增技術(shù)進行植物源性成分快速檢測的方法，具體是一 種胡蘿卜成分實時熒光PCR檢測用的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
全球經(jīng)濟一體化和貿(mào)易國際化的的不斷擴大，對于發(fā)展中的中國，是機遇也是挑 戰(zhàn)。目前，我國已成為世界上第五大農(nóng)產(chǎn)品出口國，農(nóng)產(chǎn)品進出口貿(mào)易持續(xù)增長。美國、歐 盟、日本等發(fā)達國家和地區(qū)為了維護本國的經(jīng)濟利益，爭奪國際市場，竭力通過名目繁多的 檢驗項目和嚴(yán)格甚至苛刻的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，對進口農(nóng)產(chǎn)品設(shè)置貿(mào)易障礙，導(dǎo)致我國農(nóng)產(chǎn)品出口 增長遭受較大壓力。就進出口的農(nóng)產(chǎn)品而言，合格的產(chǎn)品，不僅要無毒無害，滿足安全衛(wèi)生 要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質(zhì)要求。其中品質(zhì)合格，又主要包含兩方面的含義1.原 料來源與標(biāo)簽一致。2.組分含量與標(biāo)簽一致。歐盟自2006年1月1日起開始實施新的食 品衛(wèi)生法規(guī)，新法規(guī)突出了食品生產(chǎn)過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調(diào)食品的 身份鑒定標(biāo)識與健康標(biāo)識。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 7718-94《食品標(biāo)簽通用標(biāo)準(zhǔn)》和國家出入境 檢驗檢疫局發(fā)布的《進出口食品標(biāo)簽管理辦法》，也明確提出食品標(biāo)簽標(biāo)注內(nèi)容應(yīng)與食品相 符。為此，國家質(zhì)檢總局專門發(fā)文，要求嚴(yán)厲打擊制假制劣的違法行為，對假冒偽劣產(chǎn)品要 依法沒收并監(jiān)督銷毀，追查生產(chǎn)源頭和去向，嚴(yán)防流入消費環(huán)節(jié)。在食品和飲料的生產(chǎn)與銷售中，產(chǎn)品無標(biāo)簽或標(biāo)簽不規(guī)范，利用摻雜摻假、以次充 好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內(nèi)、國外均屢屢發(fā)生。各種原料被加工成食品和飲 料成品后，已無法從外觀對其組成進行鑒定。生產(chǎn)者受利益驅(qū)動，擅自改變產(chǎn)品組成，或摻 入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導(dǎo)致產(chǎn)品的真實屬性與標(biāo)簽不符。這種造假行為不 僅僅涉及經(jīng)濟、營養(yǎng)價值，更直接影響著消費者的健康，可能引發(fā)食源性過敏反應(yīng)。胡蘿卜是一種質(zhì)脆味美的家常蔬菜，素有“小人參”之稱，其富含糖類、脂肪、揮發(fā) 油、胡蘿卜素、維生素A、維生素Bi、維生素B2、花青素、鈣、鐵等多種營養(yǎng)成分，常作為食品 配料用于制作各種糕點、面食和飲料。胡蘿卜雖營養(yǎng)豐富，但同時也是一種常見的食物過敏 原。有文獻報道，胡蘿卜、蘋果、大豆、榛子、獼猴桃、小麥?zhǔn)前亓秩俗畛Ｒ姷氖澄镞^敏原。瑞 士專家報道，大約25%的食物過敏者會對胡蘿卜產(chǎn)生過敏反應(yīng)?！秮嗊\食品安全食品過敏原 標(biāo)識標(biāo)注》地方技術(shù)規(guī)范已于2009年頒布實施，規(guī)范列出可導(dǎo)致過敏反應(yīng)的食品名單，要求 含有名單上過敏原的亞運食品必須如實標(biāo)注，胡蘿卜位列其中。鑒于此，盡快建立可靠有效 的胡蘿卜成分檢測方法，確保食物標(biāo)簽真實準(zhǔn)確，對于減少食源性過敏反應(yīng)發(fā)生，加強食品 過敏原標(biāo)識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意義。食品中植物源性成分檢測，常采用DNA檢測的方法。以DNA為測試對象的方法與以 蛋白為測試對象的方法相比，在食物成分復(fù)雜的情況下，目標(biāo)DNA可以有效提取，受食物基 質(zhì)的影響較??；此外，DNA比較穩(wěn)定，不象蛋白質(zhì)組成那樣受地理條件、季節(jié)變化和加工工 藝的影響。當(dāng)前，基于DNA的檢測方法中，實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、 重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，得到研究者的普遍認(rèn)可，成為檢測的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對胡蘿卜抗凍蛋白，設(shè)計一組特異性引物和探針，進而建立一 種快速檢測胡蘿卜DNA的方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些食品檢測中的局限性， 為胡蘿卜成分檢測提供有效工具，確保食品標(biāo)簽的一致性和消費者的飲食安全。本發(fā)明的主要原理為針對保守序列設(shè)計一組引物(上游引物 5' -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3‘和下游引物5' -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3‘)和一 條 Taqman 探針(序列為5' -FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TAMRA-3 ‘)。進行核 酸檢測時，模板DNA經(jīng)加熱至94-95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模 板特異性結(jié)合。探針的5端標(biāo)記有報告熒光集團，3端有淬滅熒光集團。當(dāng)探針完整的時 候，報告集團所發(fā)射的熒光能量被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq 酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結(jié)合的探針時，其3' -5'外切核酸酶活性就會將探針切 斷，報告集團遠離淬滅集團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。隨著PCR循環(huán)的增加，目 的片段成指數(shù)增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數(shù)量。本發(fā)明涉及的胡蘿卜實時熒光PCR檢測用的引物和探針，其序列如下(1)上游引物5' -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3‘；(2)下游引物5' -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3‘； (3) TaqMan 探針5 ‘ -TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-3 ‘，其 5 ‘端標(biāo)記 FAM 報 告熒光集團，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光集團；在應(yīng)用中，上游引物、下游引物、TaqMan探針的體積比為1 1 1 ；使用上述引物和探針，檢測食品中胡蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟 ⑴-⑶(1)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。(2)胡蘿卜的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應(yīng)管中加入2. 5μ L 10XPCR反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含100mmol/L ρΗ8. 8 的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通Χ-100)、2 μ L 2. 5mmol/ L dNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物，其質(zhì)量比為dUTP dATP dGTP dCTP = 2 1 1 l)、2yL 25讓ol/L硫酸鎂、1 μ L 10 μ mol/L 上游引物、1 μ LlO μ mol/L 下游引 物、IyL 10 μ mol/L Taqman 探針、0. 2 μ L UNG 酶、0. 3yL Taq 酶、14 μ L ddH20(滅菌雙蒸 水)，混勻。B.在PCR反應(yīng)管中加入1 μ L待檢樣品DNA，混勻。C.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增50"C 2min, 1 個循環(huán)，激活 UNG 酶；94-950C 4min, 1個循環(huán)，滅活UNG酶，預(yù)變性；94-95"C 10_20sec ;60°C 20_40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增。擴增時，應(yīng)設(shè)立三個對照陽性對照(取新鮮胡蘿卜提取的基因組DNA)、陰性對照 (非胡蘿卜基因組DNA)、空白對照(不含DNA模板，可以水代替)。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果。
如待測樣品出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值小于或等于41，陰性對照、陽性對照和空白對 照結(jié)果都成立(即陽性樣品出現(xiàn)典型陽性擴增曲線，陰性樣品和空白對照無擴增)，則可判 定該樣品檢出胡蘿卜成分。如待測樣品Ct值大于或等于45，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則 可判定該樣品未檢出胡蘿卜成分。如待測樣品Ct值在41-45之間，應(yīng)重作實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結(jié)果Ct 值仍小于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則可判定該樣品檢出胡蘿卜成 分；再次擴增后的結(jié)果Ct值大于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則可判 定該樣品未檢出胡蘿卜成分?？箖龅鞍资蔷哂袩釡?yīng)和冰晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)的蛋白質(zhì)，在生物受到凍害脅迫 時產(chǎn)生，具有防止細胞受冰凍傷害的功能。1998-1999年，Dawn Worral和Knut Meyer等 先后獨立在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)了具有冷誘導(dǎo)特性的抗凍蛋白。隨后，國內(nèi)外學(xué)者對胡蘿卜抗凍 蛋白進行了一系列研究，對不同品系胡蘿卜的抗凍蛋白基因進行了克隆和轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)， 胡蘿卜抗凍蛋白同其他植物的抗凍蛋白沒有相似的氨基酸序列，但處于不同生存環(huán)境的胡 蘿卜其抗凍蛋白基因保持了很高的種內(nèi)同源性(98.5% )。本發(fā)明根據(jù)胡蘿卜抗凍蛋白基 因的保守序列，設(shè)計了 一組特異性引物和一條特異性Taqman探針。該保守基因序列通過對 Genebank登錄的各物種的抗凍蛋白的核酸序列的比對獲得，可保證胡蘿卜的檢出。本發(fā)明 采用實時熒光PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復(fù)雜 的加工食品和飲料中胡蘿卜的檢測。


圖1用實時熒光PCR技術(shù)檢測某待測胡蘿卜面條樣品DNA，樣品的擴增曲線。圖2用實時熒光PCR技術(shù)檢測某待測番茄米粉樣品DNA，樣品的擴增曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1按照以下程序進行檢測(1)待測胡蘿卜面條樣品DNA的提取A.稱取0. Ig胡蘿卜面條，剪碎，轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中。加入600 μ L預(yù)熱的裂解緩 沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 μ L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液， 混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L緩沖液，上下顛倒混勻10次；Ε.取出離心柱，將離心柱放置在1個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置 2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200 μ L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；G.在離心柱中加入200yL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一 次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的1. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 μ L洗脫 緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。(2)待測胡蘿卜面條DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應(yīng)管中加入2.5yL 10XPCR反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含10(kimol/L pH8. 8 的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通Χ-100)、2 μ L 2. 5mmol/ L dNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物，其質(zhì)量比為dUTP dATP dGTP dCTP = 2 1 1 l)、2yL 25讓ol/L硫酸鎂、1 μ L 10 μ mol/L 上游引物、1 μ LlO μ mol/L 下游引 物、IyL 10 μ mol/L Taqman 探針、0. 2 μ L UNG 酶、0. 3yL Taq 酶、14 μ L ddH20(滅菌雙蒸 水)，混勻。B.在PCR反應(yīng)管中加入1 μ L待檢樣品DNA，混勻。C.將PCR反應(yīng)管中放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增50"C 2min, 1 個循環(huán)，激活 UNG 酶；940C 4min，l個循環(huán)，滅活UNG酶，預(yù)變性；94"C 30sec ；60°C 30sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果樣品出現(xiàn)陽性擴增曲線，Ct值為29. 5，見圖1。陰性對照(芹菜DNA)和空白對照 (水)無擴增，陽性對照(胡蘿卜汁DNA)產(chǎn)生典型陽性擴增曲線，據(jù)此可判定該樣品檢出胡 蘿卜成分。實施例2按照以下程序進行檢測(1)待測番茄米粉樣品DNA的提取A.稱取0. Ig番茄米粉，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入600 μ L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕 輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 μ L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液， 混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L緩沖液，上下顛倒混勻10次；Ε.取出離心柱，將離心柱放置在1個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置 2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加 入200 μ L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；G.在離心柱中加入200 μ L 70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一 次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
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I.將離心柱放置在一個新的1. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 μ L洗脫 緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。(2)待測番茄米粉DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應(yīng)管中加入2· 5μ L 10XPCR反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含10(kimol/LpH8. 8 的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通Χ-100)、2 μ L 2. 5mmol/ L dNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物，其質(zhì)量比為dUTP dATP dGTP dCTP = 2:1:1: l)、2yL 25 讓 ol/L 硫酸鎂、1 μ L 10 μ mol/L 上游引物、1 μ LlO μ mol/L 下游引 物、IyL 10 μ mol/L Taqman 探針、0. 2 μ L UNG 酶、0. 3yL Taq 酶、14 μ L ddH20(滅菌雙蒸 水)，混勻。B.在PCR反應(yīng)管中加入1 μ L待檢樣品DNA，混勻。C.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增50"C 2min, 1 個循環(huán)，激活 UNG 酶；940C 4min，l個循環(huán)，滅活UNG酶，預(yù)變性；94"C 20sec ；60°C 30sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果。樣品未出現(xiàn)陽性擴增曲線，見圖2。陰性對照(豬肉DNA)和空白對照(水)無擴 增，陽性對照(胡蘿卜汁DNA)產(chǎn)生典型陽性擴增曲線，據(jù)此可判定該樣品未檢出胡蘿卜成 分。
權(quán)利要求
一種胡蘿卜成分快速檢測用的上游引物和下游引物，其特征在于上游引物序列為5′ CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA 3′，下游引物序列為5′ CGTCTGACACCCATGAGTCTGT 3′。
2.一種胡蘿卜成分快速檢測用的Taqman探針，其特征在于探針序列為5' -TCAAAA CAGCCTTGAAAAACCCCACCA-3 ‘，其5 ‘端標(biāo)記FAM報告熒光集團，3 ‘端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光集團。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品和飲料中植物源性成分的定性檢測技術(shù)，具體地說是用于檢測食品和飲料中胡蘿卜成分的引物/探針組。本發(fā)明針對胡蘿卜抗凍蛋白，根據(jù)其基因的保守序列，設(shè)計一組特異性引物和探針。使用該引物和探針，采用實時熒光PCR技術(shù)，可快速、靈敏、特異地檢測食品和飲料中胡蘿卜成分。該引物和探針也可以試劑盒的形式和其他試劑一起提供，用于核酸擴增反應(yīng)。該法操作簡便、重復(fù)性好。
文檔編號C12Q1/68GK101921837SQ20101019511
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者劉彩霞, 孫敏, 徐彪, 林超, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心