專利名稱：基于核糖體28S-rRNA對葉螨分屬的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本研究開發(fā)了一種能快速有效進(jìn)行葉螨分屬鑒定的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，可 用于葉螨分屬水平上的鑒定和驗證。
背景技術(shù)：
葉螨是一種危害果蔬和溫室植物的世界范圍的重要經(jīng)濟(jì)害蟲。物種的鑒定是生物 安全中最基本的問題，而葉螨物種鑒定的困難在于有限的形態(tài)學(xué)特征，而且這些特征具有 高度的相似性。另外，只有很少一部分分類學(xué)家專于葉螨的形態(tài)學(xué)鑒定，并且數(shù)量日趨減 少?；贒NA序列對葉螨科物種的鑒定，相對于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定而言具有特殊的意義，它 的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡單、可靠。作者已研究基于核糖體28S_rRNA的D1-D2部分序列對葉螨進(jìn)行分屬水平上的快 速鑒定，并證實了該鑒定方法具有可靠性和實用性。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是通過設(shè)計新的核糖體28S_rRNA的特異性引物，擴(kuò)增 出目的片段，通過序列分析軟件計算各物種的遺傳距離和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而在屬水平 上迅速區(qū)別和鑒定物種。技術(shù)方案基于核糖體28S_rRNA對葉螨分屬的快速鑒定方法，共分為四步1)提取葉螨總DNA挑單頭雌成螨放入25 ill STE緩沖液中進(jìn)行碾磨，加入2 ill 10mg/ml蛋白酶K， 37 °C孵育30min后，95 °C初始變性5min并使蛋白酶K失活，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增，STE 緩沖液配制100mMNaCl，10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8. 0 ；2) PCR 擴(kuò)增根據(jù)GenBank上登錄的葉螨28S_rRNA的基因片段，利用Primer 5. 0軟件設(shè)計了 一對特異性引物即上游引物28S-F 5，-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3，和下游引物28S-R 5，-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3，。以提取的葉螨總DNA作為DNA模板，反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 如下

3
反應(yīng)體系
ddH2030. 6u L10X Buffer5uLMg2Cl 25mM5 u LDNTP 2. 5mM4u LPrimer 28S-F20 uM1. 5u LPrimer 28S-R20 uM1. 5u LTaq DNA聚合酶5U/'y m0. 4u LDNA模板2.Ou L
總體積50iiL擴(kuò)增條件預(yù)變性94°C，4min ；30 個循環(huán)變性 92°C，lmin,退火 55°C，lmin,延伸 72°C，lmin ；3)克隆和測序利用AXYGEN回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，再將純化產(chǎn)物連接 到pGEM-T載體，最后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)基中長出的白斑，在 LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將菌液送到測序公司進(jìn)行測序，每個種群取三個樣品進(jìn)行克隆和測序，以 它們的一致序列為準(zhǔn)。4)序列數(shù)據(jù)分析獲得的未知物種DNA序列用BLAST工具進(jìn)行檢索并從Genebank下載同源性相近 的物種序列，下載序列要求同一屬不同物種2條以上，至少3個不同屬；對同源性DNA序列 用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對生成aln文件；將生成的aln文件用MEGA 4. 01軟件 轉(zhuǎn)換生成meg文件；采用距離法計算各樣間的遺傳距離，遺傳距離小于2%的為同一屬的物 種，遺傳距離遠(yuǎn)大于2%的為不同屬的物種；基于p-distance模型，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹，通過1000次檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度；同一屬的物種以99%的置信度處在同一進(jìn) 化枝上，未知物種獲得屬種分類。有益效果1、基于核糖體28S_rRNA對葉螨分屬的快速鑒定方法與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比， 克服了葉螨相似的形態(tài)學(xué)特征的干擾，從而進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。2、降低了鑒定的技術(shù)門檻，鑒定者無需分類學(xué)專業(yè)知識，只要掌握基本的分子克 隆技術(shù)和序列分析軟件即可使用此鑒定方法。3、基于核糖體28S_rRNA對葉螨分屬的快速鑒定技術(shù)利用堿基ACTG組成的序列使 物種鑒別數(shù)值化。
四

圖1作者一共獲得中國葉螨科6個屬11個物種的28條核糖體28S序列。另夕卜， 從GenBank中下載10條螨類的28S序列太平洋細(xì)須螨Tenuipalpus pacificus (登錄 號:AB287405)用作夕卜群，T. truncatus, T. urticae, T. piercei, T. hydrangeae, Petrobia harti, Panonychus citri, Panonychus ulmi, Oligonychus coffeae 禾口 T. kanzawai (登i 號分別是AY750692-750699和AB369895)被當(dāng)成未鑒定種群用于系統(tǒng)發(fā)生分析和驗證鑒定 結(jié)果。分支上的數(shù)值表示的是1000次重復(fù)抽樣檢測的置信度。
五具體實施例方式1、核糖體28S_rRNA特異性引物設(shè)計根據(jù)GenBank上登錄的葉螨28S_rRNA的基因片段，利用Primer 5. 0軟件 設(shè)計了一對特異性引物，即，上游引物5 ’ -AACGAGATTCCCACTGTCCC-3，和下游引物 5，-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3，，用于擴(kuò)增28S_rRNA的部分片段。基于核糖體28S_rRNA對 葉螨分屬的快速鑒定技術(shù)的具體步驟如下1)提取葉螨總DNA
挑取單頭雌成螨放入25 ill STE緩沖液中進(jìn)行碾磨，加入2 ill 10mg/ml蛋白酶 K，37°C孵育30min后，95°C初始變性5min并使蛋白酶K失活，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增， STE緩沖液配制100mMNaCl，10mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH 8. 0 ；每個葉螨地理種群或物種 提取DNA 8頭，總共28個種群，共提取224頭葉螨總DNA。2) PCR 擴(kuò)增根據(jù)GenBank上登錄的葉螨28S_rRNA的基因片段，利用Primer 5. 0軟件設(shè)計 了一對通用引物即上游引物28S-F :5，-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3，和下游引物28S-R 5，-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3，。以提取的葉螨總DNA作為DNA模板，反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件
如下
反應(yīng)體系
ddH2030. 6u L
10X Buffer5 u L
Mg2Cl 25mM5 u L
DNTP 2. 5mM4u L
Primer 28S-F 20u M1. 5u L
Primer 28S-R 20u M1. 5u L
Taq DNA 聚合酶 5U/ u m0. 4u L
DNA模板2. Ou L
總體積50 u L
擴(kuò)增條件
預(yù)變性 94°C，4min ；
30 個循環(huán)變性 92°C，lmin,退火 55°C，lmin,延伸 72°C，lmin ；
3)克隆和測序利用AXYGEN回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，再將純化產(chǎn)物連接
到pGEM-T載體，最后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)基中長出的白斑，在 LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將菌液送到測序公司進(jìn)行測序，每個種群取三個樣品進(jìn)行克隆和測序，以 它們的一致序列為準(zhǔn)。4)序列數(shù)據(jù)分析獲得的DNA序列用BLAST工具進(jìn)行序列分析、DNA序列檢索；用Genedoc軟件進(jìn)行 序列同源性比較；用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯；用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對；比對結(jié) 果輸入MEGA 4軟件，采用距離法計算各樣間的遺傳距離，并基于p-distance模型，用鄰接 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1000次檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度。同一屬的物種遺傳距離小于2%，不同的屬的物種遺傳距離遠(yuǎn)大于2% ；同一屬的 物種以99%的置信度處在同一進(jìn)化枝上，不同屬物種被明顯區(qū)分開。2、基于核糖體28S_rRNA對葉螨分屬的快速鑒定使用者無需分類學(xué)專業(yè)知識，只需掌握常規(guī)的分子克隆技術(shù)提取DNA，PCR擴(kuò)增， 產(chǎn)物純化，連接和轉(zhuǎn)化，搖菌，送菌液進(jìn)行測序，以及采用常用的序列分析軟件。比如我們現(xiàn)在要鑒定一個未知物種首先通過分子克隆和測序獲得其28S_rRNA 序列；獲得的DNA序列用BLAST工具進(jìn)行DNA序列檢索并從Genebank下載同源性相近的物 種序列(下載序列要求同一屬不同物種2條以上，至少3個不同屬)；對同源性DNA序列
5用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對生成aln文件；將生成的aln文件用MEGA 4. 01軟件 轉(zhuǎn)換生成meg文件；采用距離法計算各樣間的遺傳距離，并基于p-distance模型，用鄰接法 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度。我們通過未知物種和其他物種的 遺傳距離及其在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置可從屬水平上鑒定該物種。軟件具體操作方法1.在word里輸入未知物種和Genebank下載的序列，輸入物種名(Genebank數(shù)據(jù) 庫中每個序列對應(yīng)有來源種或?qū)?，未知物種另命名，如‘W1’，并在名字前加上“ > ”。2.將其復(fù)制生成txt文本文件，并命名，如“patent, txt”。3.雙擊打開Clustalxl. 81，點(diǎn)擊下拉菜單‘File，，選擇，Load sequence，，選擇操 作文件，如“patent, txt",打開文件。4.在出現(xiàn)的窗口中選擇下拉菜單Alignment，選擇‘Do Complete Alignment’，生 成一個 aln 文件如"patent, aln，，。5.打開軟件MEGA 4. 01，選擇下拉菜單‘File，，點(diǎn)擊‘Open Data，，選擇以上生成 的aln文件，如“patent, aln",點(diǎn)擊‘打開’按鈕。6.在打開的窗口中，選擇下拉菜單 ‘Utilities’，點(diǎn)擊 ‘Convert to MEGA Format’ 選項，出現(xiàn)的對話框中選擇‘OK’按鈕，保存生成meg文件，命名文件，如“patent, meg”，關(guān)閉
當(dāng)前窗口。7.在MEGA主窗口中，選擇下拉菜單‘File，，打開meg文件，在Input Data對話 框中點(diǎn)擊選擇‘Nucleotide sequences’，點(diǎn)擊‘Yes’，在接下來的對話框‘Protein-coding nucleotide sequencedata ？，選擇 ‘No’。8.出現(xiàn)兩個窗口在Sequence Data Explorer窗口中，選擇下拉菜單Data中 選擇Setup/Select Taxa&Groups，立即出現(xiàn)一個對話框，在對話框左下角點(diǎn)擊按鈕‘New group，，即生成并出現(xiàn)第一個新組名Gpl，修改建立種的組名，如‘Amphitetranychus viennensis', Genebank數(shù)據(jù)庫中每個序列對應(yīng)有來源種和地理種群或品系，據(jù)此建立 種的組名并進(jìn)行分類分組，每個物種建立一個組，未知物種單獨(dú)建立一個組(本研究 中共建立11個物種組)；同時在Sequence Data Explorer窗口右側(cè)會出現(xiàn)各序列命 名；如將Amphitetranychus viennensis物種點(diǎn)擊選中，再點(diǎn)擊中間的向左按鈕，這樣 Amphitetranychus viennensis 物禾中被選人了 'Amphitetranychus viennensis'組(本石開 究中有4個該物種的地理種群，所以該物種組就包括4個序列)，用同樣的方法將其他物種 分組。9.在主窗口下拉菜單 Distances 中選擇 ‘Compute Between Groups Means’，彈出 Analysis Preferences對話框，在‘Model’欄中點(diǎn)擊綠色小方塊，出現(xiàn)按鈕，繼續(xù)點(diǎn)擊右彈 出菜單‘Nucleotide，，選擇‘p-distance，，保持其它默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)擊‘Compute，，計算物種 的遺傳距離(本研究中一共計算了 11個物種的遺傳距離)。10.按照步驟8方法，在Sequence Data Explorer窗口中，選擇下拉菜單Data中 選擇Setup/Select Taxa&Groups，立即出現(xiàn)一個對話框，在對話框左下角點(diǎn)擊按鈕‘New group’，即生成并出現(xiàn)第一個新組名Gpl，修改建立屬的組名，如‘Amphitetranychus’， Genebank數(shù)據(jù)庫中每個序列對應(yīng)有來源種或?qū)?，?jù)此建立屬的組名并進(jìn)行分類分組，每個 屬建立一個相應(yīng)的組，未知物種單獨(dú)建立一個組；(本研究中共建立6個組，分別代表6個不同的屬)；在主窗口下拉菜單Distances中選擇‘Compute Between Groups Means’禾口 ‘Compute within Groups Means’，按照步驟9的方法分別計算屬內(nèi)屬間平均遺傳距離。11.在主窗口主菜單中點(diǎn)擊下拉菜單Phylogeny，選擇‘Bootstrap Test ofPhylogeny’，右彈出菜單選擇 ‘Neighbor-Joining’，彈出一個對話框，在 ‘Phylogeny Test and Options’點(diǎn)擊右邊綠色小方塊，在彈出的對話框中左邊一欄‘Test of inferred phylogeny’中選擇‘Bootstrap’，右邊一欄‘Implications’選擇值‘ 1000’，點(diǎn)擊左下角‘對 號’返回上一級對話框；在‘Model’欄中點(diǎn)擊綠色小方塊，出現(xiàn)按鈕，繼續(xù)點(diǎn)擊右彈出菜單 ‘Nucleotide，，選擇‘p-distance，，保持其它默認(rèn)設(shè)置。點(diǎn)擊‘Compute，按鈕，生成系統(tǒng)發(fā) 育樹。12.根據(jù)未知物種在系統(tǒng)發(fā)育樹的位置，以及未知物種與其它物種的遺傳距離，迅 速準(zhǔn)確地判斷出該未知物種的分屬分類地位。同一屬的物種遺傳距離小于2%，不同的屬的 物種遺傳距離遠(yuǎn)大于2%;同一屬的物種以99%的置信度處在同一進(jìn)化枝上，不同屬物種被 明顯區(qū)分開。作者研究了來自葉螨科6個屬11個種28個種群的核糖體28S_rRNA部分片段。 這是一段來自28S的D1-D2區(qū)域長的片段，經(jīng)過MEGA 4的計算，11個物種的兩兩核苷酸 差異統(tǒng)計結(jié)果見表2，屬間核苷酸差異見表3。由表2可以看出，葉螨屬內(nèi)各物種的核糖體 28S-rRNA核苷酸遺傳距離均小于2%，其平均屬內(nèi)核苷酸遺傳距離只有0. 002 (見表3)。而 全爪螨屬內(nèi)蘋果全爪螨和柑橘全爪螨核苷酸差異僅為0. 008。然而，由表3可以看出屬間遺 傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種間遺傳距離。3、基于核糖體28S_rRNA對葉螨分屬的快速鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確性如圖1所示，太平洋細(xì)須螨Tenuipalpus pacif icus (登錄號AB287405)作為外 群，最先被分離出來，6個屬的物種都以較高的置信度各成一個進(jìn)化枝，系統(tǒng)發(fā)育樹完全支 持形態(tài)學(xué)上鑒定的屬的地位，進(jìn)一步說明了基于核糖體28S-rRNA對葉螨分屬的快速鑒定 技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確性。表1用于研究的葉螨物種 表2葉螨28S-rRNA序列的種間遺傳距離*
* 注1 山楂雙葉螨 Amphitetranychus viennensis ;2 二斑葉螨 T. urticae ;3 朱 砂葉螨 T. cinnabarinus ；4 截形葉螨 T. truncatus ；5 土耳其斯坦葉螨 T. turkestani ；6 神 澤葉螨 T. kanzawai ；7 酢楽草巖螨 Petrobia harti ；8 柑橘全爪螨 Panonychus citri ；9 蘋 HLPanonychus ulmi ； 10 tY^/K^i Schizotetranychus bambusae ；11 Igffi^^^ Aponychus firmianae表3葉螨28S-rRNA序列的屬內(nèi)屬間遺傳距離〃 氺氺注1 雙口十蟲茜屬 Amphitetranychus ；2 口十蟲茜屬 Tetranychus ；3 巖蟲茜屬 Petrobia ； 4 全爪螨屬 Panonychus ；5 裂爪螨屬 Schizotetranychus ；6 缺爪螨屬 Aponychus
權(quán)利要求
基于核糖體28S-rRNA對葉螨分屬的快速鑒定方法，其特征在于1)提取葉螨總DNA挑單頭雌成螨放入25μl STE緩沖液中進(jìn)行碾磨，加入2μl 10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始變性5min并使蛋白酶K失活，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增，STE緩沖液配制100mMNaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，提取DNA；2)PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank上登錄的葉螨28S-rRNA的基因片段，利用Primer 5.0軟件設(shè)計了一對特異性引物即上游引物28S-F5’-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3’和下游引物28S-R5’-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3’，以提取的葉螨總DNA作為DNA模板，反應(yīng)體系ddH2O30.6μL10×Buffer 5μLMg2Cl 25mM 5μLDNTP 2.5mM 4μLPrimer 28S-F20μM1.5μLPrimer 28S-R20μM1.5μLTaq DNA聚合酶5U/μm 0.4μLDNA模板 2.0μL總體積 50μL擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃，4min；30個循環(huán)變性92℃，1min，退火55℃，1min，延伸72℃，1min；3)克隆和測序利用AXYGEN回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，再將純化產(chǎn)物連接到pGEM-T載體，最后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)基中長出的白斑，在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將菌液送到測序公司進(jìn)行測序，每個種群取三個樣品進(jìn)行克隆和測序，以它們的一致序列為準(zhǔn)；4)序列數(shù)據(jù)分析獲得的未知物種DNA序列用BLAST工具進(jìn)行檢索并從Genebank下載同源性相近的物種序列，下載序列要求同一屬不同物種2條以上，至少3個不同屬；對同源性DNA序列用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對生成aln文件；將生成的aln文件用MEGA 4.01軟件轉(zhuǎn)換生成me、文件；采用距離法計算各樣間的遺傳距離，遺傳距離小于2％的為同一屬的物種，遺傳距離遠(yuǎn)大于2％的為不同屬的物種；基于p-distance模型，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1000次檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度；同一屬的物種以99％的置信度處在同一進(jìn)化枝上，未知物種獲得屬種分類。
全文摘要
本發(fā)明是基于核糖體28S-rRNA對葉螨分屬的快速鑒定方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)范疇。28S-rRNA對葉螨分屬的快速鑒定方法是測定葉螨不同屬物種的一段特定28S-rRNA序列，通過序列分析軟件計算各物種遺傳距離和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而對各物種進(jìn)行快速區(qū)分。本發(fā)明根據(jù)葉螨28S-rRNA基因序列設(shè)計了一對新的特異性引物，可擴(kuò)增出多態(tài)性的目的片段，長度約為547-578bp。本發(fā)明所述葉螨分屬的快速鑒定方法迅速、簡單、可靠，既節(jié)約成本，又省時高效。用核糖體28S-rRNA分子鑒定技術(shù)可廣泛用于葉螨分屬水平上的鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK101851681SQ20101020692
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者孫荊濤, 李國慶, 洪曉月 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)