專利名稱：甘氨酸的測(cè)定方法與甘氨酸測(cè)定試劑盒-9079的制作方法
甘氨酸的測(cè)定方法與甘氨酸測(cè)定試劑盒-9079
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及甘氨酸測(cè)定方法及其試齊U盒。
背景技術(shù)：
甘氨酸為非人體必需氨基酸。甘氨酸有獨(dú)特的甜味，能緩和酸、堿味，掩蓋食品中添加糖精的苦味并增強(qiáng)甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多，不僅不能被人體吸收利用，而且會(huì)打破人體對(duì)氨基酸的吸收平衡而影響其它氨基酸的吸收，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)失衡而影響健康。甘氨酸不能被人體利用，只能分解轉(zhuǎn)化為熱能，這樣會(huì)增加肝臟負(fù)擔(dān)。而分解產(chǎn)物中的含氮化合物要通過尿液排出體外，又會(huì)增加腎臟負(fù)擔(dān)。如果大量、長(zhǎng)期食用這類食品，可能造成肝腎損傷。部分含乳飲料企業(yè)為提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量，在生產(chǎn)加工中違規(guī)使用甘氨酸，對(duì)青少年及兒童的正常生長(zhǎng)發(fā)育很容易帶來(lái)不利影響。按照我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB2760規(guī)定，甘氨酸在作為食品添加劑只允許在調(diào)味劑與豆奶中使用，且最高限量為每公斤1克，但在含乳飲料中不允許使用。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種甘氨酸的測(cè)定方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種甘氨酸測(cè)定試劑盒。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用間接酶循環(huán)擴(kuò)增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction) 的聯(lián)用技術(shù)，利用測(cè)定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處的吸光度變化測(cè)定甘氨酸的方法。本發(fā)明甘氨酸測(cè)定方法的的技術(shù)原理是根據(jù)下述氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成 甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+丙酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白2-氧代丁酰合成酶2-氧代丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶本發(fā)明的方法利用氰化氫合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5) 酶(偶)聯(lián)2-氧代丁酰合成酶Q-oxobutyrate synthase ；EC 1. 2. 7. 2)、丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 51)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。氰化氫合成酶、2_氧代丁酰合成酶作為作用酶，氰化氫合成酶功能為將甘氨酸酶解產(chǎn)生二氧化碳，2-氧代丁酰合成酶的酶促作用使二氧化碳產(chǎn)生丙酮酸；丙酮酸脫氫酶作為循環(huán)酶丙酮酸脫氫酶再將丙酮酸再次變回二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。丙酮酸脫氫酶又作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，這樣可以通過測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算甘氨酸的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種甘氨酸的測(cè)定方法。該甘氨酸測(cè)定方法的步驟如下A、樣品準(zhǔn)備A. 1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將甘氨酸濃度調(diào)整到1毫摩爾/升，得到的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；A. 2待測(cè)樣品的制備待測(cè)液體樣品直接測(cè)試，無(wú)須預(yù)處理；將一定量的待測(cè)固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白與輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測(cè)樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長(zhǎng)340nm與副波長(zhǎng)405nm(如果受儀器限制可以不設(shè)副波長(zhǎng))下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定其吸光度隨時(shí)間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測(cè)定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時(shí)間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測(cè)定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時(shí)間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測(cè)定的主波長(zhǎng)340nm的吸光度隨時(shí)間的變化，根據(jù)下式計(jì)算得到
甘氨酸的含量
權(quán)利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甘氨酸濃度測(cè)定方法，其測(cè)定的技術(shù)原理是根據(jù)下述氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+丙酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白2-氧代丁酰合成酶2-氧代丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶
2.一種甘氨酸的測(cè)定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準(zhǔn)備2. 1.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到1毫摩爾/升； 2. 1.2待測(cè)樣品的制備待測(cè)液體樣品直接測(cè)試，無(wú)須預(yù)處理；將一定量的待測(cè)固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白與輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測(cè)樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長(zhǎng)340nm與副波長(zhǎng)405nm(如果受儀器限制，可以不設(shè)副波長(zhǎng))下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定其吸光度隨時(shí)間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測(cè)定步驟2. 1. 1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時(shí)間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測(cè)定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時(shí)間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測(cè)定的主波長(zhǎng)340nm的吸光度隨時(shí)間的變化，根據(jù)下式計(jì)算得到甘氨酸的含量ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)甘氨酸含量- -5<標(biāo)準(zhǔn)濃度(mmol/L)ΔΑ (標(biāo)準(zhǔn))-厶A (空白)式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測(cè)樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標(biāo)準(zhǔn))表示步驟2. 4)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的測(cè)定方法，其特征在于使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定時(shí)，待測(cè)樣品、所述標(biāo)準(zhǔn)樣品與所述空白樣品由該分析儀在設(shè)定條件下自動(dòng)取樣，然后在下述條件下進(jìn)行測(cè)定測(cè)定方法為速率法，溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1/0分鐘，檢測(cè)時(shí)間4/5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的輔酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測(cè)定方法，其特征在于5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、輔酶A、氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶與丙酮酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白與輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶與丙酮酸脫氫酶組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白與輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、2-氧代丁酰合成酶與丙酮酸脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氰化氫合成酶組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測(cè)定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時(shí)用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-5mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L l-100mmol/L緩沖液穩(wěn)定劑輔酶氰化氫合成酶 2-氧代丁酰合成酶丙酮酸脫氫酶丙酰輔酶A 還原型鐵氧還蛋白輔酶 Al-100mmol/Lo·6. 2根據(jù)權(quán)利要求6. 1所述的甘氨酸測(cè)定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L丙酰輔酶A1-1OOmmo1/L還原型鐵氧還蛋白1--1OOmmo1/L輔酶A1-IOOmmo1/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L2-氧代丁酰合成酶1000-80000U/L·丙酮酸脫氫酶1000-80000U/L?！?. 3根據(jù)權(quán)利要求6.1所述的甘氨酸測(cè)定試劑組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L丙酰輔酶Al-100mmol/L還原型鐵氧還蛋白l-100mmol/L輔酶Al-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L2-氧代丁酰合成酶1000-80000U/L丙酮酸脫氫酶1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氰化氫合成酶 1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甘氨酸含量的測(cè)定方法、試劑的組成及成分，其測(cè)定的技術(shù)原理是依據(jù)氰化氫合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成，本發(fā)明還涉及一種甘氨酸測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的測(cè)定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測(cè)定方法與試劑盒可以廣泛地應(yīng)用于食品檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK102297997SQ201010209368
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司