專利名稱：檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)5個(gè)堿基突變多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素(你)基因編碼區(qū)5 個(gè)堿基突變多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphisms，SNP)就是指基因組 DNA 序 列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNPs可以是兩個(gè)或多個(gè)等位基 因的多態(tài)，因此，通常所說(shuō)的SNPs包括堿基的插入、缺失、插入/缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù) 的變化。一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核苷酸的變化，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換 (以一種嘧啶置換另一種嘧啶或一種嘌呤置換另一種嘌呤)以及顛換(嘌呤與嘧啶互換)所 引起。具有顛換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上，因?yàn)镃pG (表示核 苷酸對(duì)，其中G在DNA鏈中緊隨C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)， 其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi) 或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們?cè)诨蚪M中分布的位置可分為基因編碼區(qū) SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間SNPs (iSNPs)等三類?？偟恼f(shuō)來(lái)，cSNP比 較少，因?yàn)樵诰幋a區(qū)內(nèi)的變異率僅占有周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具 重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對(duì)遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼 序列的改變并不影響其所翻譯的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同 ’另一 種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改 變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對(duì)編碼區(qū)SNPs的非同義突變來(lái)說(shuō)，它們可能對(duì)基 因功能有直接的重要影響，尤其對(duì)于編碼區(qū)突變來(lái)說(shuō)，更可能會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重 大變化，從而影響它的功能的發(fā)揮?；蛐蛄猩蠅A基的插入/缺失突變，同樣將導(dǎo)致所編碼 氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列改變，以致影響到蛋白的生物學(xué)功能，從而造成對(duì)個(gè)體 的表現(xiàn)型具有重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺 傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見(jiàn)， 故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來(lái)發(fā)現(xiàn) SNPs 即=DDNA序列測(cè)定方法；2) PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法；3) AS-PCR方法；4)引物 延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP 檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過(guò)程 中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想 SNP檢測(cè)方法。當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但 是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陰性問(wèn)題，所以，也并 非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同 時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡 核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等 檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強(qiáng)。生長(zhǎng)激素(以下稱你)是由垂體前葉嗜酸性細(xì)胞合成和分泌的單鏈多肽激素，由 190 191個(gè)氨基酸組成。你是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，能影響幾乎所有 的組織類型和細(xì)胞，在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，具有促進(jìn)肌肉、骨及軟骨的生 長(zhǎng)，影響蛋白質(zhì)、糖類、脂類的代謝，調(diào)節(jié)各種形式的RNA的生物合成等一些重要的生物學(xué) 功能，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)起著關(guān)鍵性的作用，但有人認(rèn)為這種功能因動(dòng)物種類不同而異。Sejrsen 等(1996)認(rèn)為，你對(duì)哺乳動(dòng)物有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，而對(duì)禽類動(dòng)物卻不確定，同時(shí)也有很多研 究證明你對(duì)家禽確有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，不過(guò)你作用的發(fā)揮與動(dòng)物自身也有關(guān)系。(1)促生長(zhǎng)作用。GH能直接作用于全身的組織細(xì)胞，增加細(xì)胞的體積和數(shù)量，還可 通過(guò)生長(zhǎng)素介質(zhì)的間接作用，促進(jìn)鈣、磷和硫酸根在軟骨中的沉積，加速軟骨基質(zhì)的合成和 軟骨細(xì)胞的分裂，使骨髓部的軟骨生長(zhǎng)，再鈣化成骨，從而促進(jìn)骨的生長(zhǎng)；不過(guò)一般認(rèn)為你 對(duì)幼齡動(dòng)物具有促生長(zhǎng)作用，對(duì)成年動(dòng)物則主要是調(diào)節(jié)能量代謝，保持能量的平衡。(2)調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝。生長(zhǎng)激素能促進(jìn)氨基酸，特別是甘氨酸、亮氨酸進(jìn)入細(xì)胞，能促 進(jìn)DNA合成，刺激RNA的形成，提高氨基酸合成蛋白質(zhì)的速度，降低氨基酸的氧化分解。同 時(shí)生長(zhǎng)激素通過(guò)抑制脂肪酸合成酶mRNA的轉(zhuǎn)錄，降低脂肪酸合成酶活性，從而減少脂肪的 沉積，還能加速脂肪分解，使進(jìn)入肝臟的脂肪酸增多，經(jīng)氧化后提供能量，游離脂肪酸增加 還可對(duì)葡萄糖氧化產(chǎn)生抑制作用，從而減少葡萄糖的消耗。生理水平的你可刺激胰島素B 細(xì)胞，引起胰島素分泌，加強(qiáng)葡萄糖的利用。生長(zhǎng)激素發(fā)揮作用主要有兩種途徑一是通過(guò)與生長(zhǎng)激素受體(GHR)結(jié)合，刺激 肝細(xì)胞、肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGF- I)。IGF- I通過(guò)旁分泌或自分泌方式作 用于肌肉、骨骼等，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。血中的生長(zhǎng)介素對(duì)你分泌也有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。 IGF- I能刺激下丘腦釋放GHRIH，從而抑制你的分泌。IGF- I還能直接抑制培養(yǎng)的腺垂體 細(xì)胞你的基礎(chǔ)分泌和GHRH刺激的你分泌，這說(shuō)明IGF- I可通過(guò)下丘腦和垂體兩個(gè)水平 對(duì)GH分泌進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)；二是直接作用于靶細(xì)胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。因此，尋找快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素基因突變多態(tài)性的方 法，為山羊早期生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)提供寶貴的資料，是本領(lǐng)域技術(shù)人員一直關(guān) 注的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素(你)基因編碼區(qū)5個(gè)堿基突變多 態(tài)性的方法，該方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，具有快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以山羊 基因組DNA序列為模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer (緩沖環(huán)境)、Mg2+、dNTPs存在的情況下， 利用兩對(duì)引物Pl和P2，在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的片段大 小判定；采用DNA測(cè)序技術(shù)篩查到山羊激素基因編碼區(qū)5個(gè)堿基突變，然后對(duì)生長(zhǎng)激素基因的SNPs進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，同時(shí)分析不同基因型與布爾山羊、布爾山羊和關(guān)中 奶山羊的雜交后代(Fl和F2代)3月齡的生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)系。所述的兩對(duì)引物Pl和P2分別如下 引物Pl
上游引物 IF 5' -TAGAAATGGGGGTGTGTGGGGT-3'； 下游引物 IR :5，-CATCCTCCACTGCCATCCAACA-3'； 引物P2
上游引物 2F 5' -TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3'； 下游引物 2R 5' -TCTAGGAAGGCACGGGGAGG-3，。所述的PCR擴(kuò)增的條件是
25yL反應(yīng)體系包括0. 5U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，12. 5 μ L 2父8吐作1<內(nèi)含1%2+、(1^1^等，北京天根科技有限公司Mix)，0. 3μ L的山羊基因組DNA樣 品，IOpmol/μ L引物Pl和Ρ2的上、下游引物各0. 3 μ L和滅菌超純水11. 4μ L。PCR反應(yīng)程序如下
(1)利用引物Pl的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，66°C退火30s， 72°C延伸40 s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸lOmin，得到擴(kuò)增片段，4°C保存。(2)利用引物P2的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，65°C退火 30s, 72°C延伸40s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸lOmin，得到擴(kuò)增片段，4°C保存。所述的山羊生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)編碼區(qū)5個(gè)堿基突變位點(diǎn)分別位于山羊生 長(zhǎng)激素基因外顯子3的第112bp、第142bp、第214bp以及山羊生長(zhǎng)激素基因外顯子4的第 214bp 和第 266bp。所述的電泳檢測(cè)是先用2%瓊脂糖檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段大小(320bp和302bp)，再用 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和分析利用引物Pl擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，結(jié)果如下純合型AA在 112bp、142bp和214bp位的堿基是A、C和C，雜合型AB在112bp和142bp位的堿基是G\A 和T\C，雜合型AC在214bp位的堿基是T\C ；同樣用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和分析利 用引物P2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，結(jié)果如下純合型EE在214bp和266bp位的堿基是C和C，雜 合型EF在214bp位的堿基是T\C，雜合型EG在266bp位的堿基是A\C。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益的技術(shù)效果
給出了與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的功能基因@外顯子3及其外顯子5單核苷酸多態(tài)性，這 5個(gè)SNPs能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確 估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。對(duì)@基因的SNPs進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與布爾山羊、布爾山羊和 關(guān)中奶山羊的雜交后代(Fl和F2代)3月齡的生長(zhǎng)性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明..GH 基因Pl和Ρ2檢測(cè)SNP位點(diǎn)可用作山羊生長(zhǎng)性狀早期選擇(3月齡)的分子標(biāo)記。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為你基因的SNPs與山羊的生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基 礎(chǔ)，以便用于山羊生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。


圖1是山羊@基因外顯子3擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖2是山羊@基因外顯子5擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖3是利用引物Pl得到的山羊@基因外顯子3的PCR產(chǎn)物的電泳分析(10%聚丙烯 酰胺凝膠電泳)圖，圖中，1和4表示AA基因型；2、5和6表示AB基因型；3表示AC基因 型；
圖4是利用引物P2得到的山羊@基因外顯子5的PCR產(chǎn)物的電泳分析(10%聚丙烯 酰胺凝膠電泳)圖，圖中，1和2表示EG基因型；3、5和6表示EF基因型；4表示EE基因 型；
圖5是利用引物Pl得到的山羊@基因外顯子3的PCR產(chǎn)物不同基因型測(cè)序圖，圖中， a表示-Ak基因型；b表示AB基因型；c表示AC基因型；
圖6是利用引物P2得到的山羊@基因外顯子5的PCR產(chǎn)物不同基因型測(cè)序圖。以下通過(guò)對(duì)山羊樣本采集及基因組DNA提取、檢測(cè)和濃度分析、山羊@基因外顯 子3和外顯子5的PCR擴(kuò)增、山羊@基因外顯子3和外顯子5擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯凝膠電泳 分析實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式1、山羊@基因外顯子3和5的PCR擴(kuò)增及其多態(tài)性的檢測(cè) (1)山羊血樣的采集及處理
取山羊血樣5mL,加入0. 2 μ L的ACD (檸檬酸2. 4g ；檸檬酸三鈉6. 6g ；葡萄糖7. 35g ； 定容至50mL，高壓滅菌)抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆谩２捎?個(gè)山羊群體共計(jì)686個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的母羊血樣，具體為西農(nóng)薩能羊血樣 190份，采自陜西省千陽(yáng)薩能羊種羊場(chǎng)；布爾山羊血樣168份、布爾與關(guān)中奶山羊雜交Fl代 (血樣136份)和F2代(血樣192份)，采自陜西麟游縣波爾山羊種羊場(chǎng)和陜西省楊凌金坤公 司洛南分公司。(2)血樣基因組DNA的提取和純化
)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5mL的Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液， 充分混勻，4°C條件下12000r/min離心lOmin，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉
淀呈淡黃色。2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁， 37°C水浴lh。DNA抽提緩沖液的配制:0. 6057g的Tris、18. 612 g的EDTA和2. 5g的SDS加 超純水至500mL，滅菌，調(diào)pH至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加IyL 蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充 分混勻；4°C條件下，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1.5mL離心管中，重復(fù)一次。5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C條件下，12000r/min離心lOmin，將上清液 轉(zhuǎn)入另一 1. 5 mL離心管中。6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直 至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。7)4°C條件下，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用濃度為70%的冰冷乙醇漂洗
6DNA沉淀2次。8) 4°C條件下，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。9)干燥后的DNA溶于80 μ L 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA 完全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80°C保存。10)在500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終 濃度達(dá)到50 μ g/mL。11) 5°C條件下保溫IOh左右。12)用苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)混合物和氯仿分別抽提一次，其中，苯酚、氯 仿、異戊醇混合物和氯仿體積相等。13) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。15)倒掉液體，用濃度70%的乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待 檢測(cè)。(3) DNA池的構(gòu)建 1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇DNA樣品條帶均一、無(wú)拖尾、無(wú)降解的 樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。2) OD 值測(cè)定
用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值，并計(jì)算DNA含量和0D26(1/0D28。 的比值。如OD26tZOD28tl比值小于1. 6，說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若 比值大于1. 8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(μ g/mL) =50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù) 3)品種DNA池的構(gòu)建
DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μ L，然后從西農(nóng)薩能奶山羊190個(gè)個(gè)體、 濃度為50ng/ μ L的DNA的樣品中取5 μ L混合構(gòu)建成DNA池；按照同樣的方法構(gòu)建布爾山 羊、布爾與關(guān)中奶山羊雜交Fl代和F2代的DNA池。(4) PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)
按照GenBank提供的你基因序列(登錄號(hào)D00476)設(shè)計(jì)引物Pl和引物P2。引物Pl如下
上游引物 IF 5' -TAGAAATGGGGGTGTGTGGGGT-3'； 下游引物 IR 5' -CATCCTCCACTGCCATCCAACA-3' 引物P2如下
上游引物 2F 5' -TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3'； 下游引物 2R 5' -TCTAGGAAGGCACGGGGAGG-3，。(5) PCR擴(kuò)增山羊你基因外顯子3和5
分別以3個(gè)山羊群體的DNA池為模版，利用引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件及程 序如下所示
PCR擴(kuò)增的條件是25 μ L反應(yīng)體系，包括0.DNA聚合酶(北京天根科技有限公
司)，12. 5yL2XBuffer (內(nèi)含Mg2+、dNTPs等，北京天根科技有限公司Mix)，0. 3 μ L的山羊基因組DNA樣品，IOpmol/μ L引物Pl和Ρ2的上、下游引物各0. 3 μ L，滅菌超純水11. 4μ L。PCR反應(yīng)程序如下
(1)利用引物Pl的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，66°C退火30 s，72°C延伸40 s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10 min，4°C保存。(2)利用引物P2的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，65°C退火 30 s，72°C延伸40 s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10 min，4°C保存。(6) PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序
PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1和2所示，可以清楚看到利用 引物Pl和引物P2擴(kuò)增的目的片段分別是320bp和302bp的條帶，說(shuō)明目的基因片段擴(kuò)增 成功；
然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的 凝膠，放入1.5 mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR 產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟如下
1)首先向吸附柱中加入500 μ L平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上下 翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。4)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的
廢液，將吸附柱重新放入收集管中。5)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱重
新放入收集管中。6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將離心吸附 柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50°C保溫 箱中數(shù)分鐘，徹底晾干。7)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩 沖液，室溫放置2 min。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步 馬聚7 ο把以上以3個(gè)山羊群體DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn) 行雙向測(cè)序，對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰是發(fā)生了單核苷酸突變； 位于山羊@基因外顯子3的第112bp、142bp和214bp位出現(xiàn)單核苷酸突變，其多態(tài)性分別 為G\A、T\C和T\C，雜合型AC在214bp位的堿基是；山羊你基因外顯子5的第214bp和 266bp位出現(xiàn)單核苷酸突變，其多態(tài)性分別為T\C和A\C ；即篩查到山羊你基因的5個(gè)SNP 多態(tài)性。2、山羊@基因5個(gè)SNPs的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
利用引物P1對(duì)3個(gè)山羊群體686份基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得686個(gè)包含山羊你 基因外顯子3的DNA片段(包含3個(gè)堿基突變);再利用引物Ρ2對(duì)3個(gè)山羊群體686份基因 組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得686個(gè)包含山羊你基因外顯子5的DNA片段(包含2個(gè)堿基突變)。然后利用如下方法對(duì)每個(gè)山羊的你基因進(jìn)行基因分型，具體方法如下
取引物Pl和引物P2的PCR產(chǎn)物各5 μ L，分別與5 μ L的變性緩沖液(95%的甲酰胺、 0. 5mol/L的EDTA、0. 025%的二甲苯青FF和0. 025%的溴酚藍(lán))混合，95°C變性lOmin，然后 迅速放入冰水混合物中作用lOmin，最后點(diǎn)樣于10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液中，在 40C的條件下，260V電泳lOmin，之后200V衡壓條件下電泳4. 5h。電泳結(jié)束后，加入0. 1%的 硝酸銀溶液中，于搖床上輕搖lOmin，然后用蒸餾水洗滌凝膠2次，加入顯色液(5g的NaOH、 0. Ig的Na2CO3,加入0. 5mL甲醛，定容至250mL)，于搖床上輕搖15min，然后用蒸餾水洗滌凝 膠2，拍照保存(圖3和圖4)。3、不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證
將利用引物Pl擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的純合基因型和雜合基因型個(gè)體各挑出10個(gè)送至上海 生工進(jìn)行正反向測(cè)序(圖5)；同時(shí)，將利用引物P2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的純合基因型和雜合基 因型個(gè)體各挑出10個(gè)送至上海生工進(jìn)行正反向測(cè)序(圖6)。4、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析
基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。Paa = Νω/Ν，其中Paa代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N 為檢測(cè)群體的總數(shù)量。基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式 可以寫(xiě)成PA= (2Nm + NAal + NAa2 +……+NAan)/2N。式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表 示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al-an為 等位基因A的η個(gè)不同的復(fù)等位基因；3個(gè)羊群體不同多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布、等位基因頻 率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1所示。5、群體平衡性檢驗(yàn)
某基因位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡性檢測(cè)采用皮爾遜
Z5統(tǒng)計(jì)量，其公式為
其中，《為某一遺傳位點(diǎn)基因型應(yīng)有個(gè)數(shù)；i為基因型序號(hào)；/丨代表第j個(gè)基因型的實(shí) 際個(gè)體數(shù)量；n為樣本數(shù)量；&代表第i個(gè)基因型的理論頻率。利用引物Pl和P2擴(kuò)增的山羊你基因外顯子3和外顯子5個(gè)SNPs的基因型分布、 等位基因頻率和Hardy-Weinberg平衡如表1和表2所示，利用引物Pl和P2擴(kuò)增的山羊@ 基因外顯子3和外顯子5連鎖不平衡分析如表3所示。表1 引物Pl擴(kuò)增的@基因外顯子3多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率和哈代溫 伯格平衡檢驗(yàn)
表2:引物P2擴(kuò)增的@基因外顯子5多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率和哈代溫伯格 平衡檢驗(yàn)
表3 引物Pl和Ρ2擴(kuò)增的山羊@基因外顯子3和外顯子5連鎖不平衡分析
由表1和表2可以看出，在引物Pl和Ρ2擴(kuò)增的@基因外顯子3和外顯子5多態(tài)位點(diǎn)， 3個(gè)山羊品種均處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)，且西農(nóng)薩能奶山羊和布爾與關(guān)中奶山羊雜交 Fl代的雜合程度還比較高，也說(shuō)明這兩個(gè)山羊品種具有巨大的選種潛力。由表3可知，引物 Pl和Ρ2擴(kuò)增的@基因外顯子3和外顯子5的位點(diǎn)不存在連鎖不平衡的關(guān)系(r2<0. 03)。
6、布爾山羊以及布爾與關(guān)中奶山羊Fl和Fl代基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析生產(chǎn)數(shù)據(jù)布爾山羊以及布爾與關(guān)中奶山羊Fl和Fl代(3月齡)的生長(zhǎng)性狀，包括體 重、體高、體長(zhǎng)、胸圍。關(guān)聯(lián)分析樣本有完整生長(zhǎng)性狀記錄的布爾山羊168頭、布爾與關(guān)中奶山羊雜交 Fl代136頭以及布爾與關(guān)中奶山羊雜交F2代192頭。關(guān)聯(lián)分析模型
利用SPSS (13.0)軟件分析品種、年齡、場(chǎng)和基因位點(diǎn)等因素與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性。先 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對(duì)數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特 征，利用t分析、ANOVA或多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的因素不同，考慮到場(chǎng)效應(yīng)(Farm)、品種效應(yīng) (Breed)、種公畜效應(yīng)(S)、種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)(SD)、年齡(Age)和性別效應(yīng)(Sex)、基因型 效應(yīng)(Genotype)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用了以下固定模型進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn) 行取舍。完整模型如下
Yijkimnpq = Farmi + Breedj + Sp+SDq+Agek + Sex1 + Genotypem +Xn + eiJklnmpq 其中yijklmnM 個(gè)體表型記錄；μ 總體均值；Farmi 場(chǎng)別效應(yīng)；Breedj 品種效應(yīng)；SP 種公畜效應(yīng)；SDq 種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)；Agek 年齡效應(yīng)；Sex1 性別效應(yīng)；Genotypem 標(biāo)記 基因型效應(yīng)；XnS各種二級(jí)和二級(jí)以上互作效應(yīng)，如FarmXBreed，F(xiàn)armXAge，F(xiàn)armXSex， FarmXGenotype, BreedXAge, BreedXSex, BreedXGenotype, AgeXSex, AgeXGenotype, SexXGenotype,BreedXAgeXGenogype 等；eijklmnM 隨機(jī)誤差；運(yùn)用 SPSS (13. 0)軟件對(duì)數(shù) 據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對(duì)各基因型間生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性 檢驗(yàn)。分析結(jié)果如表4和表5所示
表4 引物Pl擴(kuò)增的@基因外顯子3基因型與布爾山羊及布爾與關(guān)中奶山羊雜交后 代Fl和F2代羊生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析
同一列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著0° <0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P < 0. 01)
表5 引物Ρ2擴(kuò)增的@基因外顯子5基因型與布爾山羊及布爾與關(guān)中奶山羊雜交后 代Fl和F2代羊生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析
同一列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著Gd <0. 05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著G^ < 0. 01)
統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，引物Pl擴(kuò)增的@基因外顯子3與布爾山羊及布爾與關(guān)中奶山羊雜交 后代Fl和F2代的生長(zhǎng)性狀(3月齡)顯著相關(guān)。特別是在布爾山羊及布爾與奶山羊雜交Fl 代山羊中，AB基因型山羊的生長(zhǎng)性狀顯著高于AA和AC基因型山羊(/X0. 05);引物P2擴(kuò)增 的你基因外顯子5與布爾山羊及布爾與關(guān)中奶山羊雜交后代Fl和F2代的生長(zhǎng)性狀(3月 齡)也顯著相關(guān)，在布爾山羊及布爾與奶山羊雜交Fl代和F2代山羊中，EF基因型山羊的生 長(zhǎng)性狀顯著高于EE和EG基因型山羊(/X0. 05)，因此，利用引物Pl和P2檢測(cè)SNP位點(diǎn)可用 作山羊生長(zhǎng)性狀早期選擇的分子標(biāo)記。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)5個(gè)堿基突變多態(tài)性的方法，其特征在于，該方法以山羊基因組DNA為模板，在Taq DNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，利用兩對(duì)引物P1和P2，在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的片段大小，采用DNA測(cè)序技術(shù)篩查山羊生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)5個(gè)堿基的突變點(diǎn)，然后對(duì)生長(zhǎng)激素基因的SNPs進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，同時(shí)分析不同基因型與布爾山羊、布爾山羊和關(guān)中奶山羊的雜交后代3月齡的生長(zhǎng)性狀之間關(guān)系；所述的兩對(duì)引物P1和P2分別如下引物P1上游引物1F5' TAGAAATGGGGGTGTGTGGGGT 3'；下游引物1R5' CATCCTCCACTGCCATCCAACA 3'；引物P2上游引物2F5' TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA 3'；下游引物2R5' TCTAGGAAGGCACGGGGAGG 3'。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的條件是25 μ L反應(yīng)體系包括0. 5U Taq DNA聚合酶，12. 5 μ L 2ΧBuffer，0. 3 μ L的山羊基因 組DNA樣品，10 pmol/ μ L引物Pl和Ρ2的上、下游引物各0. 3 μ L和滅菌超純水11. 4 μ L ；PCR反應(yīng)程序如下(1)利用引物Pl的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，66°C退火30s， 72°C延伸40s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸lOmin，得到擴(kuò)增片段，4°C保存；(2)利用引物P2的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，65°C退火30s， 72°C延伸40s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸lOmin，得到擴(kuò)增片段，4°C保存。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的山羊生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)5個(gè)堿基突 變點(diǎn)分別位于山羊生長(zhǎng)激素基因外顯子3的第112bp、第142bp、第214bp以及山羊生長(zhǎng)激 素基因外顯子4的第214bp和第266bp。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生長(zhǎng)激素基因的SNPs基因分型是用 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和分析利用引物Pl擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，結(jié)果如下純合型AA在 第112bp、第142bp和第214bp位的堿基是A、C和C，雜合型AB在第112bp和第142bp位的 堿基是G\A和T\C，雜合型AC在第214bp位的堿基是T\C ；同樣用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 檢測(cè)和分析利用引物P2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，結(jié)果如下純合型EE在第214bp和第266bp位 的堿基是C和C，雜合型EF在第214bp位的堿基是T\C，雜合型EG在第266bp位的堿基是 A\C。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)山羊生長(zhǎng)激素(GH)基因編碼區(qū)5個(gè)堿基突變多態(tài)性的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，以山羊基因組DNA序列為模板，在TaqDNA聚合酶、Buffer(緩沖環(huán)境)、Mg2+、dNTPs存在的情況下，利用兩對(duì)反應(yīng)(PCR)引物P1和P2，在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增目的片段大小判定；采用DNA測(cè)序技術(shù)篩查到山羊GH基因編碼區(qū)5個(gè)堿基的突變，然后對(duì)GH基因的SNPs進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，以及與布爾山羊、布爾山羊和關(guān)中奶山羊的雜交后代(F1和F2代)3月齡的生長(zhǎng)性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明GH基因P1和P2檢測(cè)的SNPs位點(diǎn)可用作山羊生長(zhǎng)性狀早期選擇(3月齡)的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101928774SQ20101019915
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者侯金星, 安小鵬, 宋宇軒, 曹斌云, 王利心, 王建剛 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)