專利名稱：Cyp4f2和ephx1基因snp檢測液相芯片以及特異性引物的制作方法
CYP4F2和EPHX1基因SNP檢測液相芯片以及特異性引物技術(shù)領域
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體的是涉及一種CYP4F2 和EPHXl基因檢測液相芯片以及特異性引物。
背景技術(shù)：
細胞色素P4504F2 (Cytochrome P450，CYP4F2)是環(huán)境代謝酶細胞色素P450超 家族成員之一，是人類腎臟代謝花生四烯酸(arachidonic acid，AA)產(chǎn)生20-羥二十碳 四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)最主要的酶，20-HETE 具有收縮血 管和調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)的重要作用，腎臟20-HETE合成的不足與高血壓的發(fā)生關(guān)系密切， 因此CYP4F2成為高血壓發(fā)生的重要影響因素。研究表明，發(fā)生在CYP4F2的W12G 和V433M突變將導致20-HETE比對照減少至56 % -66 %的量。其中，CYP4F2的 W12G(rs3093105, T34G)即 CYP4F2*2，而 V433M(rs2108622，G1297A)發(fā)生在外顯子 2。
微粒體環(huán)氧化物水解酶(Microsomalepoxide hydrolase, mEH, EPHX1)是一種重要的生物轉(zhuǎn)化的II相代謝酶，該酶由定位于人類染色體lq42.1的EPHXl基因編碼， 具有高度保守性。它催化多種環(huán)氧化中間產(chǎn)物水解為更易溶于水的反式二氫二醇排出 體外。研究表明，EPHXl基因編碼區(qū)的多態(tài)性通過影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而改變酶的活 性。外顯子3的T — C轉(zhuǎn)變使Tyrll3被His取代(rsl051740，T337C)，導致酶活性下 降39% ；外顯子4的A — G轉(zhuǎn)變使Hisl39被Arg取代(rs2234922，A416G)，導致酶活 性升高25%，有研究表明，EPHXl酶活的下降有利于預防肺癌，但此多態(tài)性與偶發(fā)性的 結(jié)直腸癌的風險并不相關(guān)。
目前對CYP4F2和EPHXl多態(tài)性的檢測產(chǎn)品一般是基于PCR技術(shù)的熒光定量 PCR法、RFLP法和DNA測序法等，存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點， 同時由于檢測通量的局限性，不能滿足實際應用的需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種CYP4F2基因SNP檢測液相芯片，該液相芯片可 用于檢測CYP4F2基因兩種常見基因型G1297A和T34G的野生型和突變型。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
一種CYP4F2基因SNP檢測液相芯片，主要包括有
(A)針對CYP4F2基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物 對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物 組成，所述特異性引物是針對G1297ASNP位點的SEQIDN0.13*SEQIDN0.14、 和/或針對TiMG SNP位點的SEQID NO. 15和SEQ ID N0.16 ；所述tag序列選自SEQ ID N0.1 SEQID NO. 12 ；
(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQID N0.25 SEQ ID N0.36中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A) 中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；
(C)用于擴增出具有G1297A和/或T34G的SNP位點的CYP4F2基因目標序列 的擴增引物。
優(yōu)選地，所述擴增引物為針對G1297A SNP位點的SEQ ID N0.37 SEQ ID N0.38，和 / 或針對 T34G SNP 位點 SEQ ID N0.39 SEQ ID N0.40。
更優(yōu)選地，所述ASPE引物對為針對G1297A SNP位點的由SEQ ID N0.1和 SEQ ID NO. 13組成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 14組成的序列、禾Π /或針 對T;34G SNP位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 15組成的序列以及由SEQ ID N0.4和 SEQ ID NO. 16組成的序列。
本發(fā)明的另一目的，是提供一種CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，該 液相芯片可以對CYP4F2和EPHXl基因進行同步檢測。
具體技術(shù)方案如下
一種CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，主要包括有
(A)針對CYP4F2基因和EPHXl基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型 的ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特 異性引物組成，所述特異性引物是針對CYP4F2基因G1297ASNP位點的SEQIDN0.13 和 SEQ ID N0.14、禾口 / 或針對 CYP4F2 基因 TMG SNP 位點的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；以及針對 EPHXl 基因 G;357A SNP 位點的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID N0.18、針對 EPHXl 基因 G195U990A SNP 位點的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID N0.20、針對 EPHXl 基 因 T337C SNP 位點的 SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22、禾Π / 或針對 EPHXl 基因 A416G SNP 位點的 SEQ IDN0.23 和 SEQ ID Ν0.24 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 12 ；
(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列選自SEQID N0.25 SEQ ID N0.36中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A) 中所選的tag序列互補配對，且所述anti-teg序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；
(C)用于擴增具有G1297A和/或T34G的SNP位點的CYP4F2基因目標序列的 擴增引物；以及用于擴增具有G;357A、G19512990A> T337C、和/或A416G的SNP位 點的EPHXl基因目標序列的擴增引物。
優(yōu)選地，所述擴增引物為針對CYP4F2基因G1297A SNP位點的SEQ ID N0.37 SEQ IDN0.38,禾口 / 或針對CYP4F2 基因 T34G SNP 位點 SEQ ID N0.39 SEQ ID N0.40 ； 以及針對 EPHXl 基因 G357ASNP 位點的 SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42、針對 EPHXl 基因 G195U990ASNP 位點的 SEQ ID N0.43 和 SEQ ID N0.44、針對 EPHXl 基因 T337C SNP位點的SEQ ID N0.45和SEQ ID N0.46、禾Π /或針對EPHXl基因A416G SNP位點的 SEQ ID Ν0.47 和 SEQ ID Ν0.48。
進一步地，所述ASPE引物對為針對G1297A SNP位點的由SEQ ID Ν0.1和 SEQ IDN0.13組成的序列以及由SEQ ID Ν0.2和SEQ ID Ν0.14組成的序列、禾口 /或針對 T34G SNP位點的由SEQ ID Ν0.3和SEQ ID NO. 15組成的序列以及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.16組成的序列；以及針對EPHXl基因G357ASNP位點的由SEQ ID N0.5和SEQID NO. 17組成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO.18組成的序列、針對EPHXl基 因G195U990A SNP位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.19組成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.20組成的序列、針對EPHXl基因T337C SNP位點的由SEQ ID N0.9 和SEQ ID N0.21組成的序列以及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.22組成的序列、禾Π /或 針對EPHXl基因A416G SNP位點的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.23組成的序列以及 由SEQ ID NO. 12和SEQ ID N0.24組成的序列。
優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個T。
本發(fā)明的另一目的是提供用于CYP4F2基因SNP檢測的特異性引物。
具體技術(shù)方案如下
用于CYP4F2基因SNP檢測的特異性引物，包括有針對G1297A SNP位點的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID N0.14、禾口 / 或針對 T34G SNP 位點的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID N0.16。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1.本發(fā)明所提供的檢測液相芯片與測序法的吻合率高達100%。所制備的 CYP4F2基因SNP檢測液相芯片以及CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片具有非常 好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag 標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免 交叉反應，實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。
2.本發(fā)明設計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準確區(qū)分各種型別 的基因型。
3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，在CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片 中，六種SNPs檢測可通過一步多重PCR即可完成六個含有SNP位點的目標序列的擴增， 避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準 確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。
4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù)，特別符合 實際應用需要；且多種ASPE特異性引物的組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢 測效果完好的系統(tǒng)。
5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復性差的缺 陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目， 具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提 高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準確可靠。
具體實施方式
實施例1CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，主要包括有
一、ASPE 引物
針對CYP4F2基因的兩種常見SNP位點G1297A(rs2108622) 禾口 T34G(rs3093105)、EPHXl 基因的 SNP 位點 G357A (rs2292566)、 G19512990A(rs4653436), T337C (rsl051740)和 A416G 0^22:3492 ，分別設計特異性引 物序列。ASPE引物由“Tiig序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所不
表1 ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種CYP4F2基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對CYP4F2基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對 每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成， 所述特異性引物是針對G1297ASNP位點的SEQIDN0.13*SEQIDN0.14、和/或針 對 T34G SNP 位點的 SEQID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.12 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQID N0.25 SEQ ID N0.36中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中 所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增出具有G1297A和/或T34G的SNP位點的CYP4F2基因目標序列的擴 增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP4F2基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引 物為針對G1297A SNP位點的SEQ ID N0.37 SEQ ID N0.38，禾Π /或針對T34G SNP位 點 SEQ ID Ν0.39 SEQ ID Ν0.40。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP4F2基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE 引物對為針對G1297ASNP位點的由SEQIDN0.1和SEQIDN0.13組成的序列以及由 SEQ ID Ν0.2和SEQ ID NO. 14組成的序列、和/或針對T34G SNP位點的由SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.15組成的序列以及由SEQ ID N0.4禾Π SEQ ID Ν0.16組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的CYP4F2基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所 述間隔臂序列為5-10個Τ。
5.—種CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對CYP4F2基因和EPHXl基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的 ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異 性引物組成，所述特異性引物是針對CYP4F2基因G1297A SNP位點的SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID N0.14、禾口 / 或針對 CYP4F2 基因 T34G SNP 位點的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID N0.16 ；以及針對 EPHXl 基因 G357ASNP 位點的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO.18、針對 EPHXl 基因 G19512990A SNP 位點的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID N0.20、針對 EPHXl 基 因 T337C SNP 位點的 SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22、禾Π / 或針對 EPHXl 基因 A416G SNP 位點的 SEQ IDN0.23 和 SEQ ID Ν0.24 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 12 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQID N0.25 SEQ ID N0.36中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中 所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增具有G1297A和/或T34G的SNP位點的CYP4F2基因目標序列的擴增 引物；以及用于擴增具有G357A、G19512990A、T337C、和/或A416G的SNP位點的 EPHXl基因目標序列的擴增引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所 述擴增引物為針對CYP4F2基因G1297A SNP位點的SEQ ID N0.37 SEQ ID N0.38、和 / 或針對 CYP4F2 基因 T34G SNP 位點 SEQ ID N0.39 SEQ ID N0.40 ；以及針對 EPHXl基因 G357ASNP 位點的 SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42、針對 EPHXl 基因 G19512990A SNP 位點的 SEQ IDN0.43 和 SEQ ID N0.44、針對 EPHXl 基因 T337C SNP 位點的 SEQ ID N0.45 和 SEQ ID N0.46、禾Π / 或針對 EPHXl 基因 A416G SNP 位點的 SEQ ID Ν0.47 和 SEQ ID Ν0.48。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所 述ASPE弓丨物對為針對Gl297Α SNP位點的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 13組成的序列 以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 14組成的序列、禾Π /或針對T34G SNP位點的由SEQ ID Ν0.3和SEQ ID NO. 15組成的序列以及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 16組成的序列； 以及針對EPHXl基因G357A SNP位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 17組成的序列以 及由SEQ IDN0.6和SEQ ID NO. 18組成的序列、針對EPHXl基因G19512990A SNP位點 的由SEQ ID N0.7和SEQ ID NO.19組成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.20組 成的序列、針對EPHXl基因T337C SNP位點的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21組成的 序列以及由SEQ ID NO.10和SEQID N0.22組成的序列、禾口 /或針對EPHXl基因A416G SNP位點的由SEQ ID NO. 11和SEQ IDN0.23組成的序列以及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID N0.24組成的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項所述的CYP4F2和EPHXl基因SNP檢測液相芯片，所述 間隔臂序列為5-10個T。
9.用于CYP4F2基因SNP檢測的特異性引物，其特征是，包括有針對G1297ASNP位 點的 SEQID N0.13 和 SEQ ID N0.14、和 / 或針對T34G SNP位點的 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO. 16。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CYP4F2基因SNP檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物是針對G1297A SNP位點的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、和/或針對T34G SNP位點的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；微球；擴增引物。本發(fā)明還提供了一種CYP4F2和EPHX1基因SNP檢測液相芯片，其除了具有CYP4F2基因SNP檢測液相芯片的對應的組成外，還具有針對EPHX1基因的G357A、G19512990A、T337C和/或A416GSNP位點的ASPE引物對、微球以及擴增引物。所述檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，能夠避免交叉反應，且可以實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102021237SQ201010196818
公開日2011年4月20日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者余剛, 曾濤, 秦會娟, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司