專利名稱：膠紅酵母、在水果采后病害防治的應(yīng)用及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠紅酵母菌種(Rhodotorula mucilaginosa)以及該菌種對(duì)水果 采后病害防治的應(yīng)用及其使用方法。
背景技術(shù)：
水果在采摘、運(yùn)銷、儲(chǔ)藏過(guò)程中因腐爛造成的損失是巨大的，也是全球關(guān)注的問(wèn) 題。據(jù)報(bào)道，在發(fā)達(dá)國(guó)家有10% — 30%的新鮮產(chǎn)品由于采后病害導(dǎo)致腐爛，而在缺乏貯運(yùn) 冷藏設(shè)備的發(fā)展中國(guó)家，果實(shí)采后腐爛率則高達(dá)40% -50%。國(guó)外水果貯藏保鮮量占水果 總產(chǎn)量60%以上，目前我國(guó)果品貯藏量800多萬(wàn)噸，不到總量的15%，其中冷藏庫(kù)和氣調(diào)庫(kù) 的貯藏量為70萬(wàn)噸，僅占總產(chǎn)量的7%。我國(guó)水果采后腐爛率一般在20% -30%，高者甚 至達(dá)到50%。水果腐爛主要?dú)w因于病原微生物的致病作用，這些病原微生物主要有灰葡萄 抱(Botrytiscinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)、青霉屬(Penicillium spp·)、 毛毒屬(Mucor spp·)、鏈格抱(Alternaria spp.)、曲毒(Aspergillus spp.)禾口軟腐細(xì)菌 (Erwinia sp.)等。目前最常用的控制水果采后腐爛的方法是低溫和化學(xué)殺菌劑處理。近年來(lái)雖然冷 藏技術(shù)在我國(guó)得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用，但是在低溫條件下仍有相當(dāng)數(shù)量的致病菌可以生 長(zhǎng)從而引起腐爛。例如，能引起多種水果灰霉病的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，也稱灰 霉菌，在-0.5°C時(shí)還能生長(zhǎng)繁殖，引起許多水果腐爛變質(zhì)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。而那些對(duì)低 溫敏感的水果，因只能在不低于使產(chǎn)品受冷害的溫度下貯藏，病原物的生長(zhǎng)、繁殖不能得到 有效地抑制，腐爛相當(dāng)嚴(yán)重?；瘜W(xué)殺菌劑的使用，雖然防治病害可以起到立竿見(jiàn)影的效果， 但是在殺死病原菌的同時(shí)也殺死了有益微生物，且水果上的化學(xué)殺菌劑殘留對(duì)人體健康造 成影響、對(duì)環(huán)境造成污染。美國(guó)科學(xué)院(National Academy of Scinces)的一份報(bào)告顯示， 在用于處理食品的殺菌劑中，60%有致癌的危險(xiǎn)性。目前多種殺菌劑(如CaptaruBenomyl 等)已被美國(guó)環(huán)保局明令禁止使用或者在部分水果產(chǎn)品上限制使用。為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi) 生和安全，各國(guó)科學(xué)家都在積極的探索能代替化學(xué)殺菌劑的水果采后病害防治新技術(shù)。近 年來(lái)，美國(guó)、意大利等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)水果采后病害生物防治的研究已經(jīng)取得了階段性的成果， 生物防治的應(yīng)用潛力巨大，使得它成為一種取代化學(xué)殺菌劑的有效方法。我國(guó)水果采后病害生物防治研究起步較晚。范青等(2001)對(duì)果實(shí)病害生物防 治拮抗菌進(jìn)行了篩選和分離，結(jié)果表明季也蒙假絲酵母(Candida guiliermondii)、檸 檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)對(duì) 甜櫻桃褐腐病都表現(xiàn)出顯著的抑制效果，季也蒙假絲酵母和檸檬形克勒克酵母能有效地 防治核果類果實(shí)軟腐?。惶锸榔降?2004)研究，在甜櫻桃采前噴灑IX 108CFU/mL的絲孢 酵母(Trichosporon pullulans)，羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)和粘紅酵母 (Rhodotorula glutinis)，分別在25°C，0°C以及氣調(diào)貯藏下，絲孢酵母在果實(shí)上繁殖數(shù)量 最高，抑菌效果最好；張紅印等(2005)研究了不同溫度下，羅倫隱球酵母對(duì)灰霉病的防治 效果，結(jié)果表明，25°C下，梨灰霉病的發(fā)病率為16.7%，結(jié)合CaCl2使用效果更顯著。
從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中可知當(dāng)前以有效微生物取代化學(xué)殺菌劑用于水果采后病害的防 治已顯示出巨大的應(yīng)用前景，水果采后病害的生物防治成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。但到目前 為止，已實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)的拮抗菌種類不多，只有Biosave和Aspire等少數(shù)幾種產(chǎn)品上市， 而我國(guó)目前尚沒(méi)有拮抗菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。主要原因在于商業(yè)生產(chǎn)條件下，目前已報(bào)道的 拮抗微生物的防治效果往往不如化學(xué)殺菌劑的效果，從而達(dá)不到保鮮要求。這些因素影響 了拮抗菌作為果蔬保鮮劑在生產(chǎn)中的使用。為了盡快地將拮抗微生物應(yīng)用于水果貯藏保鮮 實(shí)際生產(chǎn)上，還需進(jìn)一步篩選拮抗效果好、抗病譜廣的微生物，同時(shí)需要深入探討拮抗微生 物防治水果采后病害的機(jī)理，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高拮抗微生物的抑菌能力，開(kāi)展拮抗微 生物擴(kuò)大培養(yǎng)、保存和商品化應(yīng)用技術(shù)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明人在前期廣泛研究的基礎(chǔ)上，提供 了一株膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)菌株，其具有較強(qiáng)生物防治效力。本菌株系從鎮(zhèn)江市江心洲農(nóng)業(yè)生態(tài)果園篩選分離到一株對(duì)水果采后病害具有 顯著防治作用的拮抗酵母Y20菌株，經(jīng)系統(tǒng)分類鑒定，鑒定為膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。本發(fā)明的膠紅酵母Y20菌株已經(jīng)于2010年1月29日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏菌株編號(hào)為CGMCC No. 3617。本發(fā)明還提供該膠紅酵母菌株的用途，可以用其對(duì)水果的進(jìn)行采后病害防治及貯 藏保鮮；尤其適合于梨果、桃果、草莓、蘋果等水果的采后病害防治及貯藏保鮮。本發(fā)明同時(shí)提供了一種利用膠紅酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法; 步驟如下將膠紅酵母Y20活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成 1.0X107個(gè)/ml-1. OX IO9個(gè)/ml的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30秒-2分鐘左右 的時(shí)間后馬上取出，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。本發(fā)明的膠紅酵母Y20菌株采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法，采用培養(yǎng)基首選為 NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏0. 8 %，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1 %，瓊脂2 % )，也可以使用馬鈴薯 瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15 20克，自來(lái)水1000毫升)。在pH7. 0 9. 0，26°C 28°C，培養(yǎng)36h。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可將斜面菌種直接接種至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB或 者麥芽汁培養(yǎng)基中，PH 7. 0 9. 0，溫度26°C 28°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min的培養(yǎng)條件下，培 養(yǎng)40 48h。一般在40h左右可以達(dá)到最大生物量。本發(fā)明的膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) Y20，可以明顯的抑制水果產(chǎn)生 腐爛腐敗的病原菌，防止水果采后發(fā)生腐爛，并且具有不產(chǎn)生毒素、可以和化學(xué)殺菌劑共同 使用等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛的用于水果采后病害的生物防治過(guò)程中，減少采后病害造成的損失。通過(guò)借助以下實(shí)施實(shí)例將更加詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，本 發(fā)明并不受這些實(shí)施實(shí)例的限制。


其中圖1為膠紅酵母Y205. 8S rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)化關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明菌株通過(guò)以下方法得到，多次從鎮(zhèn)江市江心洲農(nóng)業(yè)生態(tài)園橘園和桃園取樣包括橘子葉片、花朵、橘子果實(shí)和橘園土壤；桃子葉片、花朵、桃果和桃園土壤。通過(guò)分離、 篩選、培養(yǎng)、離體試驗(yàn)和活體試驗(yàn)，得到具有較強(qiáng)生防效力的微生物菌株Y20。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)培 養(yǎng)、生理生化特征試驗(yàn)和小亞基5. 8S rDNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl和ITS2區(qū)堿基序列分析， 鑒定為膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。本發(fā)明的菌株膠紅酵母Y20菌株(菌株編號(hào)CGMCC No. 3617)具有以下微生物學(xué) 特性1.形態(tài)學(xué)特征(1)在YEPD固體培養(yǎng)基平板(酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水IOOOmL, 瓊脂20g，pH6. 0，115°C濕熱滅菌20min)上28°C培養(yǎng)72h，菌落呈卵圓形、邊緣整齊、橙紅色、 表面光滑、質(zhì)地均勻、易挑起。(2)在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，不形成醭，菌液渾濁，不發(fā)酵，有沉淀，鏡 檢酵母細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞大小(3. 5-5. 3) X (2. 7-4. 5) μ m,芽殖，單邊出芽。(3)在有蓋玻片的玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上120_144h左右，鏡檢不能形成假菌絲。2.生理特性本發(fā)明菌株碳源能夠同化葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖纖維、木糖，不能同化淀 粉。氮源能夠同化硝酸鹽，37°C可以生長(zhǎng)。其生理特性結(jié)果見(jiàn)下表1。3.分子遺傳學(xué)鑒定對(duì)篩選菌株膠紅酵母Y20小亞基5. 8S rDNA-ITS區(qū)序列分析，在GenBank上檢索， 確定Y20為膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。根據(jù)檢索到的同源菌株，應(yīng)用DNAStar 軟件的Mege4程序，構(gòu)建生物進(jìn)化關(guān)系樹(shù)如說(shuō)明書(shū)附1所示。表1膠紅酵母的生理生化特征 本發(fā)明的膠紅酵母Y20，采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法，采用培養(yǎng)基首選為NYDA 培養(yǎng)基(牛肉膏0. 8 %，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1 %，瓊脂2 % )，也可以使用馬鈴薯瓊脂 培養(yǎng)基。在pH7.0 9.0，26°C 28°C，培養(yǎng)36h。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可將斜面菌種直接接種 至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB或者麥芽汁培養(yǎng)基中，pH7. 0 9. 0，溫度26°C 28°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/ min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)40 48h。一般在40h左右可以達(dá)到最大生物量。實(shí)施例1 利用膠紅酵母進(jìn)行水果(梨果和桃果)的采后病害防治及貯藏保鮮方 法將活化后酵母接種在裝有50mlNYDB (酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水 1000ml, ρΗ7· 0-9. 0)的三角瓶中，28°C、180r/min 搖床培養(yǎng) 48h。取菌液 12000r/min 離心 lOmin，棄上清，無(wú)菌水反復(fù)清洗3次，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配成濃度為IX IO8個(gè)/ml的菌懸液。 在果實(shí)腰部用打孔器打3個(gè)直徑為3m(寬)X3mm(深)的孔，每孔注30 μ 1的拮抗菌濃度 為1 X IO8個(gè)/ml細(xì)胞懸液，對(duì)照水果注入30 μ 1無(wú)菌水。2h后分別接種病原菌灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)和擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)孢子懸液 20 μ 1。晾干后將果 實(shí)裝入塑料筐內(nèi)，保鮮膜封口保持95%的濕度，在室溫下貯藏，IOd后統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病腐爛 率。每個(gè)處理8個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。按照上述步驟試驗(yàn)，IOd后統(tǒng)計(jì)水果的腐爛率結(jié)果見(jiàn)下表2。表2膠紅酵母Y20對(duì)灰霉病菌和青霉病菌的抑制效果 評(píng)價(jià)各株拮抗菌對(duì)桃和梨果實(shí)兩種病原菌的抑制效果，結(jié)果見(jiàn)表2。從表中可以看 出，對(duì)照組已經(jīng)全部發(fā)病，可以看出Y20對(duì)桃和梨的采后腐爛病害具有明顯的抑制作用。實(shí)施例2 利用膠紅酵母進(jìn)行水果(梨果)采后病害防治及貯藏保鮮方法一、試驗(yàn)方案將活化后酵母接種在裝有50ml NYDB (酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水 1000ml, ρΗ7· 0-9. 0)的三角瓶中，28°C、180r/min 搖床培養(yǎng) 48h。取菌液 12000r/min 離心 lOmin，棄上清，無(wú)菌水反復(fù)清洗3次，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配成濃度為IX IO8個(gè)/ml的菌懸液。 將梨果浸泡至IX IO8個(gè)/ml的菌懸液中，對(duì)照梨果浸泡至無(wú)菌水中，時(shí)間為30秒-2分鐘。 晾干后將果實(shí)裝入塑料筐內(nèi)，保鮮膜封口保持95%的濕度，在室溫下貯藏。45d后統(tǒng)計(jì)果實(shí) 的腐爛率和測(cè)定水果的品質(zhì)。每個(gè)處理8個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。在梨果貯藏結(jié)束后，每組 分別取出一些梨果，進(jìn)行感官品質(zhì)測(cè)定。感官測(cè)定在室溫下進(jìn)行(20°C)，每組處理在測(cè)定 每一項(xiàng)指標(biāo)時(shí)取5個(gè)水果，試驗(yàn)重復(fù)三次。品質(zhì)測(cè)定方法如下(1)失重率采用稱重法。
隸,OA _貯藏前果實(shí)重量(g)_貯藏后果實(shí)重量(g) 1Λη ，鮮w=_ r藏前果實(shí)重量(g) "xl0°(2)硬度用ΤΑ-ΧΤ2 質(zhì)地分析儀進(jìn)行測(cè)定，用直徑為5mm的探頭，探頭向水果的 運(yùn)動(dòng)速度為5.0毫米/秒，探頭刺破水果所遇到的最大的反彈力(N)被定義為水果的硬度。(3)總可溶性固形物含量用手持式糖量計(jì)測(cè)定，采用手持糖量計(jì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定 結(jié)果表示為g/100g樣品。(4)可滴定酸度采用滴定法，從6個(gè)水果取樣，稱取IOg樣品，加蒸餾水迅速研 磨，定容至100ml，過(guò)濾，取IOml濾液，用0. lmol/1 NaOH進(jìn)行滴定至pH8. 1，滴定后進(jìn)行計(jì) 算，結(jié)果以含檸檬酸的百分?jǐn)?shù)表示。(5) Vc 含量Vc含量2，6- 二氯酚靛酚法。從6個(gè)水果上取5g樣品加5ml 2%草酸研磨勻漿， 倒入IOOml容量瓶，用草酸洗滌殘?jiān)覫ml 30%硫酸鋅，搖勻。再加Iml 15%亞鐵氰化 鉀(除色素)，用草酸定容，搖勻過(guò)濾。取過(guò)濾液4ml，然后向各管加入2，6_ 二氯酚靛酚 染料溶液，隨即加入二甲苯5ml，迅速搖動(dòng)約0. 5min，靜置后二甲苯與水層分離，將上層二 甲苯萃取液在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)定液的光密度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出相應(yīng)的 維生素C(Vc)的含量，結(jié)果用毫克Vc/lOOg水果表示。二、試驗(yàn)結(jié)果
按照上述步驟試驗(yàn)，45d后統(tǒng)計(jì)梨果的自然腐爛率及貯藏品質(zhì)的影響結(jié)果見(jiàn)下表 3。表3膠紅酵母對(duì)梨果自然腐爛抑制效果及其貯藏品質(zhì)的影響 備注上述表中的發(fā)病率和品質(zhì)測(cè)定時(shí)在室溫(20°C )下放置45d后測(cè)定的結(jié)果。 不同字母代表差異顯著性。從表3中可以看出，經(jīng)過(guò)膠紅酵母理過(guò)的梨果，在常溫下(20°C)放置45d后，梨果 實(shí)的發(fā)病率顯著低于對(duì)照組(P< 0.05)。對(duì)于失重率、硬度沒(méi)有產(chǎn)生不利的影響。膠紅酵 母處理過(guò)的梨果可溶性固形物含量、可滴定酸含量都明顯優(yōu)于對(duì)照組(P < 0. 05)，其他的 指標(biāo)則均沒(méi)有產(chǎn)生不利影響。以上試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)膠紅酵母處理，可以明顯降低梨果的自然腐爛率，而對(duì)貯 藏品質(zhì)沒(méi)有產(chǎn)生不良的影響。
權(quán)利要求
膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)Y20 CGMCC No.3617。
2.權(quán)利要求1所述的膠紅酵母菌株的用途，其特征在于可以用其對(duì)水果進(jìn)行采后病害 防治及貯藏保鮮。
3.根據(jù)權(quán)利要求所述2的膠紅酵母菌株的用途，其特征在于適合于梨果、桃果、草莓、 蘋果的采后病害防治及貯藏保鮮。
4.使用權(quán)利要求1所述的膠紅酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法；步驟如 下將膠紅酵母Y20活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成1. OXlO7 個(gè)/ml-1. OX IO9個(gè)/ml的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30秒-2分鐘左右的時(shí)間后 馬上取出，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)水果采后病害具有防治效力的膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，及在水果貯藏保鮮中的用途和使用方法。本發(fā)明的菌種為CGMCC No.3617。使用時(shí)將膠紅酵母活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體，菌體用無(wú)菌水稀釋制備成1.0×107個(gè)/ml-1.0×109個(gè)/ml的菌懸液。將水果放入菌懸液中，浸泡30秒-2分鐘左右的時(shí)間后，馬上取出，再風(fēng)干，放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。本發(fā)明使用拮抗酵母防治水果采后病害，使用簡(jiǎn)單，操作方便，效果好，成本低，可以避免使用化學(xué)殺菌劑對(duì)人的危害及對(duì)環(huán)境的污染，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N1/16GK101892167SQ20101019813
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者任曉鋒, 張紅印, 徐占利, 董英, 黃星奕 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)