專利名稱：奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因及篩選、鑒定和功能分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種奶山羊多胎(3羔)和單胎卵巢差異表 達新基因及其篩選、鑒定和功能分析方法，發(fā)現(xiàn)6個與卵泡生長發(fā)育密切相關(guān)的6個新基因 片段，其在山羊上未見報道，另外，2個新基因片段與NCBI中的所有序列都不匹配。
背景技術(shù)：
眾所周知，“一杯奶強壯一個民族”，然而，由于亞洲人與西方人種的遺傳差異，導(dǎo) 致70 %的中國人飲食牛奶發(fā)生乳糖不耐癥(何偉，2006)，但飲食山羊奶不會發(fā)生乳糖不耐 癥，因此，山羊奶在國內(nèi)已經(jīng)形成消費熱，而奶山羊產(chǎn)羔率低，已成為制約奶羊業(yè)發(fā)展的瓶 頸問題。多胎性狀是山羊重要的經(jīng)濟性狀，提高山羊的產(chǎn)羔率，不僅可以降低母羊的飼養(yǎng) 成本，提高山羊生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，并且可以減少糞便等廢棄物的排泄量，對于我國走綠色環(huán) 保的可持續(xù)發(fā)展畜牧業(yè)道路具有非常重要的意義。發(fā)現(xiàn)和高效利用多胎家畜種質(zhì)資源，是 動物遺傳育種領(lǐng)域的重點研究課題之一。奶山羊是適合我國國情條件下大力發(fā)展的重要奶 畜，探索增加產(chǎn)羔數(shù)的有效方法是大幅度提高其經(jīng)濟效益、減少環(huán)境污染和節(jié)約資源的關(guān) 鍵。多羔性狀是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳力很低(約0. 23)，采用傳統(tǒng)選育 方法，難以在較短時間內(nèi)快速提高產(chǎn)羔率。因而，篩選和鑒定控制奶山羊多羔性狀新基因， 應(yīng)用分子育種等新技術(shù)，快速提高其產(chǎn)羔率，盡快培育出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的奶山羊 新品種(系)，對大幅度提高我國奶山羊生產(chǎn)水平和促進奶山羊業(yè)的發(fā)展具有重要意義。抑制性消減雜交(SSH)是Diatchenko (1996)以基于PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，在差減cDNA 和RNA的基礎(chǔ)上發(fā)展而了的篩選差異表達基因的技術(shù)。該方法用限制性酶消化測試組與驅(qū) 動組的cDNA，然后用兩輪雜交和巢式PCR擴增即可完成試驗。和以前的差減雜交技術(shù)相比， SSH技術(shù)的優(yōu)點主要表現(xiàn)在五個方面。第一，特異性高，克服了不同mRNA分子拷貝數(shù)目對 雜交結(jié)果的影響，因而消減的靈敏度大大提高。第二，操作簡單，不需要需采用任何中間步 驟分離單鏈或者雙鏈cDNA，僅需要一輪差減雜交，差異表達的cDNA分子達到1000多倍的 富集。第三，SSH技術(shù)的最大優(yōu)點假陽性率低，其兩步雜交和兩次PCR可保證其94%為真陽 性。第四，高靈敏性，低豐度mRNA可通過抑制性消減雜交術(shù)所做的均一化和目標(biāo)片段的富 集被檢測出來。第五，快速高效，幾十甚至幾百個差異表達基因片段可通過一次SSH同時分 離得到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因及篩選、鑒 定和功能分析方法，申請人以西農(nóng)薩能奶山羊多胎(3羔)和單胎卵巢為試驗材料，利用抑制 性消減雜交技術(shù)、生物信息學(xué)和實時定量PCR篩選出6個與卵泡生長發(fā)育密切相關(guān)的6個
5新基因片段，其在山羊上未見報道，另外，2個新基因片段與NCBI中的所有序列都不匹配。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因，是在H-L消減cDNA文庫中的4個ESTs 序列和L-H消減cDNA文庫中的4個ESTs序列，其中，H-L消減cDNA文庫中的4個ESTs分 別核組蛋白1 (NUCB1)、鳥氨酸脫羧酶(0AZ1)、金屬蛋白酶抑制劑(TIMPl)和鋅指蛋白5 (CXXC5) ;L-H消減cDNA文庫中的4個ESTs分別為鈣蛋白酶II (calpain II)、跨膜蛋白 emp24 (TMED4)和與NCBI數(shù)據(jù)庫中的所有序列都不匹配的2個基因片段；其特征在于
所述的H-L消減cDNA文庫中的核組蛋白1 (NUCB1)、鳥氨酸脫羧酶(0AZ1)、金屬蛋白 酶抑制劑(TIMPl)和鋅指蛋白5 (CXXC5)在山羊上未見報道，但其與牛和綿羊?qū)?yīng)基因的 同源性在90%以上，這些基因中有的與卵泡的生長發(fā)育相關(guān)；
所述的L-H消減cDNA文庫中的鈣蛋白酶II (calpain II)和跨膜蛋白emp24 (TMED4) 與牛和綿羊?qū)?yīng)基因的同源性在95%以上，分別參與卵子的激活和能量代謝。上述奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因的篩選、鑒定和功能分析方法，其特 征在于，用西農(nóng)薩能奶山羊經(jīng)產(chǎn)羊多胎和單胎卵巢作為試驗材料，采用抑制性消減雜交技 術(shù)構(gòu)建奶山羊多胎與單胎卵巢組織正反向消減cDNA文庫，以多胎奶山羊卵巢為高產(chǎn)測試 組，以單胎卵巢為低產(chǎn)驅(qū)動組，表示為H-L ；以單胎奶山羊卵巢為低產(chǎn)測試組，以多胎卵巢 為高產(chǎn)驅(qū)動組，表示為L-H，利用生物信息學(xué)分析H-L和L-H消減文庫中基因的基因結(jié)構(gòu)和 潛在的功能，并挑選文庫中的基因，根據(jù)其序列設(shè)計PCR引物，并利用實時定量PCR驗證差 異表達新基因。挑選文庫中的基因分別為金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)、鋅指蛋白5 (CXXC5)、鳥氨 酸脫羧酶(0AZ1)，根據(jù)挑選出的消減文庫中的金屬蛋白酶抑制劑(TIMPl)基因序列設(shè)計引 物對P1，根據(jù)鋅指蛋白5 (CXXC5)基因序列設(shè)計引物對P2，根據(jù)鳥氨酸脫羧酶(OAZl)基因 序列設(shè)計引物對P3;
所述的引物對Pl為
上游引物 Fl 5-CTCTTGAGGTGACGCATCTG-3 ； 下游引物 Rl 5-CCAGAAGGAGCAGGATTACC-3 ； 所述的引物對P2為
上游引物 F2 5-GGGTGCATCCGTTTGTCTTC-3 ； 下游引物 R2 5-AACCCAAAGCTGCCCTCTCT-3 ； 所述的引物對P3為 上游引物 F3 5-GCGGAGGTTTTGCTGGTTT-3 ； 下游引物 R3 :5-GAAGCAGTGGCTGTTGAGGAT-3。所述的實時定量PCR程序為:95°C預(yù)變性3 min ;94°C變性10s，60. 0°C退火30s， 72°C延伸30s，共30個循環(huán)。本發(fā)明取得如下結(jié)果
1、以多胎奶山羊卵巢為tester (高產(chǎn))，以單胎卵巢為driver (低產(chǎn))，表示為H-L ；以 單胎奶山羊卵巢為tester (低產(chǎn))，以多胎卵巢為driver (高產(chǎn))，表示為L-H。以看家基因 磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參檢測2個文庫的消減效率為25倍，多胎和單胎奶山羊卵 巢組織中的差異表達基因得到有效的富集。
2、在H-L消減cDNA文庫中有4個ESTs (表達系列標(biāo)簽)序列，所有的基因片段在 山羊上未報道，但其與牛和綿羊?qū)?yīng)基因的同源性在90%以上；通過序列比對發(fā)現(xiàn)這些基 因中有的與卵泡的生長發(fā)育相關(guān)。L-H消減cDNA文庫中有4個ESTs序列，2個基因片段在 山羊上未報道，但其與牛和綿羊?qū)?yīng)基因的同源性在95%以上，通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)這 些基因分別參與卵子的激活和能量代謝，另外，2個基因片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的所有序列 都不匹配。3、以持家基因β-actin作為內(nèi)參，對TIMP-1、CXXC5和OAZl基因進行實時定量 PCR分析，結(jié)果顯示奶山羊經(jīng)產(chǎn)羊多胎(3羔)卵巢組織中TIMP-1、CXXC5和OAZl基因的 mRNA表達豐度比西農(nóng)薩能奶山羊經(jīng)產(chǎn)羊單胎卵巢組織的高3. 32,38. 34和1. 41倍。


圖1是多胎和單胎山羊卵巢組織中RNA的質(zhì)量檢測結(jié)果電泳圖，圖中，1和2表示 多胎山羊卵巢；3和4表示單胎山羊卵巢；M表示DNA marker DL2000 ；
圖2是兩個消減cDNA文庫部分克隆菌落PCR鑒定電泳圖，圖(A)表示H-L消減cDNA文 庫；圖(B)表示L-H消減cDNA文庫；
圖3是GAPDH cDNA消減效率電泳圖，圖(A)表示以多胎山羊卵巢組織為Tester，單胎 山羊卵巢組織為Driver ；圖(B)表示以單胎山羊卵巢組織為Tester，多胎山羊卵巢組織為 Driver ； 1-4表示未消減cDNA產(chǎn)物；5-8表示消減cDNA產(chǎn)物；M表示DNA marker DL2000 ； 其中，4，5條帶表示經(jīng)過18個循環(huán)；3，6條帶表示經(jīng)過23個循環(huán)；2，7條帶表示經(jīng)過28個 循環(huán)；1，8條帶表示經(jīng)過33個循環(huán)；
圖4是引物特異性的檢測電泳圖；圖中，1表示TIMP-I基因；2表示CXXC5基因；3表 示 OAZl 基因；M 表示 DNA marker I ； 圖5是實時定量PCR擴增曲線； 圖6是實時定量PCR溶解曲線。以下通過對山羊卵巢組織中RNA提取和檢測、mRNA純化、濃縮和檢測、消減文庫效 率的分析、菌落PCR和實時定量PCR分析實施例來進一步說明本發(fā)明及其帶來的技術(shù)效果。
具體實施例方式A、卵巢組織總RNA的提取
(1)將卵巢組織樣品從液氮罐中取出，置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入少量液氮迅速研磨 (研磨過程中應(yīng)保持研缽中一直有液氮存在)，直至組織被研成細(xì)小粉末狀時，將其轉(zhuǎn)入經(jīng) 0. 1%的DEPC水處理過并且經(jīng)高壓蒸汽滅菌的1.5mL的離心管中(研缽洗凈烤干后用無水乙 醇灼燒5-lOmin，冷卻后使用)。(2)立即加入Trizol A+ (按30 50 mg組織樣品/mL的Trizol加入)，進行顛倒混 合后，室溫放置5min，使組織樣品充分裂解。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%， 否則會導(dǎo)致DNA污染。(3)按0. 2 mL氯仿/mL Trizol加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3 min。(4)41條件下，12，00(^離心10 15min。樣品會分三層黃色的有機相、中間層 和上層無色的水相，RNA主要在上層無色的水相中，把水相(約500 μ L)轉(zhuǎn)入到新管中，在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置20 min 30min。(5) 4°C條件下，12, OOOg離心lOmin，棄上清，離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離 心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。(6) ImL 75%乙醇/mL Trizol的比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。(7) 4°C條件下，5, OOOg 離心 3min，棄上清。(8)室溫晾干或真空干燥5 lOmin。注RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。(9)用30 50 μ L經(jīng)DEPC處理過的去離子水溶解RNA樣品。(10)取7 μ L的RNA樣品用于測OD值和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量(圖1)， 其余樣品置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆?。B、卵巢組織mRNA的純化和濃縮
反應(yīng)機制如下mRNA的polyA尾巴可與生物素標(biāo)記的Oligo (dT)探針雜交，雜交產(chǎn)物 可被鏈霉親和素包裹的磁珠捕獲(鏈霉親和素能與生物素特異的結(jié)合)然后用磁架捕獲磁 珠，再用無RNA酶的滅菌水洗脫。操作步驟如下
(1)將多胎和單胎山羊卵巢組織總RNA置于1.5 mL離心管中，加無RNA酶的滅菌水至 500μ L，65°C水浴 10 min。(2)加入3μ L生物素標(biāo)記的Oligo (dT)探針和13 μ L的20XSSC后，溫和混勻，
冷卻至室溫。(3)在水浴期間，準(zhǔn)備 0. 5XSSC 禾口 0. 1XSSC0. 5 X SSC :30μ L 20XSSC+1170y 1 RNase-free H2O ；0. IXSSC 7 μ L 20 X SSC+1393 μ L RNase-free Η20。重懸鏈霉親和素包 裹的磁珠，用磁架捕獲磁珠(約30s)后吸去上清。(4)加入300μ L的0. 5XSSC到裝有鏈霉親和素包裹磁珠管中，用同樣的方法，輕 輕重懸磁珠后用磁架將磁珠吸到管壁上，吸去0. 5 X SSC洗滌液，重復(fù)洗滌3次。(5)將退火的Oligo (dT)探針和RNA的雜交溶液與磁珠均勻混合，室溫放置10 min，每間隔廣2 min輕輕重懸磁珠以保持其懸浮狀態(tài)。(6)用磁架捕獲磁珠，小心的去掉上清，用0. 3mL 0. 1 X SSC根據(jù)上述方法將磁珠
清洗4次。(7)加入100 μ L無RNA酶水洗脫mRNA，重懸磁珠，用磁架捕獲后，小心吸取含mRNA 的上清。(8)按照步驟(7)的方法再加入150μ L滅菌水洗脫，將兩次的mRNA集中到1. 5 mL 離心管(如果顆粒與mRNA —起被轉(zhuǎn)移，12000r/min離心lmin，轉(zhuǎn)移RNA到新管)。(9)按照 Acryl Carrier 說明濃縮 mRNA。(10)取0. 5 μ L稀釋10倍后用核酸蛋白儀測定mRNA濃度核酸濃度測定儀檢測， OD260/OD■在1. 9-2. 08之間，濃度在47. 2-56. 7 ng/μ L之間，說明得到質(zhì)量良好，濃度合適 的mRNA，可進行SSH試驗，此mRNA用于構(gòu)建cDNA消減文庫。C、抑制性消減雜交(SSH)試驗
本試驗構(gòu)建乏情期西農(nóng)薩能奶山羊3羔(高產(chǎn))與單羔(低產(chǎn))卵巢組織消減cDNA文庫 (3羔卵巢組織mRNA為測試組，單羔卵巢組織mRNA為驅(qū)動組)，表示為H-L ；單羔較3羔消減cDNA文庫(單羔卵巢組織mRNA為測試組，3羔卵巢組織mRNA作為驅(qū)動組)，用L-H表示。
具體試驗步驟如下 (l)mRNA的反轉(zhuǎn)錄
A)取出滅菌后烘干的PCR管加入以下試劑
權(quán)利要求
一種奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因，是在H L消減cDNA文庫中的4個ESTs序列和L H消減cDNA文庫中的4個ESTs序列，其中，H L消減cDNA文庫中的4個ESTs分別核組蛋白1(NUCB1)、鳥氨酸脫羧酶(OAZ1)、金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)和鋅指蛋白5(CXXC5)；L H消減cDNA文庫中的4個ESTs分別為鈣蛋白酶Ⅱ(calpain II)、跨膜蛋白emp24(TMED4)和與NCBI數(shù)據(jù)庫中的所有序列都不匹配的2個基因片段；其特征在于所述的H L消減cDNA文庫中的核組蛋白1(NUCB1)、鳥氨酸脫羧酶(OAZ1)、金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)和鋅指蛋白5(CXXC5)在山羊上未見報道，但其與牛和綿羊?qū)?yīng)基因的同源性在90％以上，這些基因中有的與卵泡的生長發(fā)育相關(guān)；所述的L H消減cDNA文庫中的鈣蛋白酶Ⅱ(calpain II)和跨膜蛋白emp24(TMED4)與牛和綿羊?qū)?yīng)基因的同源性在95％以上，分別參與卵子的激活和能量代謝。
2.如權(quán)利要求1所述的奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因，其特征在于所述的核組蛋白1 (NUCBl)的序列如下TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACAGAGCAGGACAGGGAGCCGTGTGAGATAAGGACAGAAAGGCTGAGGGG CTGGAACCTAATTCTGGGGTGGGGTCAGTTCTGTGACCCTTCTGGGGCTGTGGAAGGAAGGGGCTCAGAGCCATGAC AGCAGGCAGGGGGCTGAGATGGCTGGAAACCAGGGGTCAGGAGAGTCAGGGCTCCTGGGGTCAGAGCTAATCAGCGA TGCAGAGGACTCTCTGGCCCTCACACCCAGCTGTGGGGGAGACACTGTCTTTGAGGCATCACCAGTCCCACAAAAGG TAGAGACAGGTGTTGAGGGGCCACTGAAGCCCCACAGACCAGCGGAAGCTGGGCCCGGGCAGCAGGCAGGATTCCAG CAGCTGTGGGGATGCGGGATGCTGGAGTGGCCACAACCTGGGGGTCAAGGCCAAACCAACTAGAAAGGCAGGTGTGA GCAGACCCTCCCTGGAGGGAGGGGGCTTCCCTAAGTGAAGCTGAGGCCAGTGAGCACTCAACTGGATACGAGAAGGC AAGTCCCTTGGAGGGGAACAGAAAGAGGGGACCACAGACTGGAAGACTGTGGAGGCTGAGGCGGCAGATATGGGGCC CGGGCAGCAGTATGAGAAGGAAGCAGCCAGCCTGTTCCCCCTCCCCCAGGAGGCCACAGTTGTGGCGGGGTCCCCAG AGGAGGTTGATTGTGACACTCCACCCCCACTCCCATCAGCCTTGGGAGGAACCCTGAGTGCTGGGATCCTGGAATGA TCACAGGTGCTGTGAATCCAGCTGGGGGAGGCTCAGGGGTCTGTTCTGGGACCTTCTTTTCTGAAGCAACCACATCC TTCTGGTCACCGGGCTGGAGCTGGGACGGGTGCATCATCTGTGTCCGGTGGAAACTTGAGCTGTCCCTCGGGGCCCG GGGGCTGGGGTTGTTGTGGCTTTTGCTGCTGCTGTTTTCCTCTGTTCCAATTTTGC ；所述的鳥氨酸脫羧酶(OAZl)的序列如下TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTGCGGCGGCGCGGAGAAGCGCAGCGGAGGTTTTGCTGGTTTCGGACCCCAG CGGCCGGATGGTGAAATCCTCCCTGCAGCGGATCCTCAACAGCCACTGCTTCGCCAGAGAGAAGGAAGGGGATAAAC CCAGCGCCACCGTCCACGCCACCCGCACCATGCCGCTCCTTAGCCTGCACAGCCGCGGAGGCCGCAGCAGCGAGAGT TCCAGGGTCTCCATCAACTGCTGTAGTAACCTGGGTCCAGGGCCTCGGTGGTGCTCCTGATGTCCCTCACCCACCCC TGAAGATCCCAGGTGGGCGAGGGAATAGTCAGAGGGATCACAATCTTTCAGCTAATTTATTTTACTCTGATAATCGG CTGAATGTAACAGAGGAACTAACGTCTAATAACAAGACGAGGATTTTTAATGTCCAGTCCAGGCTCACAGAGGCCAA ACATATTAACTGGAGAGCGGTGCTGAGCAACAGCTGCCTCTACATCGAGATCCCGGGCGGCCGCTCGA ；所述的金屬蛋白酶抑制劑(TIMPl)的序列如下TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACCTGCATCCCACCCCACCCACAGACGGCCTTCTGCAACTCCGAAGTCGT CATCAGGGCCAAGTTCGTGGGGACCGCAGAAGTCAATGAGACTGCCTTATACCAGCGTTATGAGATCAAGATGACTA AGATGTTCAAAGGGTTCAGTGCCTTGAGGGATGCCCCAGACATCCGATTCATCTACACCCCTGCCATGGAGAGCGTC TGCGGATACTTCCACAGGTCCCAGAATCGCAGTGAGGAGTTTCTCATAGCTGGACAATTGTCAAATGGGCACCTGCA CATCACCACCTGCAGTTTTGTGGCTCCCTGGAACAGCATGAGTTCTGCTCAGCGCCGGGGATTCACCAAGACCTATGCTGCTGGTTGTGAGGAATGCACAGTGTTTCCCTGCTCATCTATCCCCTGCAAACTGCAGAGCGACACTCATTGCTTG TGGACGGACCAGCTGCTCACAGGCTCTGACAAGGGGTTCCAGAGCCGCCACCTGGCCTACCTGCCCGGGCGGCCGCT CGA ；所述的鋅指蛋白5 (CXXC5)的序列如下TCGAGCGGGCCGCCCGGGCAGGTTGGAGATGTTAAAACGACAACAAAAAATATATATATAAAAACAGGAATG AAATCTGTGAGAGAATATTTTTGGTTCTAAAGACGGGTGCATCCGTTTGTCTTCGCCCGAATCCCTTGCCGGAGACC ACACGAGCAGTGACATTGCACAGAGAGGGCAGCTTTGGGTTCCCGCCGCCGTCACTGAAACCACCGGAAGGCGGCTC CCGTCGGAAGCATCACCTTCTCCAGAGCAGCGGAAGGCTTCTTTTTGAGTTCCTCACATTTTCTGAATTTGCAAATC TGATGGCCAGTCTTTCGGTTCCTACAACTGCTGCACTGCTCGCAGTTGATGCGCCGCCGGCAGGGCGCACACATGCC GCAGCGTTTCCGCTTCTTCTTGCCGGAGCTGATGGCGGAGGCCAGCTCTCCCCGCATGGGGTATTCAGCCAGGCCGG CCATGTGCAGCGCGCTCTCAGCCAGGAACACGCCCGCGGGGGTCATGATGAAGGGGCCTGGGTTGATGGGAAAGGCG CCCAGGTAGGGGAAGTCGGACTGGCCATTGAGTGCTTCGGCACCCGCCACAGCCTCCATGTCGGGCAGGCCGGCGCC CGCTTCGCTCATCAGCGGTAGGTGCTCCTGCACCACGCGCTTCAGCATCTCCGTGGACTGCGCAAACTGCTGCAGTG TCAGCTGTCCCTCGGCCGCGACCACGCT ；所述的鈣蛋白酶II (calpain II)的序列如下TACTTGTGGAACAACATCAAAAAGTGGCAGGCCATATACAAACAGTTTGATGTTGACCGTTCAGGGACCAT TGGCAGCAGTGAACTCCCGGGGGCCTTTGAGGCAGCAGGATTCCACCTGAATGAACATCTCTACAACATGATCATC CGACGCTACTCAGATGAGGGAGGGAACATGGATTTTGACAATTTCATCAGTTGCCTGGTCAGACTGGATGCCATGT TCCGTGCCTTCAAATCTCTTGACAAAGATGGCACTGGACAAATCCAGGTGAACATCCAGGAGTGGCTGCAGCTGAC CATGTAC ；所述的2個與NCBI數(shù)據(jù)庫中的所有序列都不匹配的基因片段序列分別為TTTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACTAGATCCCACGTGCCACAACCAAGACCCACTGCAGCCAAATAAATT AAAAAAACACAACTGCTCTGAGACACTGCCTTGACACCTGGGATACCAGGTCTCTTCATCATGGCCACAGTCAGAAG ACAGAAAACTCCTAAGCACTCCCAGGGTCCCCAGCTGCCCAGGAGGAACAGGTTGGCAGAGGCCAGATGAGGGGCTT TCCAGCAACAAACACAGACCTCCCTTCCACACCTCCACAGGGAAGAATATTCAAACATGTCCCTGACTATCTTTCCC AATTAGCCATCACGCTGCTCTCCCCCAGCCCTCTCTCCTTCTCTCCTAACCCCAGTGTATTTTCTTAAAGGTGTTTA TCTTTTTCAGAGCTTATCAGTGACCTCGGCCGCGACCACGCT ；GGTACCATGAAACTGGAGTTGGCTCAGTATCGTGAGGTTGCTGCTTTTGCCCAGTTCGGTTCTGACCTTGA TGCTGCCACTCAACAACTCTTGAGTCGTGGTGTGCGTTTGACTGAGTTGCTCAAGCAAGGACAGTATTCTCCCATG GCTATTGAAGAGCAAGTGGCTGTTATCTATGCGGGTGTCAGGGGGTATCTTGACAAGCTGGAGCCCAGCAAGATCA CAAAATTTGAGAATGCTTTCTTGTCGCACGTTATCAGCCAACATCAAACTCTGTTGGGCAAAATCAGGACCGATGG AAAGATCTCAGAAGAGGCAGATGCAAAGCTGAAAGAGATTGTAACAAACTTCTTGGCTGGATTTGAAGCTTAAAC TCCTGTGGATTCATATCAAATGCCAGTTTGGTTTTGTCATTGTTTCTTCTAGTTTCATTTGTAAAAGGATTACTC CAATACTGCAGATGTAC。
3.權(quán)利要求1所述的奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因的篩選、鑒定和功能分 析方法，其特征在于，用西農(nóng)薩能奶山羊經(jīng)產(chǎn)羊多胎和單胎卵巢作為試驗材料，采用抑制性 消減雜交技術(shù)構(gòu)建奶山羊多胎與單胎卵巢組織正反向消減cDNA文庫，以多胎奶山羊卵巢 為高產(chǎn)測試組，以單胎卵巢為低產(chǎn)驅(qū)動組，表示為H-L ；以單胎奶山羊卵巢為低產(chǎn)測試組， 以多胎卵巢為高產(chǎn)驅(qū)動組，表示為L-H，利用生物信息學(xué)分析H-L和L-H消減文庫中基因的基因結(jié)構(gòu)和潛在的功能，并挑選文庫中的基因，根據(jù)其序列設(shè)計PCR引物，并利用實時定量 PCR驗證差異表達新基因。
4.如權(quán)利要求3所述的奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因的篩選、鑒定和功能 分析方法，其特征在于，所述的挑選文庫中的基因分別為金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)、鋅 指蛋白5 (CXXC5)、鳥氨酸脫羧酶(0AZ1)，根據(jù)挑選出的消減文庫中的金屬蛋白酶抑制劑 (TIMPl)基因序列設(shè)計引物對P1，根據(jù)鋅指蛋白5 (CXXC5)基因序列設(shè)計引物對P2，根據(jù)鳥 氨酸脫羧酶(OAZl)基因序列設(shè)計引物對P3 ；所述的引物對Pl為上游引物 Fl 5-CTCTTGAGGTGACGCATCTG-3 ； 下游引物 Rl 5-CCAGAAGGAGCAGGATTACC-3 ； 所述的引物對P2為上游引物 F2 5-GGGTGCATCCGTTTGTCTTC-3 ； 下游引物 R2 5-AACCCAAAGCTGCCCTCTCT-3 ； 所述的引物對P3為 上游引物 F3 5-GCGGAGGTTTTGCTGGTTT-3 ； 下游引物 R3 :5-GAAGCAGTGGCTGTTGAGGAT-3。
5.如權(quán)利要求3所述的奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因的篩選、鑒定和功能分 析方法，其特征在于，所述的實時定量PCR程序為95°C預(yù)變性3min ；94°C變性10s，60. 0°C 退火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶山羊多胎和單胎卵巢差異表達新基因及其篩選、鑒定和功能分析方法，以西農(nóng)薩能奶山羊為試驗材料，采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建奶山羊多胎(3羔)和單胎乏情期卵巢組織正反向消減cDNA文庫，篩選差異表達基因片斷，利用實時定量PCR驗證差異表達基因，并利用生物信息學(xué)分析基因結(jié)構(gòu)和潛在的功能。
文檔編號C12N15/10GK101967484SQ20101019926
公開日2011年2月9日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者侯金星, 安小鵬, 宋宇軒, 曹斌云, 楊明明, 王建剛 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)