專利名稱：一種新型神經營養(yǎng)因子及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型神經營養(yǎng)因子的克隆、制備與應用，涉及遺傳工程領域，屬于 生物技術領域。
背景技術：
神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是主要作用于外周神經系統(tǒng)的感覺和 交感神經元的蛋白質，通過細胞表面特異受體支持靶神經元的生存、促進神經突起的生長 和增強神經元的分化。NGF的作用導致神經元細胞膜結構、蛋白磷酸化狀態(tài)和特定基因表 達水平的改變。前腦膽堿能神經元也是NGF的靶細胞，并且NGF的營養(yǎng)支持作用是必須的。 NGF及其受體在中樞神經系統(tǒng)的分布和發(fā)育學特點表明，NGF是基底前腦膽堿能神經元的 靶源性神經營養(yǎng)因子。繼NGF被發(fā)現之后，又有許多神經營養(yǎng)因子被鑒定出來，包括腦源性神經營養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、睫狀神經營養(yǎng)因子(ciIiarneurotrophic factor，CNTF)、膠質源性神經營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophicfactor，⑶NF) 等。除了營養(yǎng)支持作用，近些年對神經營養(yǎng)因子功能研究的突破在于，神經營養(yǎng)因子可以調 控神經突觸可塑性，參與學習和記憶的形成。神經營養(yǎng)因子改變參與大量神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。神經營養(yǎng)因子已經廣泛用 于神經系統(tǒng)疾病模型的治療，效果明確。相關臨床實驗也在進行之中，BDNF用于治療脊髓 側索硬化癥的三期臨床實驗表明高劑量有療效。NGF用于阿爾茨海默病的治療已經通過臨 床二期實驗。GDNF用于治療帕金森病的臨床二期實驗效果明顯，但臨床三期實驗效果不明 顯，可能跟整個治療環(huán)節(jié)不夠完善有關系。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于鑒定一種新型神經營養(yǎng)因子，獲得其編碼核苷酸序列，通過培 養(yǎng)細胞重組表達獲得該因子，制備該因子的抗體，提供利用該基因和蛋白進行疾病診斷、預 防保健和治療的方法。本發(fā)明首次提供一種新型神經營養(yǎng)因子的核苷酸序列，該序列包含完整編碼區(qū)， 該神經營養(yǎng)因子主要由神經元細胞合成并分泌，因此命名為神經元衍生的神經營養(yǎng)因子 (neuron-derived neurotrophic factor,NDNF)。一方面，獲得的編碼完整NDNF的核苷酸片 段保存于載體上；同時，含有NDNF編碼區(qū)的載體轉染培養(yǎng)細胞，從培養(yǎng)基上清中獲得NDNF 蛋白。獲得的NDNF蛋白作用于原代培養(yǎng)神經元，結果表明NDNF蛋白可以促進神經元遷移 和分化成熟，因此可以用于神經系統(tǒng)疾病的預防保健、診斷和治療。本發(fā)明的目的是這樣實現的從正常人腦組織中提取總RNA，進行反轉錄合成 cDNA—鏈，以之為模板，采用引物進行PCR擴增；擴增出的特異片段電泳回收，使用XhoI和 HindIII限制性內切酶進行酶切，然后克隆到pcDNA3. 1 (-Vmyc-His A質粒載體上，進行序 列測定，測序得到的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列(見序列表)，該序列編碼的蛋白質含有568個氨基酸殘基，分子量為64. 7kD ；經與相關數據庫檢索對照發(fā)現，未發(fā)現與所示序 列相同的已知功能的序列，證明本發(fā)明得到的蛋白質屬于功能未知的新蛋白質。功能實驗 研究表明該蛋白質可以促進神經元遷移和分化成熟，屬于神經營養(yǎng)因子。結構分析表明，該 蛋白含有III型纖連蛋白結構域，與經典的NGF家族神經營養(yǎng)因子結構不同。同時，組織分 布和細胞分布實驗研究表明，該蛋白主要在神經系統(tǒng)的神經元表達。綜上結果，我們將其命 名為神經元衍生的神經營養(yǎng)因子(neuron-derived neurotrophic factor, NDNF)。另外，由于專業(yè)人士常使用C0S7(非洲綠猴腎細胞系)制備基因重組蛋白質，因而 本發(fā)明采用C0S7細胞制備神經營養(yǎng)因子NDNF。具體過程為⑶S7細胞采用DMEM培養(yǎng)基、 10%胎牛血清、37°C和5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。轉染前一天細胞鋪六孔板，轉染當天大約 50%-60%的匯合度，轉染前4小時，換新鮮培養(yǎng)液(不含血清和抗生素)。配制轉染溶液 加入，孵箱孵育2-3小時后，換上含血清和抗生素的培養(yǎng)液，48小時后收集培養(yǎng)基上清，采 用蛋白免疫印跡法鑒定上清中含有的NDNF蛋白，該上清用于Transwel 1實驗，驗證NDNF是 否具有促進神經元遷移和分化成熟功能。Transwell小室培養(yǎng)實驗中，如果下層蛋白對上層細胞有營養(yǎng)作用和/或促進遷 移作用，上層細胞就會遷移到膜朝下的一側，通過計數遷移過來的細胞和觀察其形態(tài)，就可 以知道下層蛋白的作用。本實驗結果中，鏡檢可以發(fā)現NDNF和BDNF都可以促進神經元突 起生長，而且NDNF組神經元胞體更大和突起更長(如圖1所示)；同時，對照組遷移過來的 細胞很少，NDNF組和BDNF組遷移過來的細胞數目較多，圖2顯示統(tǒng)計數據，縱坐標表示每個 視野遷移過來的細胞數，對照組、NDNF組和BDNF組分別有22士3、71 士5和80士7個細胞發(fā) 生了遷移?？傊搶嶒灲Y果表明NDNF可以促進神經元遷移和分化成熟，并且其效果優(yōu)于 已知的BDNF，因此本發(fā)明所提供的神經營養(yǎng)因子NDNF可以用于神經系統(tǒng)疾病的預防保健、 診斷和治療。本發(fā)明通過人工合成NDNF羧基末端肽段與免疫原融合，免疫動物并從動物血清 中獲得針對NDNF的抗體，制備的抗體(IgG，免疫球蛋白)采用抗原進行ELISA鑒定，制備的 抗體(IgG，免疫球蛋白)用于檢測NDNF蛋白的組織分布和細胞分布。免疫印跡研究表明 NDNF主要在神經系統(tǒng)表達，包括中樞神經系統(tǒng)和脊髓；免疫熒光研究表明NDNF主要在神經 系統(tǒng)的神經元表達。其中，抗體的制備過程如下 人工合成人NDNF羧基末端肽段SVKYQSKWKTRKFC，進行HPLC純度分析和MS鑒定， 純度大于80%。將合成的肽段與KLH/BSA蛋白偶聯，制成免疫原。用生理鹽水稀釋免疫原， 然后與相應的佐劑進行1 1混合。抗原和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子 雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿進行肌肉注射。每個區(qū)域大約用1/4的免疫原。 具體免疫程序如下第0星期，采血2ml (獲得0. 5ml免疫前血清)，用完全弗氏佐劑混合的200 μ g抗 原免疫2只兔子。第2星期，用完全弗氏佐劑混合的200 μ g抗原進行第二次免疫。第4星期，用不完全弗氏佐劑混合的100 μ g抗原進行加強免疫。第5星期，取檢測血清，ELISA檢測，用溶解在生理鹽水中的100 μ g抗原免疫進行 持續(xù)免疫。第6-9星期，檢測陽性，每周采血20_30ml，并用溶解在生理鹽水中的100 μ g抗原進行持續(xù)免疫。從兔血中分離得到血清，用Protein A/G對混合血清進行親和純化，獲得純化總 IgG IOmg左右，純度> 95%，最后進行ELISA和WB進行質量檢測。


圖1為NDNF促進原代培養(yǎng)神經元遷移的Transwell實驗鏡檢結果照片(以BDNF 作為陽性對照)圖2為NDNF促進原代培養(yǎng)神經元遷移的Transwel 1實驗統(tǒng)計數據直方圖(以BDNF 作為陽性對照)
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。實施例1從正常人腦組織中提取總RNA，進行反轉錄合成cDNA —鏈，以之為模板，采用下述 兩條引物進行PCR擴增正義引物5'-CCGCTCGAGAGGATGGTGCTGCTCCACTGGT-3'反義引物5'-CCCAAGCTTACAGAACTTTCTAGTTTTCACAACC-3'PCR擴增體系蒸餾水IOX緩沖液dNTP (2. 5mM)cDNA 模板正義引物反義引物耐熱DNA聚合酶_總體系PCR擴增條件 擴增出的特異片段電泳回收，使用XhoI和HindIII限制性內切酶進行酶切，然后克隆到pcDNA3. l(-)/myC-His A質粒載體上，進行序列測定(見序列表)，該序列編碼的 蛋白質含有568個氨基酸殘基，分子量為64. 7kD ；經與相關數據庫檢索對照發(fā)現，屬于功 能未知的新蛋白質。功能實驗研究表明該蛋白質可以促進神經元遷移和分化成熟，屬于 神經營養(yǎng)因子。結構分析表明，該蛋白含有III型纖連蛋白結構域，與經典的NGF家族神 經營養(yǎng)因子結構不同。同時，組織分布和細胞分布實驗研究表明，該蛋白主要在神經系統(tǒng) 的神經元表達。綜上結果，我們將其命名為神經元衍生的神經營養(yǎng)因子(neuron-derived neurotrophic factor, NDNF)。實施例2C0S7 (非洲綠猴腎細胞系，常用于制備基因重組蛋白質)細胞采用DMEM培養(yǎng)基、 10%胎牛血清、37°C和5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。轉染前一天細胞鋪六孔板，轉染當天大約 50% -60%的匯合度，轉染前4小時，換新鮮培養(yǎng)液(不含血清和抗生素)。配制轉染溶液A 液 2 μ g DNA6. 2μ L IMCaCl2X 體積 H2O_共 25 μ LB 液 25 μ L2 X HBS (Hank ‘ s 平衡鹽溶液)A液加入B液中，混勻，室溫靜置20分鐘，滴入六孔板中，孵箱孵育2-3小時后，換 上含血清和抗生素的培養(yǎng)液，48小時后收集培養(yǎng)基上清，采用蛋白免疫印跡法鑒定上清中 含有的NDNF蛋白，該上清用于實施例3中的Transwell實驗。實施例3 24孔Transwell板(膜孔徑8um)，使用多聚賴氨酸和Iaminin蛋白包被，取PO小 鼠腦組織，剝取海馬，胰酶消化液消化，獲得的細胞懸液種植在上層小室中，下層分別加入 含對照組份的神經元培養(yǎng)基，含NDNF的神經元培養(yǎng)基及含BDNF的神經元培養(yǎng)基，37°C,5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)48小時后，小室浸入甲醇中固定20min，然后0. 結晶紫染色20min， 刮去小室上層細胞，光學顯微鏡下觀察穿過小孔的神經元并計數。結果如附圖1和圖2所示。附圖1顯示的是顯微鏡下細胞觀察照片，對照組遷移 過來的細胞很少，NDNF組和BDNF組遷移過來的細胞數目較多；同時，可以發(fā)現NDNF和BDNF 都可以促進神經元突起生長，而且NDNF組神經元胞體更大和突起更長。附圖2顯示統(tǒng)計數 據，縱坐標表示每個視野遷移過來的細胞數，對照組、NDNF組和BDNF組分別有22士3、71 士5 和80士7個細胞發(fā)生了遷移。總之，該實驗結果表明NDNF可以促進神經元遷移和分化成熟， 可以用于神經系統(tǒng)疾病的預防保健、診斷和治療。以上實施例僅用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但本發(fā)明并不限于上述實施方 式，在所述領域普通技術人員所具備的知識范圍內，本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何 修改、等同替代和改進等，其均應涵蓋在本發(fā)明請求保護的技術方案范圍之內。
權利要求
一種新型神經營養(yǎng)因子，其核苷酸序列和編碼的氨基酸序列如序列表所示。
2.與權利要求1的核苷酸序列互補或可雜交的核酸分子。
3.一種包含權利要求1或2的核酸分子的表達載體。
4.一種多肽，含有權利要求1的完整氨基酸序列的全長蛋白質或具有生物學活性的片斷。
5.權利要求4的多肽的抗體。
6.權利要求1或2的核酸分子作為制備神經系統(tǒng)疾病治療藥物的應用。
7.權利要求1或2的核酸分子作為制備神經系統(tǒng)疾病診斷試劑的應用。
8.權利要求1或2的核酸分子作為診斷和治療神經系統(tǒng)疾病的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型神經營養(yǎng)因子NDNF及其制備方法和應用，獲得NDNF的核苷酸序列，該序列編碼的蛋白質含有568個氨基酸殘基，分子量為64.7kD；經與相關數據庫檢索對照發(fā)現NDNF屬于功能未知的新蛋白質。本發(fā)明通過培養(yǎng)細胞重組表達獲得NDNF；功能實驗研究表明該蛋白質可以促進神經元遷移和分化成熟，因此可以用于神經系統(tǒng)疾病的預防保健、診斷和治療。
文檔編號C12Q1/68GK101885766SQ20101019690
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權日2010年6月10日
發(fā)明者匡秀麗, 孫國濤, 趙小美 申請人:河南大學