專利名稱：分枝桿菌菌種檢測膜條及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分枝桿菌菌種檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種分枝桿菌菌種檢測膜條及試劑
品.O
背景技術(shù)：
根據(jù)國際分枝桿菌分類工作組研究確定，將分枝桿菌分為三大類(Rimyon分類 法)一、緩慢生長菌群1.結(jié)核菌群包括人型結(jié)核桿菌，牛型結(jié)核桿菌，非洲分枝桿菌，田鼠分枝桿菌。2. I群光產(chǎn)色菌。特點是在暗處培養(yǎng)時菌落顏色不明顯，在增殖期接觸光線1小時 后菌落呈林檸檬色。如堪薩斯、海分枝桿菌等。3. II群暗產(chǎn)色菌。特點是在暗處培養(yǎng)時菌落呈橘黃色，S型。長期暴光則呈赤橙 色。如瘰癘、戈氏分枝桿菌。4. III群不產(chǎn)色菌。特點是一般無色素產(chǎn)生。如鳥型、胞內(nèi)、潰瘍分枝桿菌等。二、迅速生長菌即IV群菌，特點是快速生長。包括偶發(fā)、龜、恥垢分枝桿菌等。三、需要特殊營養(yǎng)菌包括麻風(fēng)分枝桿菌、鼠麻風(fēng)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌。Rimyon分類法中的I、II、III、IV群分枝桿菌又稱為非結(jié)核分枝桿菌 (nontuberculosis mycobacteria NTM)。結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的非結(jié)核分枝桿菌(NTM)引起的疾病稱為非 結(jié)核分枝桿菌病，可累及淋巴結(jié)、皮膚、軟組織和肺。非結(jié)核分枝桿菌感染肺臟，引起肺部病 變稱為非結(jié)核分枝桿菌肺病。非結(jié)核分枝桿菌(NTM)在世界上報道的有150多種，其中命 名了 54種，有致病性的分枝桿菌有37種，中國境內(nèi)分離出了 20多種。NTM是一種環(huán)境分枝桿菌，大部分是腐物寄生菌，主要存在于自然環(huán)境中，現(xiàn)在普 遍被接受的觀點是，人可從環(huán)境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的傳播途徑，人與人之 間傳播尚未得到證實，但可以通過動物傳染給人。世界各國由于地理、環(huán)境、氣候的不同，各國經(jīng)濟(jì)、文化水平、醫(yī)療技術(shù)水平的差異 和對疾病的調(diào)查方法、標(biāo)準(zhǔn)不同，NTM病流行情況千差萬別，但目前幾乎是結(jié)核病傾向減少， NTM病有逐漸增加趨勢。1979年我國第一次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，8省市52萬人痰菌培養(yǎng)陽性 681份，經(jīng)菌種鑒定29株為NTM，分離率為4. 3%。1990年第三次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣 調(diào)查結(jié)果顯示，NTM感染率為15. 35%，浙江省最高為44. 89%。2000年全國流調(diào)中NTM菌 株占11. 1%。非結(jié)核分枝桿菌致病性有如下特點(1)老年人身患多種疾病易發(fā)病。非結(jié)核分枝桿菌通常作為繼發(fā)性或伴隨性疾病，感染具有機(jī)會性是此菌致病性的一個顯著特點。往往在慢性阻塞性肺疾病、老年人、惡性 腫瘤病人、腎透析、臟器移植時接受免疫抑制劑以及應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素者，本病發(fā)生率增 加。(2)致病性低。一般認(rèn)為NTM對人類的致病性比結(jié)核分枝桿菌低。劉敬東認(rèn)為，全 國感染NTM者估計在1億以上，但發(fā)病者僅百余例。我病區(qū)同時期有9例患者使用呼吸機(jī)， 其中8例患者從痰中檢測到抗酸桿菌，通過結(jié)核菌培養(yǎng)加菌種鑒定，其中7例患者無結(jié)核復(fù) 合群。這8例患者中僅1例有明確的肺部陰影。(3)臨床癥狀差異較大。一般認(rèn)為NTM引起的肺部病變與肺結(jié)核十分相似，癥狀 大多較輕，缺少特征性。一般表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、低熱和疲乏或偶有咯血，有些患者無明顯臨 床癥狀和體征。因多數(shù)患者有肺部基礎(chǔ)疾病，蓁咳嗽、咳痰的癥狀往往被誤診為基礎(chǔ)疾病所 致。(4)艾滋病及HIV感染者多發(fā)。在美洲和歐洲艾滋病病人中，發(fā)現(xiàn)50%患者感染 分枝桿菌，其中10% 15%為鳥-胞內(nèi)復(fù)合群分枝桿菌。(5)耐藥率高。有報道非結(jié)核分枝桿菌的耐藥率為95. 9% ；耐多藥率為83. 7%。由于分支桿菌耐藥率高，在疾病檢測過程中菌種鑒定的作用尤為重要，鑒定所感 染菌種可以更好的指導(dǎo)用藥。目前國內(nèi)外的分枝桿菌菌種檢測試劑盒主要存在檢測范圍偏小，容易漏檢的缺
點o

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種可一次檢測23中分枝桿菌類 型，且檢測時間短，結(jié)果準(zhǔn)確可信的分枝桿菌菌種檢測膜條。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案—種分枝桿菌菌種檢測膜條，包括一基底，和固定于所述基底上的特異性寡核苷 酸探針，所述特異性寡核苷酸探針包括1)用于檢測恥垢分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 26-28任意一項所示；2)用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO 29-31任意一項所示；3)用于檢測堪薩斯分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 32-33任意一項所示；4)用于檢測龜分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID N0:4或 SEQ ID NO 34-38任意一項所示；5)用于檢測海分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :5或 SEQ ID NO 39-41任意一項所示；6)用于檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 6或 SEQ ID NO 42-45任意一項所示；7)用于檢測土分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :7或 SEQ ID NO 46-48任意一項所示；
8)用于檢測不產(chǎn)色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 8 或SEQ ID NO 49-50任意一項所示；9)用于檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 9或 SEQ ID NO 51-53任意一項所示；10)用于檢測鳥分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :10或 SEQ ID NO 54-56任意一項所示；11)用于檢測瘰疬分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 11 或SEQ ID NO 57-58任意一項所示；12)用于檢測膿腫分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 12 或SEQ ID NO 59-61任意一項所示；13)用于檢測蟾蜍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 13 或SEQ ID NO 62-64任意一項所示；14)用于檢測淺黃分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 14 或SEQ ID NO 65-67任意一項所示；15)用于檢測草分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :15或 SEQ ID NO 68-70任意一項所示；16)用于檢測戈登分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 16 或SEQ ID NO 71-73任意一項所示；17)用于檢測次要分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 17 或SEQ ID NO 74-75任意一項所示；18)用于檢測金色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 18 所示或SEQ ID NO 76-78任意一項所示；19)用于檢測胃/潰瘍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 19或SEQ ID NO 79-80任意一項所示；20)用于檢測母牛分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 20 或SEQ ID NO 81-82任意一項所示；21)用于檢測蘇爾加分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 21或SEQ ID NO 83-84任意一項所示；22)用于檢測迪氏分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 22 或SEQ ID NO 85-86任意一項所示；23)用于檢測猿猴分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 23 或SEQ ID NO 87-89任意一項所示；上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換。所述基底為尼龍膜。一種分枝桿菌菌種檢測試劑盒，所述試劑盒包括1)用于檢測恥垢分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 26-28任意一項所示；2)用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO 29-31任意一項所示；
3)用于檢測堪薩斯分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 32-33任意一項所示；4)用于檢測龜分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :4或 SEQ ID NO 34-38任意一項所示；5)用于檢測海分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :5或 SEQ ID NO 39-41任意一項所示；6)用于檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 6或 SEQ ID NO 42-45任意一項所示；7)用于檢測土分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :7或 SEQ ID NO 46-48任意一項所示；8)用于檢測不產(chǎn)色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 8 或SEQ ID NO 49-50任意一項所示；9)用于檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 9或 SEQ ID NO 51-53任意一項所示；10)用于檢測鳥分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :10或 SEQ ID NO 54-56任意一項所示；11)用于檢測瘰疬分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 11 或SEQ ID NO 57-58任意一項所示；12)用于檢測膿腫分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 12 或SEQ ID NO 59-61任意一項所示；13)用于檢測蟾蜍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 13 或SEQ ID NO 62-64任意一項所示；14)用于檢測淺黃分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 14 或SEQ ID NO 65-67任意一項所示；15)用于檢測草分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :15或 SEQ ID NO 68-70任意一項所示；16)用于檢測戈登分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 16 或SEQ ID NO 71-73任意一項所示；17)用于檢測次要分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 17 或SEQ ID NO 74-75任意一項所示；18)用于檢測金色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 18 所示或SEQ ID NO 76-78任意一項所示；19)用于檢測胃/潰瘍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 19或SEQ ID NO 79-80任意一項所示；20)用于檢測母牛分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 20 或SEQ ID NO 81-82任意一項所示；21)用于檢測蘇爾加分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 21或SEQ ID NO 83-84任意一項所示；22)用于檢測迪氏分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 85-86任意一項所示；23)用于檢測猿猴分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 23 或SEQ ID NO 87-89任意一項所示；上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換；24)特異性擴(kuò)增分枝桿菌16S rRNA和23S rRNA之間插入序列的引物，其堿基序列 如 SEQ ID NO 24-25 所示。所述寡核苷酸探針固定于基底上。所述寡核苷酸探針固定于尼龍膜上。本發(fā)明根據(jù)不同的分枝桿菌的16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列的不同，經(jīng) 過大量的基因序列比對和篩選，對每種分枝桿菌設(shè)計了 3-6條探針，從這些探針種分別選 取一種效果最好的探針作為該分枝桿菌的鑒定檢測探針。設(shè)計的探針如下 通過大量的不同探針之間的組合實驗，最終確定優(yōu)選的一種探針組合形式(從每 種探針種挑選一條探針作為最優(yōu)的探針組合，每個組合有23條探針)，通過探針的篩選，不 僅能夠消除探針之間的交叉反應(yīng)而且又能準(zhǔn)確區(qū)分每一種分枝桿菌。本發(fā)明所述引物的設(shè)計原則及篩選方法細(xì)菌rRNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rRNA和23SrRNA 是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA和23S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基 因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由保守區(qū)及可變區(qū)兩部分組成。其分子內(nèi)存在的可變區(qū)，顯示出細(xì)菌不 同分類等級水平上的特異性。因此，可以根據(jù)分枝桿菌16S rRNA、23S rRNA及16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列(ITS序列)的可變區(qū)的特異性來區(qū)分不同種的分枝桿菌，以達(dá)到 鑒定不同分枝桿菌菌種的目的。從原理上來講這三個區(qū)域都可以作為分枝桿菌菌種區(qū)分鑒 定的可選區(qū)域，但是，16S rRNA區(qū)域上基因序列膠保守，不同分枝桿菌之間的差異較小，所 以存在有些分枝桿菌無法區(qū)分的情況，對于設(shè)計特異的檢測探針有難度。而對于23S rRNA 的研究信息量較少，而且在該區(qū)域上的基因序列的變化差異較大，對于同種分枝桿菌的序 列差異也很大，所以在特異性探針設(shè)計上也存在難度。而16S rRNA和23S rRNA之間的插 入序列(ITS序列)的變異區(qū)可以充分區(qū)分各種分枝桿菌，是進(jìn)行分枝桿菌的菌種鑒定最理 想的區(qū)域，因此，我們的產(chǎn)品也選取16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列(ITS序列)作 為我們的目的基因片段。根據(jù)分枝桿菌的16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列所處的特殊位置，我們選 取16S rRNA的保守區(qū)作為上游引物的設(shè)計區(qū)域，同時選取23S rRNA的保守區(qū)作為下游引 物的設(shè)計區(qū)域，根據(jù)公知技術(shù)引物設(shè)計原則分別設(shè)計四條上游引物和四條下游引物，通過 試驗選取其中擴(kuò)增效率最高的一對引物作為該專利技術(shù)使用引物。設(shè)計的四對引物如下 其中擴(kuò)增效果最好的一對引物如下 本發(fā)明根據(jù)分枝桿菌16S rRNA和23S rRNA的保守區(qū)域來設(shè)計特異的擴(kuò)增引物，根據(jù)不同的分支桿菌16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列設(shè)計相應(yīng)的探針，利用雜交進(jìn) 行菌種檢測。 本發(fā)明所述分枝桿菌菌種基因檢測試劑盒采用PCR結(jié)合反向DNA雜交芯片檢測技 術(shù)，能夠在一天時間內(nèi)同時鑒定23種分枝桿菌，該技術(shù)是目前能同時鑒定分枝桿菌種類最 多的，時間最短，檢測結(jié)果最可靠的新技術(shù)。本發(fā)明所述試劑盒通過不同分枝桿菌的基因序 列的差異來區(qū)分分枝桿菌，從細(xì)菌的基因序列和分子結(jié)構(gòu)水平來區(qū)分和鑒定，分類更準(zhǔn)確， 更可靠。解決了傳統(tǒng)鑒定方法中通過細(xì)菌的生長形態(tài)來鑒定所存在的鑒定所需時間長達(dá) 4-6周，結(jié)果無法判斷，鑒定種類少和對部分分枝桿菌存在漏檢的問題。


圖1是恥垢分枝桿菌(MSM)檢測結(jié)果圖2是胞內(nèi)分枝桿菌(MIN)檢測結(jié)果圖3是堪薩斯分枝桿菌(MKA)檢測結(jié)果圖4是龜分枝桿菌(MCH)檢測結(jié)果圖5是海分枝桿菌(MMA)檢測結(jié)果圖6是偶發(fā)分枝桿菌(MF0)檢測結(jié)果圖7是土分枝桿菌(MIE)檢測結(jié)果圖8是不產(chǎn)色分枝桿菌(MN0)檢測結(jié)果圖9是結(jié)合分枝桿菌(MTC)檢測結(jié)果圖10是鳥分枝桿菌(MAV)檢測結(jié)果圖11是瘰疬分枝桿菌(MSC)檢測結(jié)果圖12是膿腫分枝桿菌(MAB)檢測結(jié)果圖13是蟾蜍分枝桿菌(MXE)檢測結(jié)果圖14是淺黃分枝桿菌(MGI)檢測結(jié)果圖15是草分枝桿菌(MPH)檢測結(jié)果圖16是戈登分枝桿菌(MG0)檢測結(jié)果圖17是次要分枝桿菌(MTR)檢測結(jié)果圖18是金色分枝桿菌(MAU)檢測結(jié)果圖19是胃/潰瘍分枝桿菌(MGA)檢測結(jié)果圖
圖20是母牛分枝桿菌(MUA)檢測結(jié)果圖21是蘇爾加分枝桿菌(MSZ)檢測結(jié)果圖22是迪氏分枝桿菌(MDI)檢測結(jié)果圖23是猿猴分枝桿菌(MSI)檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例1 一種分枝桿菌菌種檢測膜條包括一基底，和固定于所述基底上的特異性寡核苷酸探針，所述特異性寡核苷酸 探針包括1)用于檢測恥垢分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :1所不；2)用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :2所 示；3)用于檢測堪薩斯分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 3 所示；4)用于檢測龜分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :4所 示；5)用于檢測海分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :5所 示；6)用于檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :6所 示；7)用于檢測土分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :7所 示；8)用于檢測不產(chǎn)色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 8 所示；9)用于檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :9所 示；10)用于檢測鳥分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :10所 示；11)用于檢測瘰疬分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 11 所示；12)用于檢測膿腫分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 12 所示；13)用于檢測蟾蜍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 13 所示；14)用于檢測淺黃分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 14 所示；15)用于檢測草分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :15所 示；16)用于檢測戈登分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 16 所示；17)用于檢測次要分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 17 所示；18)用于檢測金色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 18 所示；19)用于檢測胃/潰瘍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 19所示；20)用于檢測母牛分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 20 所示；
21)用于檢測蘇爾加分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 21所示；22)用于檢測迪氏分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 22 所示；23)用于檢測猿猴分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 23 所示；探針固定方法將探針和1M NHS、1M DEC混合處理，利用DNA點樣儀在芯片制作 程序的控制下進(jìn)行點樣，點樣完畢后將探針可通過與尼龍膜表面經(jīng)處理而含有的活性基團(tuán) (氨基、巰基)形成共價鍵的方法固定于尼龍膜上，探針固定量為是5uM的探針溶液點樣 lul后風(fēng)干。實施例2 —種分枝桿菌菌種檢測試劑盒所述試劑盒包括固定有特異性寡核苷酸探針尼龍膜和特異性擴(kuò)增分枝桿菌16S rRNA和23S rRNA之間插入序列的引物，其堿基序列如 SEQ IDNO 24-25 所示；尼龍膜條上固定的特異性寡核苷酸探針包括1)用于檢測恥垢分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :1所 示；2)用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :2所 示；3)用于檢測堪薩斯分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 3 所示；4)用于檢測龜分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID N0:4所 示；5)用于檢測海分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID N0:5所 示；6)用于檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :6所 示；7)用于檢測土分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :7所 示；8)用于檢測不產(chǎn)色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 8 所示；9)用于檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :9所 示；10)用于檢測鳥分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :10所 示；11)用于檢測瘰疬分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 11 所示；12)用于檢測膿腫分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 12 所示；
13)用于檢測蟾蜍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 13 所示；14)用于檢測淺黃分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 14 所示；15)用于檢測草分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO :15所 示；16)用于檢測戈登分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 16 所示；17)用于檢測次要分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 17 所示；18)用于檢測金色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 18 所示；19)用于檢測胃/潰瘍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 19所示；20)用于檢測母牛分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 20 所示；21)用于檢測蘇爾加分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDN0 21所示；22)用于檢測迪氏分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 22 所示；23)用于檢測猿猴分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO 23 所示。實施例3用實施例2所述檢測試劑盒對臨床樣品進(jìn)行檢測，所需試劑20XSSC pH 7. 0NaCl175. 3g檸檬酸鈉88. 2g加吐0 750mL溶解，用pH計調(diào)pH至7. 0，最后定容至lOOOmL，并高壓滅菌保存。10% SDS pH 7. 0SDS20g加H20 180mL 溶解，用 pH 計調(diào) pH 至 7. 0，最后定容至200mL。A 液(1XSSC，0. SDS, pH 7. 4)20XSSC 100mL10% SDS lOmL力卩H20 定容至 1000mL。B 液(0. 5 X SSC, 0. 1% SDS, pH 7. 4)20 X SSC 25mL
170187]10% SDS 10mL
0188]加H20定容至lOOOmL。
0189]C 液(0. 1M 檸檬酸鈉，pH 5. 4)
0190]1M檸檬酸鈉lOOmL
0191]加H20 定容至 lOOOmL。
0192]顯色液(新鮮配制使用，按順序加入以下溶液)
0193]C 液19mL
0194]TMBlmL30% H202 2 u L1.從臨床樣本中提取分支桿菌基因組DNA從臨床樣本中提取分枝桿菌基因組DNA可采用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司的 分枝桿菌DNA快速提取試劑盒來提取，具體的提取方法參照《分枝桿菌DNA快速提取試劑盒 操作說明書》。同時也可以采用其它的方法或者其它公司的試劑盒來提取分枝桿菌基因組 DNA，只需提取的DNA量能達(dá)到本產(chǎn)品的檢測要求即可。痰樣中分枝桿菌DNA的提取1)收集臨床痰樣，加入等量的化痰試劑(4%的NaOH)，充分振蕩化痰處理15 30 分鐘，直至痰液完全液化。(注如果痰樣很濃呈干酪狀，則加入兩倍量的化痰試劑。)2)轉(zhuǎn)移1. 2mL痰樣消化液到1. 5mL離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清。3)加入lmL M洗液，充分混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，棄上清。4)加入50④L M裂解液，充分混勻，于沸水中煮10分鐘(注意離心管管蓋可能會 爆開，小心污染)。5) 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，上清液即可作為PCR模板。2. PCR 擴(kuò)增取出PCR反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，于5000rpm離心2秒后加入4④L樣品上清 液作為PCR擴(kuò)增模板。每次實驗，必須設(shè)置一個陽性對照和一個陰性對照，即各以4④L陽 性對照DNA和裂解液為模板。按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增 3.雜交取15mL塑料離心管，放入標(biāo)有患者編號的膜條，加入A液5_6mL及所有(25 y L) PCR產(chǎn)物，將蓋擰緊，混勻PCR產(chǎn)物，再將離心管蓋稍擰松，以避免加熱時管蓋爆開。將離心管放入沸水中加熱10分鐘(確保雜交液液面完全位于沸水液面之下)，取出擰緊蓋子，放入 雜交箱57°C雜交1. 5到4小時。同時取50mL塑料管，加入40mL B液于雜交箱或水浴箱中 進(jìn)行預(yù)熱至57 °C。對照另外取兩張膜條分別與陰性對照PCR產(chǎn)物和陽性對照PCR產(chǎn)物雜交，方法同上。4.洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL塑料管中，于57°C輕搖洗滌15分鐘(每管 40mL溶液，最多可同時洗滌6張膜條)。5.顯色用A液配制1 2000的POD溶液(單做兩張膜只需4 y L POD母液，配制成8mL 使用液，做四張膜可用6 y L POD母液，配制成12mL使用液)，室溫輕搖浸泡30分鐘，棄去 POD溶液。用A液室溫輕搖洗兩次，每次5分鐘。用C液室溫洗膜1-2分鐘，同時配制顯色 液(顯色液需新鮮配制，配法見上一頁)。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10 15分鐘即 可觀察結(jié)果。6.結(jié)果判定實驗的每張膜條在PC位點處均應(yīng)有藍(lán)色斑點出現(xiàn)，此時結(jié)果的判讀視為有效；陰 性對照的雜交膜條除PC位點有藍(lán)色斑點外，其它位點均不應(yīng)顯色，否則有可能是發(fā)生污染 或?qū)嶒灢怀晒?。膜條上探針排列順序 膜條上各位點代表的意義 由斑點顯現(xiàn)的位置即可判斷患者所感染分桿菌的類型。圖1顯示感染分枝桿菌的類型是恥垢分枝桿菌(MSM)。圖2顯示感染分枝桿菌的類型是胞內(nèi)分枝桿菌(MIN)。圖3顯示感染分枝桿菌的類型是堪薩斯分枝桿菌(MKA)。圖4顯示感染分枝桿菌的類型是龜分枝桿菌(MCH)。圖5顯示感染分枝桿菌的類型是海分枝桿菌(MMA)。圖6顯示感染分枝桿菌的類型是偶發(fā)分枝桿菌(MF0)。圖7顯示感染分枝桿菌的類型是土分枝桿菌(MIE)。圖8顯示感染分枝桿菌的類型是不產(chǎn)色分枝桿菌(MN0)。圖9顯示感染分枝桿菌的類型是結(jié)合分枝桿菌(MTC)。圖10顯示感染分枝桿菌的類型是鳥分枝桿菌(MAV)。圖11顯示感染分枝桿菌的類型是瘰疬分枝桿菌(MSC)。圖12顯示感染分枝桿菌的類型是膿腫分枝桿菌(MAB)。圖13顯示感染分枝桿菌的類型是蟾蜍分枝桿菌(MXE)。圖14顯示感染分枝桿菌的類型是淺黃分枝桿菌(MGI)。圖15顯示感染分枝桿菌的類型是草分枝桿菌(MPH)。圖16顯示感染分枝桿菌的類型是戈登分枝桿菌(MG0)。圖17顯示感染分枝桿菌的類型是次要分枝桿菌(MTR)。圖18顯示感染分枝桿菌的類型是金色分枝桿菌(MAU)。圖19顯示感染分枝桿菌的類型是胃/潰瘍分枝桿菌(MGA)。圖20顯示感染分枝桿菌的類型是母牛分枝桿菌(MUA)。圖21顯示感染分枝桿菌的類型是蘇爾加分枝桿菌(MSZ)。圖22顯示感染分枝桿菌的類型是迪氏分枝桿菌(MDI)。圖23顯示感染分枝桿菌的類型是猿猴分枝桿菌(MSI)。
權(quán)利要求
一種分枝桿菌菌種檢測膜條，包括一基底，和固定于所述基底上的特異性寡核苷酸探針，其特征在于所述特異性寡核苷酸探針包括1)用于檢測恥垢分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO26-28任意一項所示；2)用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO29-31任意一項所示；3)用于檢測堪薩斯分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO3或SEQ ID NO32-33任意一項所示；4)用于檢測龜分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO4或SEQ ID NO34-38任意一項所示；5)用于檢測海分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO5或SEQ ID NO39-41任意一項所示；6)用于檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO6或SEQ ID NO42-45任意一項所示；7)用于檢測土分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO7或SEQ ID NO46-48任意一項所示；8)用于檢測不產(chǎn)色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO8或SEQ ID NO49-50任意一項所示；9)用于檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO9或SEQ ID NO51-53任意一項所示；10)用于檢測鳥分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO10或SEQ ID NO54-56任意一項所示；11)用于檢測瘰疬分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO11或SEQ ID NO57-58任意一項所示；12)用于檢測膿腫分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO12或SEQ ID NO59-61任意一項所示；13)用于檢測蟾蜍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO13或SEQ ID NO62-64任意一項所示；14)用于檢測淺黃分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO14或SEQ ID NO65-67任意一項所示；15)用于檢測草分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO15或SEQ ID NO68-70任意一項所示；16)用于檢測戈登分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO16或SEQ ID NO71-73任意一項所示；17)用于檢測次要分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO17或SEQ ID NO74-75任意一項所示；18)用于檢測金色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO18所示或SEQ ID NO76-78任意一項所示；19)用于檢測胃/潰瘍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDNO19或SEQ ID NO79-80任意一項所示；20)用于檢測母牛分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO20或SEQ ID NO81-82任意一項所示；21)用于檢測蘇爾加分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ IDNO21或SEQ ID NO83-84任意一項所示；22)用于檢測迪氏分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO22或SEQ ID NO85-86任意一項所示；23)用于檢測猿猴分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO23或SEQ ID NO87-89任意一項所示；上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分枝桿菌菌種檢測膜條，其特征在于所述基底為尼龍膜。
3.一種分枝桿菌菌種檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括1)用于檢測恥垢分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :1或SEQ ID NO 26-28任意一項所示；2)用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :2或SEQ ID NO 29-31任意一項所示；3)用于檢測堪薩斯分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:3或 SEQ ID NO 32-33任意一項所示；4)用于檢測龜分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :4或SEQ ID NO 34-38任意一項所示；5)用于檢測海分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :5或SEQ ID NO 39-41任意一項所示；6)用于檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :6或SEQ ID NO 42-45任意一項所示；7)用于檢測土分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :7或SEQ ID NO 46-48任意一項所示；8)用于檢測不產(chǎn)色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:8或 SEQ ID NO 49-50任意一項所示；9)用于檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID NO :9或SEQ ID NO 51-53任意一項所示；10)用于檢測鳥分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:10或SEQ ID NO 54-56任意一項所示；11)用于檢測瘰疬分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:11或 SEQ ID NO 57-58任意一項所示；12)用于檢測膿腫分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:12或 SEQ ID NO 59-61任意一項所示；13)用于檢測蟾蜍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:13或 SEQ ID NO 62-64任意一項所示；14)用于檢測淺黃分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:14或 SEQ ID NO 65-67任意一項所示；15)用于檢測草分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:15或SEQ ID NO 68-70任意一項所示；16)用于檢測戈登分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:16或 SEQ ID NO 71-73任意一項所示；17)用于檢測次要分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:17或 SEQ ID NO 74-75任意一項所示；18)用于檢測金色分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:18所示 或SEQ ID NO 76-78任意一項所示；19)用于檢測胃/潰瘍分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQIDN0 :19或 SEQ ID NO 79-80任意一項所示；20)用于檢測母牛分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:20或 SEQ ID NO 81-82任意一項所示；21)用于檢測蘇爾加分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQIDN0 21或 SEQ ID NO 83-84任意一項所示；22)用于檢測迪氏分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:22或 SEQ ID NO 85-86任意一項所示；23)用于檢測猿猴分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQID N0:23或 SEQ ID NO 87-89任意一項所示；上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換；24)特異性擴(kuò)增分枝桿菌16SrRNA和23S rRNA之間插入序列的引物，其堿基序列如 SEQ ID NO 24-25 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種分枝桿菌菌種檢測試劑盒，其特征在于所述寡核苷酸探 針固定于基底上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種分枝桿菌菌種檢測試劑盒，其特征在于所述寡核苷酸探 針固定于尼龍膜上。
6.一種分枝桿菌菌種檢測方法，包括以下步驟1)從樣品中提取分枝桿菌基因組DNA;2)以步驟1)所得DNA為模板，利用權(quán)利要求3所述特異性擴(kuò)增分枝桿菌16SrRNA和 23S rRNA之間插入序列的弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)上述PCR產(chǎn)物與固定在基質(zhì)上的權(quán)利要求3所述探針序列雜交；4)洗膜及顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分枝桿菌菌種檢測試劑盒，包括一膜條，所述膜條上固定有特異性檢測23種分枝桿菌的特異性寡核苷酸探針和特異性擴(kuò)增分枝桿菌16S rRNA和23S rRNA之間插入序列的引物。本發(fā)明所述分枝桿菌菌種基因檢測試劑盒采用PCR結(jié)合反向DNA雜交芯片檢測技術(shù)，能夠在一天時間內(nèi)同時鑒定23種分枝桿菌，該技術(shù)是目前能同時鑒定分枝桿菌種類最多的，時間最短，檢測結(jié)果最可靠的新技術(shù)。本發(fā)明所述試劑盒通過不同分枝桿菌的基因序列的差異來區(qū)分分枝桿菌，從細(xì)菌的基因序列和分子結(jié)構(gòu)水平來區(qū)分和鑒定，分類更準(zhǔn)確，更可靠。
文檔編號C12Q1/68GK101857903SQ20101020689
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者任維, 鄒耀東 申請人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司