專利名稱：提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST及其制備以及利用其編碼的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于新基因的制備，特別是指一種能提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST 的制備以及利用其編碼的蛋白。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，干旱、半干旱地區(qū)及鹽堿地占國(guó)土面積的1/2左右，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的發(fā) 展；在河北省，近幾年來(lái)連續(xù)干旱的嚴(yán)峻形勢(shì)以及黑龍崗地區(qū)和中西部地區(qū)土壤鹽漬化和 次生鹽漬化程度的增加，不僅造成了一些重要農(nóng)作物的大量減產(chǎn)，也減少了地表的植被覆 蓋，惡化了生態(tài)環(huán)境。隨著科技的進(jìn)步，利用基因工程手段改良、提高植物的抗旱、耐鹽能力 已經(jīng)成為植物抗逆性改良的重要手段，而抗旱、耐鹽基因的篩選和鑒定則是植物抗逆基因 工程育種的首要基礎(chǔ)性工作。谷胱甘肽(glutathione，GSH)普遍存在于生物體內(nèi)，含量豐富，其作為生物 體內(nèi)主要的還原態(tài)硫之一，在還原態(tài)硫的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)和核酸的合成、清除自由 基以及維持細(xì)胞膜的完整性等方面具有重要作用。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)是由一個(gè)大的多基因家族編碼的多功能蛋白酶，能催化GSH和親電 子的異源物質(zhì)發(fā)生接合反應(yīng)，并在細(xì)胞各部分內(nèi)源代謝中作為多種化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合蛋白和 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白催化依賴于GSH的生物轉(zhuǎn)化。其表達(dá)受多種環(huán)境因子的誘導(dǎo)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、 次生代謝和抗逆中有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種能提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽能力的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移 酶LcGST基因。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供利用該基因編碼的蛋白。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST，其序列如下ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCATATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTTAGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCTGGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGTGCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATTTATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAAAGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGAGACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACTTACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG
GAGAGTCAGA GAGGAACAAG CATCCACAAT GTGGAATGAT CTGGGCTGAT AAATGAAGAA ACAGCTCGGA TGTTCCATTC TGAGTGCCCC
4
AAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCATGACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。百脈根是一種建設(shè)生態(tài)農(nóng)業(yè)的優(yōu)質(zhì)草種，在保持水土，防止土壤荒漠化等方面起 到了巨大作用。百脈根具有基因組小、再生容易以及易于遺傳轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，近幾年已被作為 豆科植物中的模式植物而用于分子生物學(xué)的研究。本發(fā)明申請(qǐng)人利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信 息中心(NCBI)中已知的大豆谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因作為探針，在百脈根EST數(shù)據(jù)庫(kù)中檢 索，利用DNAMAN軟件對(duì)檢索到的EST序列進(jìn)行電子拼接，獲得了含有完整開(kāi)放閱讀框的拼 接序列，并對(duì)該基因進(jìn)行了克隆。具體方法如下提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備，制備方法包括(1)首先以已知的大豆谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù) 信息中心百脈根的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)中為L(zhǎng)cGST基因?qū)ふ易C據(jù)，獲得同源性很高3條EST 序列，序列號(hào)分別為BW597792. UBW599863. 1和BW594579. 1，利用DNAMAN軟件對(duì)檢索獲得 的EST序列進(jìn)行電子拼接，獲得了相應(yīng)的含有完整開(kāi)放閱讀框的拼接序列；(2)依拼接序列設(shè)計(jì)特異性引物，LcGST基因的外側(cè)上游引物為 5，-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3，，外側(cè)下游引物為 5，-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3，；內(nèi)側(cè)上 游引物為 5，-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3，，內(nèi)側(cè)下游引物為 5，-CTGGGATCCCT CGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3，，將內(nèi)側(cè)上、下游引物分別引入Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn)；(3)利用設(shè)計(jì)的特異性引物以百脈根培養(yǎng)21天后的葉片組織cDNA為模板進(jìn)行巢 式PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶；(4)PCR終產(chǎn)物回收后與pMDIS-T連接，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a的感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序與預(yù)期結(jié)果一致。利用可提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST編碼的蛋白，其序列如下Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Ala Ser Pro PheMet Arg Val Arg lie Ala Leu Ala Glu Lys Gly lie Asn Tyr GluLys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln SerPro Val His Lys Lys lie Pro Val Leu lie His Asn Gly Lys ProAla Glu Ser Leu lie Ala Val Gln Tyr lie Asp Glu Val Trp AsnAla Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln AlaPhe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys lie Tyr Glu lie Gly Arglie lie Trp Lys Lys Asn Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Lys Glulie Asp Cys Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys ThrPhe Gly Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Val Asp lie Ala Leu Val ProTyr Thr Trp Phe Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Phe Asn lieSer Glu Cys Pro Lys Leu lie Ala Trp Ala Lys Arg Cys Leu GlnGlu Ser Val Ser Lys Ser Leu His Asp Gln Asp Lys lie Tyr Glulie Val Glu lie Arg Lys Lys Leu Gly lie Glu0本發(fā)明的基因制備中具體的工藝步驟和工藝條件是步驟(3)是利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以百脈根培養(yǎng)21天后葉片組織的cDNA為模 板在擴(kuò)增儀上按照94°C預(yù)變性5分鐘；30個(gè)PCR循環(huán)94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C
Gly Tyr Asn Ile Asp Arg Asn Phe Tyr Phe Glu Lys Phe
5延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以此PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μ 1作 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照94°C預(yù)變性5分鐘；30個(gè)PCR循環(huán)94°C變性30秒，56°C退火30 秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的條件進(jìn)行，兩次PCR反應(yīng)均按如下成份及用量進(jìn)
行
ddH2010. 5μ 1
IOx PCR Buffer2μ 1
dNTP(2. 5mmol/L)2μ 1
10umol/L的上游引物2μ 1
10umol/L下游引物2μ 1
模板1 μ 1
Taq plus DNA polymerase(5U/μ 1)0. 5μ 1
所述的步驟⑷是將內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠上切下，按上海生物
工程有限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extraction KitUNlQ-IO柱式DNA膠回收試劑 盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收，在16°C下經(jīng)T4DNA連接酶連接12小時(shí)，10 μ 1連接反應(yīng)體系如下IOXLigation Buffer1 μ 1pMD18-T 載體(50ng/ μ 1)1 μ 1膠回收產(chǎn)物7μ1T4DNA 連接酶(350U/ μ 1)1 μ 1將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆，送往上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè) 序與預(yù)期結(jié)果一致，將其命名為L(zhǎng)cGST。本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和取得的顯著技術(shù)進(jìn)步在于其一、目前百脈根被認(rèn)為是豆科模式植物，通常被用來(lái)研究豆科植物和根瘤菌的 共生關(guān)系，由其基因組中進(jìn)行抗旱、耐鹽相關(guān)基因的克隆研究報(bào)道較少，本發(fā)明所克隆的 LcGST基因在此種植物中為首次報(bào)道。其二、利用本發(fā)明所克隆的LcGST獲得的轉(zhuǎn)基因生物的耐鹽性顯著提高。這不僅 有助于揭示豆科植物抗旱、耐鹽的機(jī)理，為生物的抗旱耐鹽代謝途徑的研究提供重要理論 基礎(chǔ)，也為植物基因工程領(lǐng)域提供了更多的候選功能基因，對(duì)利用基因工程手段進(jìn)行植物 遺傳性狀的改良具有重要參考價(jià)值。


本發(fā)明的附圖有圖1是本發(fā)明中兩次PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，分別獲得約 700bp左右的一條特異帶圖。圖中M是DL 2000Marker，l是內(nèi)側(cè)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2是外側(cè)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是LcGST編碼氨基酸的同源比對(duì)結(jié)果。圖中GmGST、VvGST, RcGST分別來(lái)源于大豆、葡萄和蓖麻，GenBank注冊(cè)號(hào)分別為 ACL80571、ABL84692、XP_002532823。將LcGST基因推斷的編碼氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)它與多種植物體內(nèi)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶均有一定相似度，經(jīng)DNAMAN軟件對(duì)其與大 豆GmGST、葡萄VvGST、蓖麻RcGST進(jìn)行相似性分析顯示，相似性分別為80. 6 %、76. 3 %和 73. 5% (圖2)，證明所克隆基因的編碼產(chǎn)物為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。圖3是質(zhì)粒pET_32a(+)-LcGST雙酶切檢測(cè)結(jié)果。圖中 1 是 pET_32a(+)-LcGST 的酶切產(chǎn)物，2 是 DL 2000Marker,3 是 DL 15000Marker，4 是 pET_32a(+)的酶切產(chǎn)物。圖4是E. coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后目的融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中1、3、5分別為含重組質(zhì)粒pET-32a(+)_LcGST、空質(zhì)粒pET_32a(+)和不含 外源質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)取得的總蛋白；2、4、6分別為含重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-LcGST、空質(zhì)粒pET-32a(+)和不含外源質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)2小時(shí)后取得的總蛋白；7為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。其中箭頭a表示融合蛋白；箭頭b表示標(biāo)簽蛋白。圖5是NaCl處理?xiàng)l件下含重組質(zhì)粒pET_32a (+) -LcGST、空質(zhì)粒pET_32a (+)的大 腸桿菌生長(zhǎng)情況分析。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做進(jìn)一步的描述，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限 定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。本實(shí)施例中的基因序列以及由其編碼的蛋白質(zhì)序列如前述，其中基因的制備方法 及功能鑒定包括1、提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備(1)首先通過(guò)電子拼接獲得基因序列以已知的大豆的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中 心(NCBI)百脈根表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)中為L(zhǎng)cGST基因?qū)ふ易C據(jù)，獲得同源性很高的3條 EST序列，序列號(hào)分別為BW597792. UBW599863. 1和BW594579. 1。利用DNAMAN軟件對(duì)檢索 獲得的EST序列進(jìn)行電子拼接，獲得了相應(yīng)的含有完整開(kāi)放閱讀框的拼接序列。(2)以拼接序列設(shè)計(jì)特異性引物，LcGST基因的外側(cè)上游引物為 5，-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3，，外側(cè)下游引物為 5，-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3，；內(nèi)側(cè)上 游引物為 5，-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3，，內(nèi)側(cè)下游引物為 5，-CTGGGATCCCT CGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3，，將內(nèi)側(cè)上、下游引物分別引入Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn)；(3)利用設(shè)計(jì)的特異性引物以百脈根培養(yǎng)21天后的葉片組織的cDNA為模板進(jìn)行 巢式PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶；(4)PCR終產(chǎn)物回收后與pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，熱激轉(zhuǎn)化后，篩 選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序與預(yù)期結(jié)果一致。步驟(3)是利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以百脈根培養(yǎng)21天后葉片組織的cDNA為模 板在擴(kuò)增儀上按照94°C預(yù)變性5分鐘；30個(gè)PCR循環(huán)94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C 延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以此PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μ 1作 模板進(jìn)行PGR擴(kuò)增，按照94°C預(yù)變性5分鐘；30個(gè)PCR循環(huán)94°C變性30秒，56°C退火30 秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的條件進(jìn)行，兩次PCR反應(yīng)均按如下成份及用量進(jìn)
7仃ddH20IOxPCR BufferdNTP(2. 5mmol/L)10umol/L的上游引物10umol/L 下游引物模板Taq plus DNA polymerase(5U/μ 1)
10. 5μ 1
2μ 1 2μ 1 2μ 1 2μ 1
1 μ 1 0. 5μ 1 步驟(4)是將內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠上切下，按上海生物工程有 限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit UN1Q-10柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行膠回收，在16°C下經(jīng)T4 DNA連接酶連接12小時(shí)，10 μ 1連接反應(yīng)體系如下將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，熱激轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)獲得的陽(yáng)性克 隆送往上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序與預(yù)期結(jié)果一致，將其命名為L(zhǎng)cGST。2、LcGST推斷氨基酸序列的同源性分析將LcGST基因推斷的編碼氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast對(duì)比分析， 發(fā)現(xiàn)它與多種植物體內(nèi)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶均有一定相似度，經(jīng)DNAMAN軟件對(duì)其與大 豆GmGST、葡萄VvGST、蓖麻RcGST進(jìn)行相似性分析顯示，相似性分別為80. 6%、76. 3%和 73. 5% (如圖2所示)，證明所克隆基因的編碼產(chǎn)物為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。3、百脈根谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因可提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的實(shí)驗(yàn)分析(1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化子獲得將pET_32a(+)空質(zhì)粒與含有目的片段的克隆載體分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和 BamH I進(jìn)行37°C、3小時(shí)的雙酶切反應(yīng)，25 μ 1雙酶切反應(yīng)體系成份及用量如下ddH203. 5 μ 110ΧΚ Buffer2. 5 μ 1質(zhì)粒17 μ 1BamHI (8-20U/ μ 1)1 μ 1ΚρηΙ(4-12υ/μ 1)1 μ 1酶切產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的條帶并利用Τ4 DNA連接 酶連接目的條帶，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，并用Kpn I和 BamH I雙酶切分析所篩選的陽(yáng)性克隆。結(jié)果如圖3所示，質(zhì)粒pET_32a(+)的大小約為 5900bp，經(jīng)雙酶切后出現(xiàn)pET-32a(+)線性片段；目的基因LcGST是一段全長(zhǎng)約為680bp的 DNA，質(zhì)粒pET-32a(+)-LcGST經(jīng)雙酶切后電泳檢測(cè)，出現(xiàn)合適條帶，說(shuō)明原核表達(dá)載體質(zhì)粒 pET-32a(+)-LcGST構(gòu)建成功。將構(gòu)建的pET_32a (+)-LcGST原核表達(dá)載體利用熱激法轉(zhuǎn)入 BL2KDE3)菌株中，獲得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌株。(2)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定IOXLigation BufferpMD18-T 載體(50ng/ μ 1)膠回收產(chǎn)物T4DNA 連接酶(350U/ μ 1)
分別將含有重組質(zhì)粒和含有空質(zhì)粒(對(duì)照)的BL21 (DE3)菌株在37°C、IPTG的 終濃度為1. Ommol/L的條件下誘導(dǎo)2小時(shí)，取菌液煮沸裂解，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取 15μ1上清液進(jìn)行SDS-PAGE垂直式凝膠電泳，其中分離膠為12%，濃縮膠為5%。分離膠(12% )的配制成份如下30% 儲(chǔ)備膠4.0ml1. 5mol/L Tris-HCl (pH = 8. 8)2. 5mlddH203.3ml10% SDS0. Iml10% AP0.1mlTEMED8μ 1濃縮膠(5%)的配制成份30% 儲(chǔ)備膠0.67ml0. 5mol/LTris-HCl (pH = 6. 8)0. 5mlddH202.75ml10% SDS40 μ 110% AP40 μ 1TEMED8μ 1電泳時(shí)，濃縮膠電流10mA，分離膠電流15mA，電泳至溴酚藍(lán)行至電泳槽前沿時(shí)停止(需約4小時(shí))，用考馬斯亮蘭染色液室溫染色1-2小時(shí)。將膠從染 色液中取出，在脫色搖床慢搖脫色至條帶清晰，將脫色好的膠板拍照。照片如圖4所示，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒pET-32a(+)-LcGST的大腸桿菌BL21 (DE3)與含空質(zhì)粒對(duì)照相比， 在45KDa以下出現(xiàn)一條差異帶，且表達(dá)量明顯增強(qiáng)。預(yù)測(cè)目的融合蛋白包括GST蛋白(約 24. IKDa)和pET-32a標(biāo)簽蛋白(約20. 7KDa)，分子量大約為44. 8KDa，因此分析此差異帶為 pET-32a (+) -LcGST在大腸桿菌BL21中表達(dá)的目的融合蛋白。(3)轉(zhuǎn)化子的耐鹽性鑒定分別挑取含重組質(zhì)粒pET_32a(+)-LcGST和含空質(zhì)粒對(duì)照的大腸桿菌BL21 (DE3) 單菌落37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后用液體LB培養(yǎng)基調(diào)整至相同菌液濃度，分別取 100 μ 1 菌液轉(zhuǎn)入含有 0、100、200、300、400、500mmolNaCl 的液體 LB 培養(yǎng)基(含 1. Ommol/L IPTG)中進(jìn)行脅迫處理，37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后752型紫外分光光度計(jì)檢測(cè) 600nm下OD值，每個(gè)處理進(jìn)行三次重復(fù)，將平均值進(jìn)行對(duì)比分析(見(jiàn)圖5)，顯示相同鹽處理 條件下轉(zhuǎn)基因重組菌株的細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照菌株相比均增加，其中300mmol/L NaCl脅迫處理 時(shí)增加最高，達(dá)到53. 1%，表明LcGST在大腸桿菌中的表達(dá)提高了宿主菌的耐鹽性。大腸桿菌菌株DH5 α和BL21 (DE3)均為公知公用菌株，熱激轉(zhuǎn)化方法為常規(guī)方法。 產(chǎn)物回收均按按照上海生工生物工程有限公司的EZ Spin ColumnDNA Gel Extraction Kit UN1Q-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行。
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權(quán)利要求
提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST，其特征在于其序列如下ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCAT GAGAGTCAGAATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTT GAGGAACAAGAGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCT CATCCACAATGGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGT GTGGAATGATGCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATT CTGGGCTGATTATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAA AAATGAAGAAAGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGA ACAGCTCGGAGACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACT TGTTCCATTCTACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG TGAGTGCCCCAAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCATGACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST的$路，其特征在于 所述的制備方法包括如下步驟(1)首先以已知的大豆谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息 中心百脈根的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)中為L(zhǎng)cGST基因?qū)ふ易C據(jù)，獲得同源性很高3條EST序 列，序列號(hào)分別為BW597792. UBW599863. 1和BW594579. 1，利用DNAMAN軟件對(duì)檢索獲得的 EST序列進(jìn)行電子拼接，獲得了相應(yīng)的含有完整開(kāi)放閱讀框的拼接序列；(2)依拼接序列設(shè)計(jì)特異性引物，LcGST基因的外側(cè)上游引物為 5，-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3，，外側(cè)下游引物為 5，-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3，；內(nèi)側(cè)上 游引物為 5，-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3，，內(nèi)側(cè)下游引物為 5，-CTGGGATCCCT CGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3，，將內(nèi)側(cè)上、下游引物分別引入Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn)；(3)利用設(shè)計(jì)的特異性引物以百脈根培養(yǎng)21天后的葉片組織cDNA為模板進(jìn)行巢式 PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶；(4)PCR終產(chǎn)物回收后與pMDl-T連接，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α的 感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序與預(yù)期結(jié)果一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備，其特征在于 所述的步驟(3)是利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以百脈根培養(yǎng)21天后葉片組織的cDNA為模板 在擴(kuò)增儀上按照94°C預(yù)變性5分鐘；30個(gè)PCR循環(huán)94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C 延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以此PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μ 1作 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照94°C預(yù)變性5分鐘；30個(gè)PCR循環(huán)94°C變性30秒，56°C退火30 秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的條件進(jìn)行，兩次PCR反應(yīng)均按如下成份及用量進(jìn) 行ddH2010. 5 μ 1IOx PCR Buffer2 μ 1dNTP(2. 5mmo 1/L)2μ 1lOumol/L的上游引物2μ110umol/L下游引物2μ1模板1 μ 1Taq plus DNA polymerase(5U/μ 1) 0. 5 μ 1
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備，其特征在于所 述的步驟(4)是將內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠上切下，按上海生物工程有限公 司的EZ Spin Column DNA Gel Extract ion KitUNlQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行膠回收，在16°C下經(jīng)T4DNA連接酶連接12小時(shí)，10 μ 1連接反應(yīng)體系如下將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆，送往上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序與 預(yù)期結(jié)果一致，將其命名為L(zhǎng)cGST。
5.利用如權(quán)利要求1所述的基因LcGST編碼的蛋白，其特征在于其序列如下 Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Ala Ser Pro Phe Gly Met Arg Val Arg lie Ala Leu Ala Glu Lys Gly lie Asn Tyr Glu Tyr Lys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val His Lys Lys lie Pro Val Leu lie His Asn Gly Lys Pro lie Ala Glu Ser Leu lie Ala Val Gln Tyr lie Asp Glu Val Trp Asn Asp Ala Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln Ala Arg Phe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys lie Tyr Glu lie Gly Arg Asn lie lie Trp Lys Lys Asn Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Lys Glu Phe lie Asp Cys Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys Thr Tyr Phe Gly Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Val Asp lie Ala Leu Val Pro Phe Tyr Thr Trp Phe Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Phe Asn lie Glu Ser Glu Cys Pro Lys Leu lie Ala Trp Ala Lys Arg Cys Leu Gln Lys Glu Ser Val Ser Lys Ser Leu His Asp Gln Asp Lys lie Tyr Glu Phe lie Val Glu lie Arg Lys Lys Leu Gly lie Glu0·10 X Li gat ion Buffer PMD18-T 載體(50ng/ μ 1) 膠回收產(chǎn)物
全文摘要
本發(fā)明屬于新基因的制備，特別是指一種提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的基因LcGST以及利用其編碼的蛋白。外側(cè)上游引物為5’-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3’，外側(cè)下游引物為5’-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3’；內(nèi)側(cè)上游引物為5’-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3’，內(nèi)側(cè)下游引物為5’-CTGGGATCCCTCGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3’，以百脈根培養(yǎng)21天后的葉片組織cDNA為模板，采用巢式PCR擴(kuò)增方法首次在百脈根中獲得谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因LcGST，并應(yīng)用其編碼了可提高轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性的蛋白。本發(fā)明為耐鹽基因工程提供了新的候選基因，利用本發(fā)明獲得的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因LcGST基因可為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到重要作物提高轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性奠定基礎(chǔ)，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101942468SQ20101019700
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者馮雪, 孫艷香, 王彬 申請(qǐng)人:廊坊師范學(xué)院