專利名稱：畢赤酵母新菌株及其混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及從自然界分離得到的畢赤酵母菌株，并將 其擴(kuò)大，并混合用于發(fā)酵半纖維素稀酸水解物，降解其中對(duì)產(chǎn)木糖醇酵母有毒的物質(zhì)， 及這種脫毒水解物用于發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素(lignocellulose)，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分，由纖維素、半纖維 素和木質(zhì)素三大部分組成。作物秸桿是人類社會(huì)最容易集中獲得木質(zhì)纖維素資源，將其 中的纖維素、半纖維素水解成相應(yīng)的糖類，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)人類社會(huì)需要的化工品，是這 一低價(jià)值資源轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品的有效途徑。纖維素是葡萄糖的聚合物，水解產(chǎn)物主要是葡萄糖。天然狀態(tài)下的纖維素往往 形成類似結(jié)晶的緊密結(jié)構(gòu)，具有較高抗酸、酶水解能力。半纖維素主要成分是木聚糖， 它在在結(jié)構(gòu)上比纖維素要疏松，容易通過稀酸水解生成以木糖為主的水解物。將木質(zhì)纖維水解為可發(fā)酵性糖，目前最主要的兩條工藝路線是預(yù)處理一酶水 解及兩步稀酸水解工藝。原料預(yù)處理一酶水解工藝當(dāng)中，以稀酸水解半纖維素的預(yù)處理措施最為常 用。稀酸水解半纖維素的同時(shí)，也破壞了木質(zhì)素天然結(jié)構(gòu)，使纖維素充分裸露，增加了 纖維素酶與底物的可接觸性，因而稀酸水解之后的纖維殘?jiān)捅容^容易被纖維素酶水解 了。兩步稀酸水解工藝的過程是，先用較低濃度的酸，在相對(duì)低的溫度條件下水解半纖 維素，然后再用較高濃度的酸，并在較高的溫度條件下水解纖維素，獲得以葡萄糖為主 要成分的纖維素水解物。為避免木糖在高溫條件下受到破壞，兩步稀酸水解工藝中，需 將半纖維素水解物分離之后，才進(jìn)行纖維素殘?jiān)乃崴?。顯然，無論那一條木質(zhì)纖維素水解工藝路線，都會(huì)分離出以木糖為主要成分的 半纖維素稀酸水解物。將半纖維素水解物分離出來，并單獨(dú)發(fā)酵利用，是一條經(jīng)濟(jì)價(jià)值 較高的木質(zhì)纖維水解物生物轉(zhuǎn)化利用途徑。因?yàn)槔梦逄继堑钠脚_(tái)，可以生產(chǎn)一系列用 六碳糖難以生成的高附加值產(chǎn)品。木糖醇，由木糖還原生成，是一種國際市場容量極大的功能性甜味劑。發(fā)酵半 纖維素水解物生產(chǎn)木糖醇，是提高半纖維素水解物經(jīng)濟(jì)價(jià)值的有效途徑。如本發(fā)明人之 一的專利申請(qǐng)“熱帶假絲酵母菌株的分離及其用于木糖醇生產(chǎn)的方法”(發(fā)明專利申請(qǐng) 號(hào)2005 10037580.2)，就提供了一種能轉(zhuǎn)化木糖生成木糖醇的微生物菌株，及其直接發(fā) 酵半纖維素水解物生產(chǎn)木糖醇的方法。但是，半纖維稀酸水解過程會(huì)伴隨產(chǎn)物一系列對(duì)微生物細(xì)胞代謝有毒的副產(chǎn) 物，以提高半纖維素水解物的木糖醇發(fā)酵性能。這些毒物除去越充分，則木糖醇發(fā)酵的 水平就越高，發(fā)酵成本就越低。半纖維素水解物中，對(duì)微生物代謝有毒物質(zhì)十分復(fù)雜，已經(jīng)鑒定的成分達(dá)幾十種，它們大體上可分為三大類脂肪酸類，如甲酸，乙酸，丙酸，乙酰丙酸；呋喃類， 如糠醛，5-羥甲基糠醛；芳香類，如愈創(chuàng)木酚，苯甲醛，阿魏酸。雖然已經(jīng)人們已經(jīng)嘗試過許多物理或化學(xué)除去這些微生物代謝抑制物，提高半 纖維素水解物的發(fā)酵性能。但是，即使對(duì)于幾個(gè)公認(rèn)最有效的脫毒方法，如真空濃縮， 活性碳吸附，過量石灰處理，離子交換，或者聯(lián)合使用不同脫毒方法，其局限性都是十 分明顯的。例如，產(chǎn)生新的廢棄物，增加產(chǎn)物純化及后期環(huán)境治理的負(fù)擔(dān)，脫毒成本也 比較高。此外，理化脫毒一股難達(dá)以純木糖作為基質(zhì)的發(fā)酵的水平。半纖維素水解物生物發(fā)酵脫毒工藝具有傳統(tǒng)理化方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)性第 一，不產(chǎn)生新的污染物，不增加產(chǎn)物純化及后期環(huán)境治理的負(fù)擔(dān)；第二，直接用發(fā)酵罐 進(jìn)行，節(jié)省設(shè)備投資；第三，可實(shí)現(xiàn)有毒成分的生物轉(zhuǎn)化利用，如生產(chǎn)飼料酵母等，使 資源利用更為合理充分，進(jìn)一步降低脫毒成本。半纖維素水解物生物發(fā)酵脫毒工藝已經(jīng)有若干報(bào)道。本發(fā)明人的“一種半纖維水解物的生物脫毒方法及脫毒活性菌株”(中國專 禾IJ，發(fā)明申請(qǐng)?zhí)?00810180438.7)，公開了一種以脫毒活性微生物菌株降解除去存在于 半纖維稀酸水解物中的微生物代謝抑制物的方法。該發(fā)明所用的脫毒活性微生物菌 株，包括東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)CCTCC NO M 206098和西方伊薩酵母 (Issatchenkiaoccidentalis)CCTCC NO M 206097，它們均能同時(shí)降解存在于半纖維水解 物中包括醋酸，糠醛及酚類物質(zhì)在內(nèi)的微生物代謝抑制物，具有耐低pH值、不利用五碳 糖或其糖醇的特點(diǎn)。用該發(fā)明活性菌株對(duì)半纖維水解物進(jìn)行單獨(dú)的生物脫毒處理，能有 效改善半纖維素水解物的發(fā)酵性能，提高發(fā)酵產(chǎn)物乙醇，木糖醇的收率，并具環(huán)保、節(jié) 能的優(yōu)勢(shì)。但是，這兩個(gè)菌株本身的耐毒性能不高，只適用于糖濃度較低，相應(yīng)的毒物 濃度也較低的常規(guī)高液/固比半纖維素低壓稀酸水解物。對(duì)于在經(jīng)過濃縮的，或低液/ 固比的半纖維素水解物，因有毒物濃度升高，這兩個(gè)菌株的脫毒過程過于緩慢，增加了 脫毒成本。另外，這兩個(gè)菌株的脫毒的半纖維素水解物，其木糖醇發(fā)酵也未能達(dá)到純木 糖的發(fā)酵水平。如下一些文獻(xiàn)也論述過木質(zhì)纖維素水解物的生物發(fā)酵脫毒工藝，但發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn) 物為乙醇，并不以提取木糖，或發(fā)酵木糖醇為生物脫毒目的。如楊秀山.復(fù)合菌種對(duì)物的原位脫毒乙醇發(fā)酵方法.中國專利申請(qǐng)?zhí)?008 10222897.7.Schneider H.Selective removal of acetic acid from hardwood-spent sulfiteliquor using a mutant yeast.Enzyme Microb.Technol.，1996, 19: 94-98.Nichols, N.N., Dien, B.S., & Guisado，G.M. (2005) .Bioabatement to RemoveInhibitors from Biomass-Derived Sugar Hydrolysates.Applied Biochemistry andBiotechnology, 2005124 379-390Okuda N， Soneura M, Niomiya K, et.al.Biological detoxification of waste housewood hydrolysate using Urebacillus thermosphaericus for bioethanol production. Journal of Bioscience and Bioengineering.2008.106 (2) 128-133.很明顯，已有文獻(xiàn)雖然已經(jīng)注意到 木質(zhì)纖維水解物生物脫毒的優(yōu)點(diǎn)，但均限于 利用單個(gè)脫毒活性菌株。
本發(fā) 明人已經(jīng)注意到用高濃度半纖維素稀酸水解物中進(jìn)行生物脫毒的優(yōu)越性。 因?yàn)?，這可以降低脫毒反應(yīng)器的設(shè)備體積與脫毒運(yùn)行成本。提高半纖維素水解物的糖濃 度可以通過蒸發(fā)濃縮，或采用低液/固比稀酸蒸汽爆破水解的方法而實(shí)現(xiàn)。但是，蒸發(fā) 濃縮過程，或者低液/固比的稀酸蒸汽爆破水解，水解物中毒物濃度將伴隨糖濃度升高 而提高，如果缺少特別耐毒的活性菌株，對(duì)高濃度半纖維素水解物的生物脫毒將很難實(shí) 現(xiàn)高效率。本發(fā)明人還注意到利用單個(gè)脫毒活性菌株對(duì)半纖維素水解物生物脫毒的局限 性。因?yàn)椋肜w維素水解物的毒物過于復(fù)雜，不同化學(xué)性質(zhì)的毒物需通過不同的生物途 徑降解，一個(gè)微生物菌株不可能對(duì)不同代謝途徑的毒物同時(shí)兼?zhèn)浜芨叩慕到饣钚??；谝陨险J(rèn)識(shí)，本發(fā)明人利用耐毒性高的多個(gè)脫毒活性菌株混合培養(yǎng)的方法， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)高濃度半纖維素稀酸水解物進(jìn)行生物脫毒的目的，也解決了單個(gè)微生物菌株脫 毒不充分的缺點(diǎn)。利用本發(fā)明方法對(duì)濃縮之后的半纖維素稀酸水解物，或者用低液/固 比的半纖維素蒸汽爆破水解物進(jìn)行脫毒，均表現(xiàn)出快速、高效和脫毒充分的優(yōu)越性。用 脫毒水解物進(jìn)行木糖醇發(fā)酵，其性能可達(dá)到純木糖為基質(zhì)的發(fā)酵水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明整個(gè)過程，包括利用半纖維素稀酸水解液作為培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)來自不 同環(huán)境的樣品，經(jīng)平板劃線分離，再用已知的毒物進(jìn)行耐受性檢測，獲得耐毒力最強(qiáng)的 三個(gè)分離物。用這三個(gè)分離物發(fā)酵含有已知毒物質(zhì)的培養(yǎng)基，GC-MS對(duì)比分析培養(yǎng)前后 的毒物成分變化，證明這三個(gè)分離物對(duì)所有參試毒物均有降解活性，但對(duì)不同毒物的降 解活性各異。這三個(gè)分離物對(duì)木糖的利用率均很低，用它們單獨(dú)，或不同組合對(duì)半纖維 素水解物進(jìn)行脫毒發(fā)酵，脫毒過的水解液再用產(chǎn)木糖醇酵母菌株進(jìn)行木糖醇發(fā)酵，證實(shí) 三個(gè)分離物聯(lián)合脫毒發(fā)酵過半纖維素水解物，其木糖醇發(fā)酵性能可達(dá)到純木糖為基質(zhì)的 發(fā)酵水平。本發(fā)明還證實(shí)，重復(fù)循環(huán)利用這三個(gè)分離物的細(xì)胞，仍可獲得良好的半纖維 素水解物生物脫毒效果，與產(chǎn)木糖醇酵母混合進(jìn)行同步脫毒發(fā)酵，也能有效提高半纖維 素水解物的木糖醇發(fā)酵效率。本發(fā)明同時(shí)鑒定了這三個(gè)分離物的分類地位。1、本發(fā)明獲得三個(gè)對(duì)半纖維素水解物有毒成分耐受性好的微生物新菌株。發(fā)明人用半纖維素稀酸水解物作為基質(zhì)，從水解廠、紙漿廠自然環(huán)境取樣富集 培養(yǎng)，水解物平板上劃線分離，并通過多次分離獲得一批分離物。以12種已知存在于 半纖維素水解物的有毒成分的混合物為標(biāo)記，檢測這些分離物的耐毒性，最后選出三個(gè) 耐毒性最強(qiáng)的分離物C-4，B-10, D-6。發(fā)明人鑒定分離物C-4屬于西方畢赤酵母 (Pichiaoccidentalis)，分離物 B-IO 屬于盔形畢赤酵母(Pichia galeiformis)，分離物 D-6 屬 于庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)。屬于本發(fā)明的西方畢赤酵母C-4，盔形畢赤酵母B-10，庫德畢赤酵母D-6，它 們的分離過程如下培養(yǎng)基制備種子培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，(NH4) 2S042g/L, MgS04.7H20 0.2g/L, K2HP04 4g/L, KH2P04 6g/L,酵母膏 0.5g/L。pH 自然，121°C滅菌 20min。需制成斜
面時(shí)，外加瓊脂3%。
水解物液體培養(yǎng)基干燥的蔗渣經(jīng)0.8% (w/w)鹽酸預(yù)浸處理24h，濾干游離酸 液，在汽爆機(jī)內(nèi)用0.7MPa壓力蒸煮條件下維持3min，然后瞬間泄壓。收集物料腔內(nèi)所 有樣品，離心除去殘?jiān)?，收集的濾液，用CaC03中和調(diào)節(jié)至pH4.5，85°C保溫30min，濾 去沉淀，即得半纖維素水解物。需濃縮時(shí)，于70°C下減壓真空濃縮至相應(yīng)倍數(shù)。水解物 夕卜力口(NH4) 2S04 2g/L，MgS04.7H20 0.2g/L, K2HP04 4g/L, KH2P04 6g/L，酵母膏 0.5g/L,作為補(bǔ)充養(yǎng)分。需制成平板的水解物，濃縮3倍之后外加瓊脂3%。
毒物培養(yǎng)基12種毒物混合配制，每L溶液含乙酸5.0g，糠醛4.0，香草醛 2.0，苯甲醛4.0，苯甲酸0.5，丙烯酸1.0，己酸0.8，丙酸3.5，愈創(chuàng)木酚3.5，異戊酸 2.5，巴豆酸1.0，丁酸1.5。使用時(shí)按需要濃度稀釋，加入到種子培養(yǎng)基中。富集培養(yǎng)與劃線分離樣品O.lg或O.lmL加入未經(jīng)濃縮的水解物液體培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝量 30mL, 30°C, 200rpm培養(yǎng)3天，每樣品取O.lmL依次轉(zhuǎn)代到濃縮2、3、4倍的新鮮培養(yǎng) 基，每代24h，然后在水解物平板培養(yǎng)基上劃線分離。經(jīng)多次分離實(shí)驗(yàn)，共挑取平板上的 單個(gè)菌落15個(gè)作為初選分離物，轉(zhuǎn)移到斜面保存。毒物培養(yǎng)基稀釋1、5、10、15倍，從斜面接入一環(huán)初選分離物，30°C，200rpm 搖床培養(yǎng)72小時(shí)。在稀釋10倍的毒物培養(yǎng)基只有三個(gè)分離物能夠生長的，實(shí)驗(yàn)編號(hào)分 別為 C-4、B-IO 和 D-6。2.本發(fā)明通過如下方法證實(shí)，所獲得的三個(gè)分離物均能降解半纖維素水解物有 毒成分。培養(yǎng)基基本組成為(NH4)2S045g/L，KH2P04 lg/L, MgS04.7H20 0.5g/ L，CaC120.1g/L, NaCl 0.lg/L,酵母膏0.2g/L，葡萄糖20g/L。另外分別加入下面的毒 物甲酸0.8g/L，乙酸5.0g/L，己酸0.8g/L，苯甲醛4.0g/L，愈創(chuàng)木酚3.5g/L，丙 烯酸l.Og/L，異戊酸2.5g/L，糠醛4.0g/L，香草醛2.0g/L。C-4、B-IO和D-6菌種分別活化后，按5%接種量接入降解毒物培養(yǎng)基，30°C， 200rpm,搖床培養(yǎng)48h，離心除去細(xì)胞，上清液用乙醚(體積比1 1)萃取3次，無水 硫酸鈉干燥除水后，0.45 μ m有機(jī)微孔濾膜過濾，即時(shí)進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS分析條件美國Agilent 7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，氣相 色譜柱DB-FFAP毛細(xì)管柱，30m柱長X0.25mm內(nèi)徑Χ0.25μιη膜厚；進(jìn)樣柱流 速l.OmL/min;進(jìn)樣口溫度250°C，進(jìn)樣量1 μ L，1 20分流進(jìn)樣；升溫程序柱初溫 IOO0C，保持 5min，以 5°C /min 上升到 150°C，再以 10°C /min 升至 250°C，保持 12min ；載氣氦氣，40cm/sec，100°C時(shí)測定；檢測器離子源280°C ；質(zhì)譜條件掃描范圍20-400m/z，NIST05a譜庫。表.1分離物C-4、B-IO和D-6對(duì)毒物的降解活性與途徑
權(quán)利要求
1.用于半纖維素水解物生物脫毒的畢赤酵母新菌株，其為盔形畢赤酵母 (Pichiagaleiformis),原始編號(hào)B-10，它在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的編號(hào)為CCTCC NO M209245。
2.用于半纖維素水解物生物脫毒的畢赤酵母新菌株，其為西方畢赤酵母 (Pichiaoccidentalis)原始編號(hào)C_4，它在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的編號(hào)為CCTCC NO M209273。
3.用于半纖維素水解物生物脫毒的畢赤酵母新菌株，其為庫德畢赤酵母 (Pichiakudriavzevii)，原始編號(hào)D-6，它在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的編號(hào)為CCTCC NO M209274。
4.畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方法，包括(1)獲取半纖維素稀酸水解液，并調(diào)節(jié)PH值至3 7；(2)畢赤酵母混合培養(yǎng)在盔形畢赤酵母CCTCCNO M 209245,西方畢赤酵母 CCTCCN0 M 209273，庫德畢赤酵母CCTCC NO M 209274的這三種酵母當(dāng)中，混合培養(yǎng)a、包括盔形畢赤酵母和西方畢赤酵母，或B、包括前述三種酵母；獲得畢赤酵母混合培養(yǎng)液。(3)畢赤酵母混合培養(yǎng)液接種入步驟1獲得的PH值3 7的半纖維素稀酸水解物， 經(jīng)過發(fā)酵降解除去其中對(duì)微生物代謝有毒物質(zhì)，提高半纖維素水解物發(fā)酵性能。
5.如權(quán)利要求4所述的畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方 法，其特征在于步驟(1)所述獲取半纖維稀酸水解物，是將木質(zhì)纖維素按固液比(w/ v)l 1 7加入濃度為0.7 3% (w/w)的稀鹽酸或稀硫酸溶液，在105 170°C下水 解3min 120min，使其中半纖維素發(fā)生水解，水解結(jié)束壓濾出的溶液部分即為半纖維稀 酸水解物。
6.如權(quán)利要求4所述的畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方法， 其特征在于步驟(2)混合培養(yǎng)方式a，為盔形畢赤酵母CCTCC NO M 209245和西方 畢赤酵母CCTCC NO M 209273的細(xì)胞比為1_5 1-5混合培養(yǎng)；混合培養(yǎng)方式b，為 盔形畢赤酵母CCTCC NO M 209245，西方畢赤酵母CCTCC NO M 209273，庫德畢赤 酵母CCTCC NO: M 209274的細(xì)胞比為1-5 1-5 1 5混合培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求6所述的畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方法， 其特征在于混合培養(yǎng)方式(2)盔形畢赤酵母CCTCC NO M 209245,西方畢赤酵母 CCTCC NO M209273,庫德畢赤酵母CCTCC NO M 209274的細(xì)胞比為1 1 1混 合培養(yǎng)。
8.權(quán)利要求4所述的畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方法，其 特征在于步驟(3)中，畢赤酵母混合培養(yǎng)液按3 10%混合種液的接種量(V/V)接入 PH值3 7的半纖維素水解物，20°C 35°C培養(yǎng)20 60h，離心上清液為半纖維素水解 物生物脫毒液。
9.權(quán)利要求4所述的畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方法，其 特征在于還包括步驟(4)離心收集畢赤酵母混合培養(yǎng)細(xì)胞，重復(fù)循環(huán)利用2 5代。
10.權(quán)利要求8所述的畢赤酵母新菌株混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒方法，其特征在于按權(quán)利要求8的方法獲得半纖維素水解物生物脫毒液后，所述的半纖維素 水解物生物脫毒液再用產(chǎn)木糖醇酵母菌株進(jìn)行木糖醇發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明公開了畢赤酵母新菌株及其混合培養(yǎng)用于半纖維素水解物生物脫毒的方法。本發(fā)明所指的畢赤酵母新菌株，包括盔形畢赤酵母(Pichia galeiformis)CCTCCNOM 209245(B-10)；西方畢赤酵母(Pichia occidentalis)CCTCC NOM 209273(C-4)，庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)CCTCC NOM 209274(D-6)。它們對(duì)12種已知存在于半纖維水解物中的微生物代謝抑制物具有降解活性，并具有耐毒性能好，脫毒過程迅速和不利用五碳糖或其糖醇的特點(diǎn)。用本發(fā)明的三個(gè)菌株聯(lián)合對(duì)半纖維水解物進(jìn)行生物脫毒發(fā)酵，可使處理后水解物的木糖醇發(fā)酵性能達(dá)到純木糖為基質(zhì)的發(fā)酵水平，并具有環(huán)保、節(jié)約成本的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12P19/02GK102010833SQ20101020453
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者衛(wèi)力, 張厚瑞, 林蘭英, 覃香香 申請(qǐng)人:唐傳生物科技(廈門)有限公司