專利名稱：基于組織工程材料的黑素細胞的培養(yǎng)方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學領域，尤其涉及一種基于組織工程材料的黑素細胞培養(yǎng)方法及 其應用。
背景技術：
白癜風是一種獲得性皮膚色素脫失性疾病，表現(xiàn)為局部或泛發(fā)性色素脫失，以形 成白斑為特征，組織學及免疫細胞化學顯示其皮損表皮黑素細胞消失。白癜風往往給患者 帶來沉重的心理負擔，影響工作、學習等正常生活，容易發(fā)展成為心理疾病。傳統(tǒng)的治療手段包括內(nèi)服藥物、紫外線照射以及外科手術治療等。但藥物治療和 紫外線照射的治愈率有限。外科手術治療方法主要包括自體表皮移植、黑素細胞懸液移植 等，這些治療方法證實是有效的，但表皮移植需大面積取皮，而細胞懸液移植中細胞懸液易 流失，影響療效，且不適合大面積移植。利用組織工程技術、通過細胞負載與轉移，為治療白癜風提供新的途徑。現(xiàn)有公 開的專利與研究報道以組織工程皮膚和人工皮膚替代物為主。CN1786155A公開了選擇殼 聚糖_膠原復合物的膜材料或多孔支架作為負載材料，將表皮細胞和黑素細胞接種在膜表 面或支架上，構建帶色素的組織工程表皮替代物，但該組織工程表皮在后期的轉移、移植 過程中易破損。CN 1493367 與 CellBiology International 2007,31(9) :985_990 報道 了選擇膠原作為材料，負載角質形成細胞、成纖維細胞和黑素細胞構建含有色素的人工皮 膚，并在裸鼠身上得到表達，但該人工皮膚在制備過程中會發(fā)生收縮，影響其后續(xù)使用。CN 101605566A公開了在聚乳酸薄膜上培養(yǎng)增殖性黑素細胞，但聚乳酸薄膜制備需使用溶劑澆 鑄法，為細胞培養(yǎng)及生物安全方面留下隱患。此外，Sung-Jan Lin等(Biomaterials2005， 26(12) 1413-1422)報道利用殼聚糖作為負載接種黑素細胞，發(fā)現(xiàn)黑素細胞在膜上有成團 現(xiàn)象，影響細胞活性，同時，所制備的殼聚糖載體不能滿足轉移和移植的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于組織工程材料的黑素細胞 的培養(yǎng)方法及其應用。本發(fā)明利用組織工程技術實現(xiàn)黑素細胞或其與成纖維細胞和角質形 成細胞的體外培養(yǎng)、負載及移植。通過將細胞_載體復合材料移植到脫色皮膚創(chuàng)口處，使黑 素細胞或其與成纖維細胞和角質形成細胞由載體材料遷移到皮膚創(chuàng)口處，為脫色處皮膚提 供黑素細胞，從而實現(xiàn)色素脫失癥(如白癜風)和皮膚顏色的調節(jié)。本發(fā)明涉及具有生物 相容性載體材料的制備、細胞-載體復合材料的構建及其應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種基于組織工程材料的黑素細胞 的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)制備生物相容性載體材料將一種或兩種生物相容性材料按1 50-50 1的 重量比例配成水溶液，所述生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質 酸、硫酸軟骨素等，將水溶液注入細胞培養(yǎng)板，鼓風條件下于30-120°C下烘2-48小時，在細 胞培養(yǎng)板上形成一層載體膜材料。然后用交聯(lián)劑對載體膜材料在20-50°C交聯(lián)處理0. 5-24小時，所述的交聯(lián)劑包括用于物理交聯(lián)的硫酸鈉、檸檬酸鈉或三聚磷酸鈉及用于化學交聯(lián) 的戊二醛、乙二醛、水楊醛或香草醛，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑，再在鼓 風條件下于30-120°C下烘2-48小時。(2)構建細胞-載體復合材料載體材料用于接種細胞前，用醫(yī)用消毒酒精浸泡12 小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細 胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、5% C02、飽和濕度條件進行孵化。 將黑素細胞或按1-40 0-200 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖維細胞和 角質形成細胞以黑素細胞為5X 103-5X 105個細胞/cm2的密度接種在孵化過的載體膜材料 上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% C02、飽和濕度條件下培 養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天，即獲得細胞-載體的復合材料。所述細胞培養(yǎng)液含100毫升F12培養(yǎng)基、0. 1-100毫升FBS、10-50000納克CT、 10-50000 微克 IBMX、0. 1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分。動物實驗選取約四周齡大小裸鼠，用戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉。在裸鼠背部側面制造約 1. 5cm2的皮膚創(chuàng)口，刮至創(chuàng)面出現(xiàn)點狀出血。將細胞_載體復合材料的細胞面貼敷于創(chuàng)口 處，隨后對裸鼠進行常規(guī)包扎，用手術線縫合邊緣。移植后的裸鼠在無菌環(huán)境中單籠飼養(yǎng)， 水和食物充足供給。1周后觀察裸鼠移植部位。拆除外包扎敷料，麻醉狀態(tài)下使用激光共聚 焦顯微鏡(皮膚CT)對裸鼠移植部位進行觀察，可見成團黑素細胞存在；活檢取材進行免疫 組化檢測，移植部位存在人黑素細胞?？梢源_定組織工程材料上搭載的黑素細胞可以遷移 到裸鼠創(chuàng)面部位。本發(fā)明的有益效果是通過對所得的生物相容性載體膜材料進行表征，膜表面平 整，具有致密的微孔結構，適合細胞生長。載體材料的吸水率為50% -400%，同時具有良好 的機械性能，包括抗拉強度、抗撕強度、斷裂伸長率和彈性模量等，在制備、負載、轉移和移 植過程不發(fā)生破碎和斷裂，符合轉移和移植的要求。細胞-載體復合材料的構建過程中，細 胞在生物相容性載體膜材料上的形態(tài)良好，在負載膜材料表面以單層或多層的形式存在， 其中單層形式為主。細胞在負載膜材料的表面增殖趨勢明顯(圖1)且保持良好活性(圖 2-4)。移植過程中，細胞可成功地遷移到皮膚創(chuàng)口處(圖5，6)，實現(xiàn)黑素細胞的轉移。本發(fā) 明中生物相容性載體材料制備方法簡單、操作容易、抗破損、撕裂和轉移等性能優(yōu)良，通過 調節(jié)細胞的接種密度、培養(yǎng)時間和方法，保持細胞活性，同時滿足不同個體對皮膚顏色的需 求，適合色素脫失癥和皮膚顏色的調節(jié)。


圖1是分別培養(yǎng)在殼聚糖基負載膜材料和細胞培養(yǎng)板的黑素細胞增值曲線。圖2是培養(yǎng)在殼聚糖基負載膜材料上的黑素細胞的形態(tài)照片。圖3是培養(yǎng)在殼聚糖基負載膜材料上的黑素細胞的S-100染色照片。圖4是培養(yǎng)在殼聚糖基負載膜材料上的黑素細胞的透射照片。圖5是移植后裸鼠移植部位皮片的免疫組化照片。圖6是移植后裸鼠移植部位皮膚CT照片。
具體實施例方式本發(fā)明屬生物醫(yī)學領域，利用組織工程技術構建具有良好生物相容性載體材料， 用于黑素細胞或其與成纖維細胞、角質形成細胞的(共)培養(yǎng)，實現(xiàn)細胞的體外培養(yǎng)及移 植。具體涉及具有生物相容性載體材料的制備、細胞-載體復合材料的構建及其應用，滿足 色素脫失癥(如白癜風)和皮膚顏色調節(jié)的要求。本發(fā)明選用生物相容性良好的材料，負載材料制備條件溫和，易于細胞的負載與 增值培養(yǎng)，生物安全。同時，本發(fā)明可在細胞培養(yǎng)板上直接構建載體材料，避免對載體材料 再打孔、剪裁等繁瑣的后處理及二次污染問題。經(jīng)交聯(lián)處理的載體材料，具有優(yōu)越的機械性 能，滿足可直接從細胞培養(yǎng)板中取出用于細胞轉移和移植的要求。此外，本發(fā)明通過調節(jié)細 胞的接種密度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)方法，保持細胞活性，實現(xiàn)對不同個體皮膚顏色的調控，使 黑素細胞的功效性在移植中得到成功的表達，具有實際的可操作性，為大面積色素脫失癥 和皮膚顏色的調節(jié)提供了極大的便利。本發(fā)明的基于組織工程材料的細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟1.制備生物相容性載體材料將一種或兩種生物相容性材料按1 50-50 1的重量比例配成水溶液，所述材 料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質酸、硫酸軟骨素等，將上述溶液注入細胞 培養(yǎng)板，鼓風條件下于30-120°C下烘2-48小時，在細胞培養(yǎng)板上形成一層載體膜材料。然 后用交聯(lián)劑對載體膜材料在20-50°C交聯(lián)處理0. 5-24小時，所述的交聯(lián)劑包括用于物理 交聯(lián)的硫酸鈉、檸檬酸鈉、三聚磷酸鈉等及用于化學交聯(lián)的戊二醛、乙二醛、水楊醛、香草 醛等，交聯(lián)處理后用大量純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑，再在鼓風條件下于30-120°C下烘
2-48小時。2.構建細胞-載體復合材料載體材料用于接種細胞前，用醫(yī)用消毒酒精浸泡12小時，隨后再用 PBS (Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩沖液)洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射
3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、 5% (體積)C02、飽和濕度條件進行孵化。將黑素細胞或按1-40 0-200 0_100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖 維細胞和角質形成細胞以黑素細胞為5X 103-5X 105個細胞/cm2的密度接種在孵化過的載 體膜材料上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)C02、 飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天，即獲得細胞-載體的復 合材料。細胞培養(yǎng)液含100毫升F12培養(yǎng)基、0. 1-100毫升FBS (胎牛血清)、10-50000納克 CT (霍亂毒素)、10-50000微克IBMX (異丁酰甲基黃嘌呤)、0. 1-100毫升Glutamine (谷氨 酰胺)和100-500000微克Gentamicin (慶大霉素)等成分。下面根據(jù)實施例詳細描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1.殼聚糖基載體膜材料的制備a)將殼聚糖用1M的乙酸溶液溶解，配成濃度為1. 5%的殼聚糖溶液；b)將2. 5ml殼聚糖溶液注入細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板置于鼓風烘箱中，于50°C 下干燥6小時；
c)將干燥的殼聚糖膜置于0. 5M的Na2S04溶液中浸泡30min，隨后用大量純凈水沖 洗；d)用0. 1M的NaOH溶液浸泡殼聚糖膜30min以除去膜上殘留的乙酸，再用大量純 凈水沖至PH = 7. 2-7. 4 ；e)將覆蓋殼聚糖膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風烘箱中，37°C條件下干燥24小時；f)得到可用于細胞培養(yǎng)和轉移的載體膜材料。實施例2.殼聚糖_透明質酸基復合載體膜材料的制備a)將殼聚糖用1M的乙酸溶液溶解，配成濃度為1. 5%的殼聚糖溶液；b)將透明質酸用純凈水溶解，配成濃度為1 %的透明質酸溶液；c)將殼聚糖與透明質酸以20 1的重量比例混合，攪拌均勻，得到殼聚糖-透明 質酸混合溶液；d)將2. 5ml混合溶液注入細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板置于鼓風烘箱中，于50°C條 件下干燥6小時；e)將干燥的殼聚糖-透明質酸膜置于0. 5M的Na2S04溶液中浸泡30min，隨后用大 量純凈水沖洗；f)用0. 1M的NaOH溶液浸泡殼聚糖-透明質酸膜30min以除去膜上殘留的乙酸， 再用大量純凈水沖至PH = 7. 2-7. 4 ；g)將覆蓋殼聚糖-透明質酸膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風烘箱中，37°C條件下干燥24 小時；h)得到可用于細胞培養(yǎng)和轉移的載體膜材料。實施例3.殼聚糖_明膠基復合載體膜材料的制備a)將殼聚糖用1M的乙酸溶液溶解，配成濃度為1. 5%的殼聚糖溶液；b)將明膠用1M的乙酸溶液溶解，配成濃度為1 %的明膠溶液；c)將殼聚糖與明膠以10 1的重量比例混合，攪拌均勻，得到殼聚糖_明膠混合 溶液；d)將2. 5ml混合溶液注入細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板置于鼓風烘箱中，于50°C下 干燥6小時；e)將干燥的殼聚糖_明膠膜置于0. 5M的Na2S04溶液中浸泡30min，隨后用大量純 凈水沖洗；f)用0. 1M的NaOH溶液浸泡殼聚糖-明膠膜30min以除去膜上殘留的乙酸，再用 大量純凈水沖至PH = 7. 2-7. 4 ；g)將覆蓋殼聚糖-明膠膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風烘箱中，37°C干燥24小時；h)得到可用于細胞培養(yǎng)和轉移的載體膜材料。實施例4.黑素細胞-殼聚糖復合材料的構建a)將實例1所述的殼聚糖膜置于75%的醫(yī)用消毒酒精中浸泡12小時后用PBS沖 洗干凈；b)將覆蓋殼聚糖膜的細胞培養(yǎng)板置于紫外燈下照射12小時；c)在細胞培養(yǎng)板里注入3毫升細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積) C02、飽和濕度下孵化4小時；
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d)將黑素細胞以5X 103-5X 105個細胞/cm2的密度接種在殼聚糖膜上，置于細胞 培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)C02、飽和濕度下培養(yǎng)；e)每兩天換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天；f)得到黑素細胞_殼聚糖復合材料，可進一步用于的移植。實施例5.黑素細胞_殼聚糖_透明質酸復合材料的構建a)將實例2所述的殼聚糖_透明質酸復合膜置于75%的醫(yī)用消毒酒精中浸泡12 小時后用PBS沖洗干凈；b)將覆蓋殼聚糖_透明質酸復合膜的細胞培養(yǎng)板置于紫外燈下照射12小時；c)在細胞培養(yǎng)板里注入3毫升細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積) C02、飽和濕度下孵化4小時；d)將黑素細胞以5 X 103-5 X 105個細胞/cm2的密度接種在殼聚糖_透明質酸復合 膜上，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)C02、飽和濕度下培養(yǎng)；e)每兩天換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天；f)得到黑素細胞-殼聚糖-透明質酸復合材料，可進一步用于的移植。實施例6.黑素細胞_殼聚糖_明膠復合材料的構建a)將實例3所述的殼聚糖_明膠復合膜置于75%的醫(yī)用消毒酒精中浸泡12小時 后用PBS沖洗干凈；b)將覆蓋殼聚糖_明膠復合膜的細胞培養(yǎng)板置于紫外燈下照射12小時；c)在細胞培養(yǎng)板里注入3毫升細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積) C02、飽和濕度下孵化4小時；d)將黑素細胞以5X 103-5X 105個細胞/cm2的密度接種在殼聚糖-明膠復合膜 上，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)C02、飽和濕度下培養(yǎng)；e)每兩天換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天；f)得到黑素細胞_殼聚糖_明膠復合材料，可進一步用于的移植。實施例7.移植a)選取約四周齡的裸鼠進行動物移植實驗；b)根據(jù)裸鼠體重，按照0. 025ml/g的劑量，用0. 3%戊巴比妥鈉對裸鼠進行腹腔麻 醉；c)使用手術刀在裸鼠背部側面以刮削方式制造皮膚創(chuàng)口，面積約1. 5cm2，刮至創(chuàng) 面出現(xiàn)點狀出血；d)將4cm2實例4所述的黑素細胞-殼聚糖復合材料的細胞面貼敷于備皮區(qū)域；e)對移植后裸鼠進行常規(guī)包扎，并用手術線在包扎物邊緣斷點縫合。f)移植后裸鼠于無菌環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，水和食物充足供給。實施例8.觀察移植后人黑素細胞在裸鼠體表定植情況a) 1周后拆除裸鼠外包扎敷料；b)酒精吸入麻醉法麻醉裸鼠，使用激光共聚焦顯微鏡對裸鼠移植部位進行觀察， 可見成團黑素細胞；c)在移植部位活檢取材，一抗使用鼠抗人S-100單克隆抗體，常規(guī)免疫組化標記， 結果為陽性，說明裸鼠移植部位組織切片中有人黑素細胞存在；
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根據(jù)激光共聚焦顯微鏡和免疫組化檢測結果可以確定，組織工程材料上搭載的人 黑素細胞可以遷移至動物創(chuàng)面部位。
權利要求
一種基于組織工程材料的黑素細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備生物相容性載體材料將一種或兩種生物相容性材料按1∶50-50∶1的重量比例配成水溶液，所述生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質酸、硫酸軟骨素等，將水溶液注入細胞培養(yǎng)板，鼓風條件下于30-120℃下烘2-48小時，在細胞培養(yǎng)板上形成一層載體膜材料。然后用交聯(lián)劑對載體膜材料在20-50℃交聯(lián)處理0.5-24小時，所述的交聯(lián)劑包括用于物理交聯(lián)的硫酸鈉、檸檬酸鈉或三聚磷酸鈉及用于化學交聯(lián)的戊二醛、乙二醛、水楊醛或香草醛，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑，再在鼓風條件下于30-120℃下烘2-48小時。(2)構建細胞-載體復合材料載體材料用于接種細胞前，用醫(yī)用消毒酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37℃、5％CO2、飽和濕度條件進行孵化。將黑素細胞或按1-40∶0-200∶0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖維細胞和角質形成細胞以黑素細胞為5×103-5×105個細胞/cm2的密度接種在孵化過的載體膜材料上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天，即獲得細胞-載體的復合材料。
2.根據(jù)權利要求1所述基于組織工程材料的黑素細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細 胞培養(yǎng)液含100毫升F12培養(yǎng)基、0. 1-100毫升FBS、10-50000納克CT、10-50000微克IBMX、 0. 1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分。
3.—種權利要求1所述基于組織工程材料的黑素細胞在治療白癜風方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于組織工程材料的黑素細胞的培養(yǎng)方法及其應用，本發(fā)明利用組織工程技術構建具有良好生物相容性載體材料，進行黑素細胞或其與成纖維細胞、角質形成細胞的(共)培養(yǎng)和轉移，可用于色素脫失癥(如白癜風)和皮膚顏色的調節(jié)。本發(fā)明涉及具有生物相容性載體材料的制備、細胞-載體復合材料的構建以及移植。載體材料的使用，不僅為細胞培養(yǎng)提供了良好的載體、保持細胞活性、解決了細胞移植過程中細胞懸液易流失的問題，同時通過調節(jié)細胞的接種密度和培養(yǎng)時間、實現(xiàn)對不同個體皮膚顏色的調控，此外，載體材料有良好的抗破損、抗撕裂、易轉移等性能，良好的促進傷口愈合的作用，可滿足大面積色素脫失癥和皮膚顏色調節(jié)的使用要求。
文檔編號C12N5/071GK101856517SQ20101020382
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權日2010年6月18日
發(fā)明者傅麗芳, 尉曉冬, 王文俊, 董東, 許思原, 許愛娥 申請人:杭州市第三人民醫(yī)院;浙江大學