專利名稱：一種利用乳清發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種利用廉價(jià)的乳清原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二 酸的方法。
背景技術(shù)：
丁二酸，又稱琥珀酸，是一種常見的天然有機(jī)酸，廣泛的存在于人體、動(dòng)物、植物、 微生物中。丁二酸是一種重要的化學(xué)品，可用于表面活性劑、清潔劑、溶劑等領(lǐng)域，在食品行 業(yè)可作為PH改良劑、風(fēng)味劑或抗菌劑，也可用作動(dòng)物飼料添加劑或植物助長劑等。在工業(yè) 上，丁二酸是一種重要的碳四平臺化合物，可以轉(zhuǎn)化為很多重要的化學(xué)品，如脂肪酸、四氫 呋喃、1，4_ 丁二醇、丁內(nèi)酯等，還可以作為單體用來合成生物可降解材料PBS。目前已 有超過250種以苯為原料的化工產(chǎn)品可以通過丁二酸轉(zhuǎn)化獲得，因此丁二酸的市場需求不 斷增加。傳統(tǒng)生產(chǎn)方法采用丁烷經(jīng)順丁烯二酸酐通過電解生產(chǎn)，污染大、轉(zhuǎn)化率低、成本高， 嚴(yán)重抑制了琥珀酸的發(fā)展?jié)摿?。采用生物法制備丁二酸，與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，具有環(huán)境友好性、循環(huán)利用 資源、固定co2氣體等諸多優(yōu)點(diǎn)，對緩解當(dāng)今社會(huì)能源短缺和環(huán)境污染具有重大戰(zhàn)略 意義。目前，生物法生產(chǎn)琥珀酸和它大多數(shù)衍生物的合成還處在進(jìn)一步研究和開發(fā) 階段。生物法制備琥珀酸的微生物主要有從牛瘤胃中篩選出的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌 (Actinobacillussuccinogenes)和基因工程構(gòu)建的大腸桿菌(Esherichia coli)，培養(yǎng)基 原料多為葡萄糖。使用低廉價(jià)格的碳源是降低琥珀酸發(fā)酵成本的關(guān)鍵因素之一。已有文獻(xiàn) 報(bào)道采用乳清為碳源進(jìn)行丁二酸發(fā)酵，但是丁二酸產(chǎn)量最高僅為27. 9g/L，收率57%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種綜合利用食品工業(yè)廢棄物乳清，采用發(fā)酵法生產(chǎn)丁二 酸的方法，使得利用本發(fā)明所述的方法可以大大提高丁二酸的產(chǎn)量和收率，達(dá)到綜合有效 利用乳清實(shí)現(xiàn)丁二酸最大產(chǎn)率的目的。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種利用乳清發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，采用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌 Actinobacillussuccinogenes NJ113在含30 100g/L乳糖的乳清的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸。該技術(shù)方案的具體方法是(1)種子培養(yǎng)在100mL血清瓶中進(jìn)行加入種子培養(yǎng)基為20 80mL，通入N2和C02 的混合氣；冷卻后接入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養(yǎng)；其中，種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10(分消)，酵母膏5，NaHC03 10， NaH2P04 2H209. 6，K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8，121°C 滅菌 15min ；培養(yǎng)條件為溫度30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 200r/min，培養(yǎng)時(shí)間10 16h ；(2)發(fā)酵產(chǎn)酸在5L發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2 4L，接種量為3 7%(v/v)，溫度為35 40°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速 在100 300rpm發(fā)酵時(shí)間為30 60h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)乳清(按含乳糖計(jì))30 100，酵母膏0 10，KH2P04 3， MgCl2 6H20 0. 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。其中，乳清的最佳配方為70g/L ；酵母膏為6g/L。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的乳清為工業(yè)生產(chǎn)奶酪的副產(chǎn)物，經(jīng)真空干燥后含75 80% (w/w)乳糖。本發(fā)明的有益效果在于(1)本發(fā)明利用從瘤胃中篩選出的琥珀酸放線桿菌，它也很適宜于發(fā)酵乳清原 料，用其發(fā)酵乳清生產(chǎn)丁二酸，可有效減少氮源用量，產(chǎn)物濃度高達(dá)47. 51g/L，收率高達(dá) 67.9%，很適用于低成本丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)；(2)本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是利用廉價(jià)乳清原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，乳清作為一種價(jià)格 低廉的粗原料可以替代葡萄糖作為碳源用來發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，是一種利用可再生原料的生 產(chǎn)方法，可緩解化學(xué)合成丁二酸的石化資源緊張問題，對環(huán)境友好，并且由于乳清中含有可 供微生物利用的氮源與其他營養(yǎng)成分，因而也能夠顯著減少發(fā)酵的培養(yǎng)基成分。說明書附1乳清發(fā)酵過程曲線
具體實(shí)施例方式本發(fā)明不限于所列出的幾個(gè)實(shí)施例。本發(fā)明所使用的菌種琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113(中 國專利菌種，授權(quán)公告號為CN100537744C)。本發(fā)明所述的乳清為工業(yè)生產(chǎn)奶酪的副產(chǎn)物，經(jīng)真空干燥后含75 80% (w/w)乳 糖。本發(fā)明所采用的有機(jī)酸的分析方法為高效液相色譜法(HPLC) :HPLC系統(tǒng)高效液相色譜儀，WatersHPLC2010工作站；色 譜柱 Prevail organic acid column 250mmX 4. 6mm ；紫外檢測波長 215nm ；流速 lmL/min， 進(jìn)量20iiL，流動(dòng)相25mmol/L KH2P04, pH 2. 5 ；柱溫室溫。重蒸水配制不同濃度的有機(jī)酸 (丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka)、乳酸(Fluka))標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)峰面積與有 機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵樣品經(jīng)離心稀釋后根據(jù)峰面積計(jì)算各有機(jī)酸 含量。本發(fā)明所采用的乳糖的分析方法為高效液相色譜法(HPLC)色譜分析柱Bio-red Aminex HPX-87H型離子排斥色 譜柱；檢測器ShoSex RI-101型示差折光檢測器；流動(dòng)相5mmol/L H2S04溶液；進(jìn)樣體積 20 ii L。流動(dòng)相流速0. 6mL/min ；柱溫55°C。實(shí)施例1(1)種子培養(yǎng)在100mL血清瓶中進(jìn)行加入種子培養(yǎng)基為80mL，通入N2和C02的混 合氣；冷卻后接入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為溫度40°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間16h ；
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(2)發(fā)酵產(chǎn)酸在5L發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積為4L，接種量為7% (v/v)，溫 度為40°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm發(fā)酵 時(shí)間為60h。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10(分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2P04 2H20 9. 6， K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)乳清(按含乳糖計(jì))30 100，酵母膏10，KH2P04 3， MgCl2 6H200. 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。在血清瓶中發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，使用乳清作為碳源，發(fā)酵結(jié)果見表1。表1不同初始乳糖濃度對乳清發(fā)酵制備丁二酸的影響
初始乳糖濃度(g/L) 丁二酸(g/L)乙酸(g/L)甲酸(g/L)收率(％) 從上表可看出，初始乳糖濃度為70g/L時(shí)丁二酸產(chǎn)量最高，達(dá)到46. 94g/L，丁二酸 收率為67. 1%0實(shí)施例2(1)種子培養(yǎng)在100mL血清瓶中進(jìn)行加入種子培養(yǎng)基為20mL，通入N2和C02的混 合氣；冷卻后接入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，培養(yǎng)時(shí)間10h ；(2)發(fā)酵產(chǎn)酸在5L發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2L，接種量為3% (v/v)，溫 度為35°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在lOOrpm發(fā)酵 時(shí)間為30h。按實(shí)例1的方法，在血清瓶中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以真空干燥后的乳清的作為碳源，在 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的酵母膏，其含量為(g/L) :0g、2g、4g、5g、6g、6.5g、7g、8g、9g、 10g。不同酵母膏濃度對乳清發(fā)酵制備丁二酸的影響見表2所示。表2不同酵母膏濃度對乳清發(fā)酵制備丁二酸的影響
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由表2可知，當(dāng)酵母膏濃度在6g/L時(shí)，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到46. 75g/L，繼續(xù)增加酵母膏 用量，丁二酸產(chǎn)量基本無變化。實(shí)施例3本實(shí)施例在生物法制備丁二酸的過程中實(shí)現(xiàn)以乳清為碳源，并通過與少量酵母膏 (6g/L)聯(lián)用實(shí)現(xiàn)菌體發(fā)酵制備丁二酸的能力。菌種、具體培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。初始乳清 70g/L (以乳糖計(jì))。(1)種子培養(yǎng)在100mL血清瓶中進(jìn)行加入種子培養(yǎng)基為50mL，通入N2和C02的混 合氣；冷卻后接入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間12h ；(2)發(fā)酵產(chǎn)酸在5L發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L，接種量為5% (v/v)，溫 度為37°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在180rpm發(fā)酵 時(shí)間為36h。從附

圖1可看出，以乳清為碳源，菌體生長旺盛，丁二酸產(chǎn)量可達(dá)47. 51g/L，收率 為 67. 9%。
權(quán)利要求
一種利用乳清發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，采用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的具體方法是(1)種子培養(yǎng)在100mL血清瓶中進(jìn)行加入種子培養(yǎng)基為20 80mL，通入N2和C02的 混合氣；冷卻后接入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養(yǎng)；(2)發(fā)酵產(chǎn)酸在5L發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2 4L，接種量為3 7%(v/ v)，溫度為35 40°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在 100 300rpm發(fā)酵時(shí)間為30 60h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟⑴中種子培養(yǎng)基(g/L)為 葡萄糖 10(分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2P04 2H20 9. 6，K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8， 121°C 滅菌 15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中的種子培養(yǎng)條件為溫 度30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 200r/min，培養(yǎng)時(shí)間10 16h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為 乳清(按含乳糖計(jì))30 100，酵母膏 0 10，KH2P04 3，MgCl2 6H20 0. 3，CaCl20. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基中乳清含量 為按含乳糖計(jì)70g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏含 量為6g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳清為工業(yè)生產(chǎn)奶酪的副產(chǎn)物，經(jīng) 真空干燥后含75 80% (w/w)乳糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用乳清發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，采用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸。本發(fā)明利用從瘤胃中篩選出的琥珀酸放線桿菌，它也很適宜于發(fā)酵乳清原料，用其發(fā)酵乳清生產(chǎn)丁二酸，可有效減少氮源用量，產(chǎn)物濃度高達(dá)47.51g/L，收率高達(dá)67.9％，很適用于低成本丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是利用廉價(jià)乳清原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，乳清作為一種價(jià)格低廉的粗原料可以替代葡萄糖作為碳源用來發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，是一種利用可再生原料的生產(chǎn)方法，可緩解化學(xué)合成丁二酸的石化資源緊張問題，對環(huán)境友好，并且由于乳清中含有可供微生物利用的氮源與其他營養(yǎng)成分，因而也能夠顯著減少發(fā)酵的培養(yǎng)基成分。
文檔編號C12P7/46GK101857888SQ201010205810
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者奚永蘭, 姜岷, 方曉江, 李建, 楊卓娜, 鄭曉宇, 韋萍, 馬江峰 申請人:南京工業(yè)大學(xué)