專利名稱：藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物克隆技術(shù)一手導(dǎo)式克隆技術(shù)(Handmade cloning)的細胞融合 技術(shù)環(huán)節(jié)，尤其涉及藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法。
背景技術(shù)：
動物克隆的研究對生物醫(yī)藥、治療性克隆的探索、模式生物的建立以及畜牧業(yè)生 產(chǎn)等具有重要的意義，可實現(xiàn)動物克隆的技術(shù)手段包括傳統(tǒng)的依賴于顯微操作系統(tǒng)的核移 植技術(shù)和2004年最新發(fā)明的手導(dǎo)式克隆技術(shù)。相對于顯微操作系統(tǒng)，手導(dǎo)式克隆技術(shù)的優(yōu) 點在于其僅用一個刀片就能完成卵母細胞的去核，且去核效率高，整個克隆程序耗時少，成 為一種可能代替顯微操作技術(shù)的新方法。該方法主要技術(shù)環(huán)節(jié)包括供體細胞培養(yǎng)、卵母細 胞體外成熟、卵母細胞去核、細胞融合、種間克隆胚的激活與體外培養(yǎng)。其中細胞融合技術(shù) 為手導(dǎo)式克隆技術(shù)的難點，通常手導(dǎo)式克隆技術(shù)中細胞融合時的技術(shù)要求特別高，耗時長， 電場對融合細胞的作用時間長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高融合效率的藏羚羊成纖維細胞與受 體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔 助融合方法，包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng) 在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃?；蚰膛Ｂ涯讣毎械娜我庖环N；(2)制作體積為25 μ L的融合微滴； (3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至Τ20、植物血凝 素、Τ2Β、融合液微滴內(nèi)進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復(fù)合體；將復(fù)合體 移至融合液內(nèi)平衡2 3min后，再至融合槽內(nèi)進行電融合即可。所述步驟(3)中的T20是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛血清(FBS)和80%的含 IOmM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié) PH值至7. 2 7. 4的溶液；其中雙抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素。所述步驟(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液 中所得的溶液。所述步驟(3)中的T2B是指在TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入總?cè)芤后w積的2%的胎牛 血清(FBS)和8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)所得的溶液。所述步驟(3)中的融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0. 025g MgSO4,過濾保存； 再用20mL蒸餾水溶解0.0147g CaCl2 · 2H20，過濾保存；將10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙 烯醇(PVA)充分溶解于196mL蒸餾水中，然后向其分別加入2mL預(yù)先配制好的MgSO4和 CaCl2 · 2H20溶液，過濾后即得。
所述步驟(3)中的電融合的條件是交流電場7V，脈沖電場70V，持續(xù)時間20μ s，持 續(xù)兩次，每次間隔0. Is。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、由于本發(fā)明以化學(xué)試劑——植物血凝素為輔助試劑，因此，改進了以往手導(dǎo)式 克隆技術(shù)中低效率的細胞融合方式，使得藏羚羊成纖維細胞與山羊、牦牛、黃牛和奶牛卵 母細胞在植物血凝素的輔助下高效融合，其融合率分別達到98. 25%,99. 00%,97. 71%和 93. 17%，從而提高了克隆動物的整體效率。2、由于本發(fā)明采用融合前先用植物血凝素處理使兩個卵母細胞和一個體細胞粘 附形成三元復(fù)合體，然后再進行融合，因此，有效地降低了操作難度，縮減了操作時間。3、由于本發(fā)明采用上覆石蠟油的微滴進行操作，因此，防止了蒸發(fā)和潛在的污染， 提高了體外操作溶液的穩(wěn)定性。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖1為本發(fā)明中用兩個去核卵母細胞和一個藏羚羊成纖維細胞在植物血凝素的 輔助下在電場的作用下正在進行融合。圖2為采用本發(fā)明方法融合的兩個去核卵母細胞與一個藏羚羊成纖維細胞，經(jīng)過 細胞核熒光染色證實已經(jīng)完全融合。
具體實施例方式一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng)在24孔板中；核移植時選擇培養(yǎng)孔 內(nèi)底部全部長滿的細胞作為供體細胞。每次消化1孔細胞，然后將少量細胞移入到T2B的 微滴中。受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃牛或奶牛卵母細胞中的任意一種。(2)在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)按常規(guī)方法制作體積為25 μ L的融合微滴。(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至Τ20、植物血凝 素、Τ2Β、融合液微滴內(nèi)進行操作，微滴上覆石蠟油，避免微滴蒸發(fā)和位置移動。先將受體卵母細胞移至Τ20微滴內(nèi)，再移一個受體卵母細胞至植物血凝素微滴 內(nèi)，然后轉(zhuǎn)移到Τ2Β微滴中粘取一個供體細胞，再重新轉(zhuǎn)移至植物血凝素微滴中，再從Τ20 微滴中移一個受體卵母細胞至植物血凝素微滴中，由于植物血凝素可使細胞表面具有粘 性，所以通過調(diào)整供體細胞與受體卵母細胞復(fù)合體和另一卵母細胞的位置，可形成兩個卵 母細胞夾雜一個供體細胞的復(fù)合體；將復(fù)合體移至融合液內(nèi)平衡2 3min后，再至融合槽 內(nèi)以交流電場7V，脈沖電場70V，持續(xù)時間20 μ s，持續(xù)兩次，每次間隔0. Is進行電融合即可 (參見圖1、圖2)。其中Τ20是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羥乙基哌嗪乙 磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)ρΗ值至7. 2 7. 4 的溶液；其中雙抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素。
植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中所得的溶液。該 植物血凝素以50 μ L分裝于離心管中，并在-20°c保存、待用。T2B是指在TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入總?cè)芤后w積的2 %的胎牛血清(FBS)和8mg/ mL牛血清蛋白(BSA)所得的溶液。融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0. 025g MgSO4,過濾保存；再用20mL蒸餾水溶 解0. 0147g CaCl2 · 2H20,過濾保存；將10. 93g甘露醇和0. 2g PVA充分溶解于196mL蒸餾 水中，然后向其分別加入2mL預(yù)先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液，過濾后即得。該融 合液以IOmL分裝于離心管中，并在-20°C保存、待用。
權(quán)利要求
一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng)在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃?；蚰膛Ｂ涯讣毎械娜我庖环N；(2)制作體積為25μL的融合微滴；(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴內(nèi)進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復(fù)合體；將復(fù)合體移至融合液內(nèi)平衡2～3min后，再至融合槽內(nèi)進行電融合即可。
2.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的T20是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羥 乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值 至7. 2 7. 4的溶液；其中雙抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素。
3.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中 所得的溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的T2B是指在TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入總?cè)芤后w積的2%的胎牛 血清和8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0.025g MgSO4，過濾保存；再用 20mL蒸餾水溶解0. 0147g CaCl2 · 2H20,過濾保存；將10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙烯醇充分 溶解于196mL蒸餾水中，然后向其分別加入2mL預(yù)先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液， 過濾后即得。
6.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的電融合的條件是交流電場7V，脈沖電場70V，持續(xù)時間20ys，持 續(xù)兩次，每次間隔0. Is。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學(xué)輔助融合方法，該方法包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng)在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃牛或奶牛卵母細胞中的任意一種；(2)制作體積為25μL的融合微滴；(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴內(nèi)進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復(fù)合體；將復(fù)合體移至融合液內(nèi)平衡，再至融合槽內(nèi)進行電融合即可。本發(fā)明有效地提高了細胞融合效率、降低了操作難度、縮減了操作時間，從而優(yōu)化了手導(dǎo)式克隆技術(shù)細胞融合的技術(shù)環(huán)節(jié)。
文檔編號C12N15/06GK101906412SQ20101020182
公開日2010年12月8日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者于鴻浩, 徐世曉, 曹俊虎, 趙新全, 郭志林, 郭松長 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所