專利名稱：一種胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
目前雖對胰腺病的病理生理過程有一定的認識和了解，但其確切的發(fā)病機制尚不 明了，尤其是重癥急性胰腺炎的療效尚欠滿意。有研究發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎始發(fā)于腺泡細胞 內(nèi)，但在臨床上，由于胰腺標本收集困難，嚴重影響了臨床實驗的進行。在實驗室中，由于胰 腺腺泡細胞是一種能分泌胰酶并進行自身消化的細胞，這就加大了體外原代培養(yǎng)腺泡細胞 的難度。目前國外發(fā)表的有關(guān)原代培養(yǎng)胰腺腺泡細胞的文獻較少，而且最長培養(yǎng)時間不超 過20天，國內(nèi)更未見報道。由此可見，成功原代培養(yǎng)胰腺腺泡細胞為今后進一步研究胰腺 炎發(fā)病機制及新藥開發(fā)提供了最便捷、有效的研究載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的胰腺腺泡細胞的培養(yǎng)中存在的體外原代培養(yǎng)難度 大的問題，提供一種穩(wěn)定的，可以順利進行傳代的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)制備胰腺腺泡細胞懸液； (2)Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化胰腺腺泡細胞。其中，步驟(1)中所述制備胰腺腺泡細胞懸液的方法如下無菌條件下，將SD大鼠 的胰腺取出剪碎，置于孵箱中孵育30min，過濾，用D-Hanks液洗滌2 3次得到細胞懸液， 離心去上清，加入組織培養(yǎng)液，吹打混勻后移入細胞培養(yǎng)瓶，置于孵箱中培養(yǎng)。步驟(2)中， 所述分離純化胰腺腺泡細胞的方法如下將步驟(1)中所得細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置 于孵箱孵育60min后，翻轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)瓶，用毛細吸管吸出細胞懸液，室溫離心取沉淀物，用 不含血清的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀物，反復吹打細胞懸液，將細胞懸液滴加于40% Percoll 密度梯度離心液表面，離心，取出下層區(qū)帶的細胞，即得到分離純化的胰腺腺泡細胞。作為一種優(yōu)選方案，步驟(1)中所述過濾是依次用100目篩和200目篩的尼龍篩 網(wǎng)過濾。作為一種優(yōu)選方案，步驟(1)中所述加入組織培養(yǎng)液的細胞懸液移入細胞培養(yǎng)瓶 后，細胞的密度為IXlO7到5 X IO7個/mL。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)中所述第一次離心的條件為lOOOrpm，IOmin ；第二次 離心的條件為2000rpm，15min。作為一種優(yōu)選方案，所述組織培養(yǎng)液為DMEM/F12，pH為7. 35 7. 45，包含的組 分如下10體積％胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，0. 25 μ g/mL兩性霉素B， 0. 8mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑，5ng/mL表皮生長因子，HEPES緩沖液。作為一種優(yōu)選方案，所述孵箱中的溫度為37°C，CO2含量為50mL/L。作為一種優(yōu)選方案，所述在于40體積％ Percoll密度梯度離心液的制備包括如下步驟先用9份Percoll與1份8. 5wt% NaCl或1. 5mol/L PBS混合達到生理性滲透壓，用 生理溶液稀釋到40%濃度；所述生理溶液為0. 85wt% NaCl或0. 15mol/L PBS。40% Percoll密度梯度離心液的具體制備過程如下Percoll 濃度(％) 706050403020比重 g/ml1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液 平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密 度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針 頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下，采用離心力為400g，時間10 20min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法取自大鼠胰腺，排除污染等影響可長期培 養(yǎng)，通過多種方法鑒定細胞，證明本發(fā)明方法可使細胞保存完好的細胞活力(細胞活性達 96%以上)；本發(fā)明首次通過胰腺腺泡細胞抗體鑒定細胞，培養(yǎng)的胰腺腺泡細胞純度高，解 決了胰腺腺泡體外原代培養(yǎng)難度大的問題，為胰腺腺泡細胞有關(guān)疾病的發(fā)病機理或藥物治 療的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1為新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細胞在光學顯微鏡下的細胞形態(tài)(200倍)；圖2為采用本發(fā)明方法分離純化的胰腺腺泡細胞在光學顯微鏡下的細胞形態(tài) (200 倍)；圖3為采用本發(fā)明方法分離純化的胰腺腺泡細胞培養(yǎng)12h后，在光學顯微鏡下的 細胞形態(tài)(400倍)；圖4為采用本發(fā)明方法分離純化的胰腺腺泡細胞培養(yǎng)24h后，在光學顯微鏡下的 細胞形態(tài)(400倍)；圖5為臺盼藍染色分離純化的胰腺腺泡細胞在光學顯微鏡下的細胞形態(tài)(400 倍)；圖6 7為電鏡下的胰腺腺泡細胞照片(8900倍、15500倍)；圖8為熒光顯微鏡下觀察的經(jīng)DAPI染核的胰腺腺泡細胞(200倍，微尺50 μ m)；圖9 12為免疫熒光鏡下的胰腺腺泡細胞照片(400倍，微尺50 μ m)。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1胰腺腺泡細胞的分離純化1.材料和方法1. 1 動物健康、清潔級SD大鼠，普通飼料喂養(yǎng)，雌雄不限，體重250 300g(廣東省醫(yī)學實 驗動物中心提供)。1. 2 試齊[J
D-Hanks液；Perco 11細胞分離液(Pharmac ia)；生理鹽水；消化液I型膠原酶 (Sigma)，使用時以新鮮配制的D-Hanks液(不含鈣離子)配制0. 5g/L的細胞分離液； 100ml/L的小牛血清；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(Gibico)。其他成分青霉素(Penicillin)； 鏈霉素(Sti^ptomycin)；兩性霉素B (AmphotericinB)；大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean Trypsin Inhibitor, SBTI)；表皮生長因子(EpidermalGrowth Factor, EGF) ；HEPES 緩沖液 (北京鼎國)；胰腺腺泡抗體；戊二醛；多聚甲醛；鋨酸；PBS ；乙醇；包埋劑；醋酸鈾；丙酮； 4wt%臺盼藍母液。1. 3 設(shè)備超凈臺；XDS-I型倒置鏡(重慶光電儀器總公司)；CO2培養(yǎng)箱(英國，RSBiotech Laboratory Equipment Ltd.)；透射電子顯微鏡；超薄切片機。1. 4 方法1. 4. 1胰腺腺泡細胞懸液的制備SD大鼠術(shù)前12小時禁食，不禁水。30g/L戊巴比妥鈉按每IOOg體重0. 1 0. 2mL 進行腹腔內(nèi)注射麻醉，剪去腹部皮毛，將其浸于75體積％的乙醇中消毒30min，將實驗動物 在無菌條件下，腹部朝上固定于超凈工作臺上；充分暴露胰腺和膽總管，鉗夾胰管末端，摘 取大部分胰腺，將其浸于預熱至37°C的D-Hanks液中，洗去血液，剃除血管、脂肪及淋巴組 織，移入盛有5mL預熱至37°C新鮮配制的細胞分離液的燒杯中；用眼科剪迅速將其減碎直 至呈細沙樣小塊(約0. 5 2mm)，置于37°C，50ml/L CO2孵箱中孵育30分鐘，依次用100目 篩和200目尼龍篩網(wǎng)過濾，然后吸取D-Hanks液洗滌2 3次得細胞懸液，以lOOOr/min的 轉(zhuǎn)速，離心5min，棄去上清液，重復步驟2次以清洗殘留的膠原酶，加入5ml配置好的DMEM/ F12組織培養(yǎng)液(含10體積％小牛血清；100U/mL青霉素；100 μ g/mL鏈霉素；0. 25 μ g/mL 兩性霉素B ；0. 8mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑；5ng/mL表皮生長因子；HEPES緩沖液調(diào)整PH至 7. 35 7. 45)，吹打混勻后移入培養(yǎng)瓶，調(diào)整細胞密度至1 X IO7到5 X IO7,置入37°C，50ml/ L CO2孵箱中培養(yǎng)。1.4.2 Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化胰腺腺泡細胞利用差速黏附法進行腺泡細胞的分離純化，即將細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，置 37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，使細胞懸液中黏附能力較強的成纖維細胞先行黏附。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng) 瓶，用毛細吸管吸出處理后的細胞懸液，用于進一步的細胞分離。將腺泡細胞懸液于室溫 下，lOOOr/min離心lOmin，取沉淀物于不含血清的DMEM培養(yǎng)液中重新制成細胞懸液1. 5mL, 反復吹打。15mL離心管中制備40體積％ Percoll密度梯度離心液，將細胞懸液輕輕滴加于 細胞分離液表面，2000r/min，15min離心。離心后，取出下層區(qū)帶的細胞即得純化的腺泡細 胞。實施例2胰腺腺泡細胞的鑒定1胰腺腺泡細胞形態(tài)學觀察胰腺腺泡細胞純化前后、培養(yǎng)12h、ld、3d、5d、9d、15d、30d的胰腺腺泡細胞均在光
鏡下觀察其細胞形態(tài)并拍照。新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細胞在光學顯微鏡下呈圓形或橢圓形，夾雜不規(guī)則形間 質(zhì)細胞及細胞碎片(圖1)。采用Percoll細胞分離液分離純化細胞后可見絕大多數(shù)的圓 形或橢圓形懸浮生長的腺泡細胞，細胞質(zhì)與核比例較大，核圓形，偏于一側(cè)，細胞間雜質(zhì)較
5少(圖2)。12h后可見細胞聚集成串珠樣，個別細胞體形變大，細胞拉長，呈分裂狀態(tài)。(圖 3)。24h后可見細胞數(shù)有所增加，細胞聚集明顯，可見多數(shù)細胞正處增殖中。2 3d換液后 觀察細胞，細胞活性好，細胞數(shù)目明顯增多，傳代良好(圖4)。2臺盼藍染色鑒定細胞活力稱取4g臺盼藍，加少量蒸餾水研磨后加雙蒸水至IOOmL,用濾紙過濾，4°C保存。使用時，用PBS稀釋至0. 4體積％。制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1 X IOVmL,取9mL細胞 懸液移入試管中，加ImL 0.4wt%臺盼藍溶液，混勻后于鏡下觀察。臺盼藍染色測定細胞活性達96%以上，符合進一步實驗要求(圖5)。3透射電子顯微鏡技術(shù)觀察胰腺腺泡細胞亞顯微結(jié)構(gòu)取原代培養(yǎng)的腺泡細胞懸液，1000r/min離心5min，棄去上清，用PBS洗2次，浸于 固定液中，4°C中固定，吸取固定液，IM PBS緩沖液漂洗3次，每次7分鐘后固定，1質(zhì)量％鋨 酸固定90min，吸去溶液，IM PBS緩沖液漂洗3次，每次7分鐘后分別于30體積％乙醇-50 體積％乙醇-70體積％乙醇-80體積％乙醇-95體積％乙醇中脫水，每次lOmin，后用丙酮 沖洗3次，每次10分鐘。加入等體積的丙酮和包埋劑室溫滲透1小時。吸去溶液，加入包 埋劑3次，每次lh，最后一次更換包埋劑后室溫放置過夜。用牙簽挑起樣品放入包埋塊的尖 端部分，并在其中滲透5小時后將包埋塊放入70°C烘箱上層聚合15小時。取出包埋塊，冷 卻，修塊，切片厚度約為60nm左右，用銅網(wǎng)撈片，干燥后經(jīng)鈾染、水洗、鉛染、水洗、干燥等步 驟后在透射電子顯微鏡下觀察腺泡細胞。電鏡下，大量的酶原顆粒位于細胞頂部的胞質(zhì)內(nèi)，直徑600 900nm，細胞核圓形， 多靠近細胞基底部，細胞內(nèi)可見發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，呈板層狀分布于整個細胞基質(zhì)中，在酶 原顆粒聚集的區(qū)域可見高爾基復合體(圖6、7)。4免疫熒光組化法鑒定腺泡細胞取胰腺組織做冰凍切片2張，PBS沖洗3次，每次3min，用10體積％山羊血清封閉 15min,每份加胰腺腺泡細胞抗體25 μ L，于濕盒中孵育lh，用PBS液沖洗3次，每次3min后 FITC標記二抗結(jié)合35min，注意避光(DAPI染核)，用PBS液沖洗3次，每次lmin，于熒光顯
微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果(圖8)可見，胰腺腺泡細胞染成綠色熒光，而中間的胰腺β細胞不染色，說 明此抗體可以很好的結(jié)合胰腺腺泡細胞，對其敏感性高，可用于鑒別胰腺腺泡細胞和胰腺 β細胞。取兩瓶培養(yǎng)細胞，甩片機中每一小孔分別加入100 μ L細胞懸液，以1000轉(zhuǎn)甩片 4min，取出玻片，分別加入胰腺腺泡細胞抗體，設(shè)胰腺腺泡細胞(+)組、自身抗體陰性對照 組，10體積％山羊血清封閉15分鐘后每張玻片上加一抗25 μ L，濕盒中孵育后PBS液沖洗 3次，每次lmin，取出玻片，擦干水分，每標本中加入二抗(含DAPI)，填滿標本表面，暗室內(nèi) 放置30min，PBS液沖洗3次，每次lmin，取出玻片，擦干水分，光學樹脂封片后于免疫熒光 鏡下觀察。免疫熒光鏡下鑒定腺泡細胞可見大量綠色熒光的腺泡細胞(圖9)，與DAPI核 染色一致(圖10)，自身抗體陰性對照組(圖12)未見綠色熒光細胞。圖11是圖9和圖10 的重疊照片。
權(quán)利要求
一種胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)制備胰腺腺泡細胞懸液；(2)Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化胰腺腺泡細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中所述 制備胰腺腺泡細胞懸液的方法如下無菌條件下，將SD大鼠的胰腺取出剪碎，置于孵箱中 孵育30min，過濾，用D-Hanks液洗滌2 3次得到細胞懸液，離心去上清，加入組織培養(yǎng)液， 吹打混勻后移入細胞培養(yǎng)瓶，置于孵箱中培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述過濾是依次 用100目篩和200目篩的尼龍篩網(wǎng)過濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述加入組織培 養(yǎng)液的細胞懸液移入細胞培養(yǎng)瓶后，細胞的密度為1 X IO7到5 X IO7個/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述組織培 養(yǎng)液為DMEM/F12，pH為7. 35 7. 45，包含的組分如下10體積％胎牛血清，100U/mL青霉 素，100μ g/mL鏈霉素，0. 25μ g/mL兩性霉素B，0. 8mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑，5ng/mL表皮 生長因子，HEPES緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述孵箱中的溫 度為37°C，CO2含量為50mL/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中，所述 分離純化胰腺腺泡細胞的方法如下將步驟(1)中所得細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于孵 箱孵育1 2h后，翻轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)瓶，用毛細吸管吸出細胞懸液，室溫離心取沉淀物，用不含 血清的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀物，反復吹打細胞懸液，將細胞懸液滴加于40體積％ Percoll 密度梯度離心液表面，離心，取出下層區(qū)帶的細胞，即得到分離純化的胰腺腺泡細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于第一次離心的條 件為lOOOrpm，IOmin ；第二次離心的條件為2000rpm，15min。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征所述在于40% Percoll密度梯度離心液的制備包括如下步驟先用9份Percoll與1份8. 5wt% NaCl或 1. 5mol/L PBS混合達到生理性滲透壓，用生理溶液稀釋到40%濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述生理溶液 為 0. 85wt% NaCl 或 0. 15mol/L PBS。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法。本發(fā)明胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)方法包括如下步驟(1)制備胰腺腺泡細胞懸液；(2)Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化胰腺腺泡細胞。通過本發(fā)明方法可以成功培養(yǎng)出胰腺腺泡細胞，并可以順利進行傳代，細胞活性達96％以上，為胰腺腺泡細胞有關(guān)疾病的發(fā)病機理或藥物治療的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/071GK101880648SQ20101021214
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者崔淑蘭, 王暉, 葛全興, 陳婧華, 陳懇, 龍友明 申請人:廣東藥學院