專(zhuān)利名稱(chēng)：新型重組人凝血因子Ⅷ及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及新的重組凝血因子VIII (簡(jiǎn)稱(chēng)為“FVIII”，又稱(chēng)為抗血友病因子(AHF))及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
甲型血友病是一種常見(jiàn)的X性連鎖遺傳性出血性疾病，在男性中的發(fā)病率為1 10，000，在所有血友病中占85 %。其致病因素是由于凝血因子 VIII (FactorVIII-related Antigen，簡(jiǎn)稱(chēng)為“FVIII ”)的數(shù)量不足或質(zhì)量異常所致。凝血因子VIII是一血漿高分子糖蛋白，由2332個(gè)氨基酸殘基組成，凝血因子VIII在內(nèi)源性凝血體系中起了十分重要的作用，它是激活凝血因子IX的輔助因子。FVIII基因定位于Xc^8， 全長(zhǎng)1861Λ，由沈個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成。目前對(duì)該病的主要治療方法是從人血漿中提取的濃縮FVIII制劑。但經(jīng)常輸入血液制品，患者極易感染病毒性肝炎及愛(ài)滋病等傳染性疾病，治療費(fèi)用亦十分昂貴，在發(fā)達(dá)國(guó)家，一個(gè)病人每年的治療費(fèi)用通常在美金10，000元以上。同時(shí)，由于FVIII極不穩(wěn)定，且在血漿中的含量甚微，1升血漿僅含150微克FVIII，而且從冰凍血漿中提取FVIII的效率不高，因此目前提供的FVIII濃制劑僅可用于治療，而極少作為常規(guī)預(yù)防用藥。另外，有些患者容易對(duì)FVIII濃制劑產(chǎn)生急性過(guò)敏反應(yīng)，且有15%患者會(huì)產(chǎn)生FVIII抗體，更加增加了治療難度。自1984年FVIII cDNA克隆以來(lái)，已分別在CH0，3T3等體系中成功地獲得有生物活性的rFVIII，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。初步的臨床試驗(yàn)表明重組FVIII具有與血液來(lái)源的FVIII相同的生化、免疫及藥理學(xué)特性，能有效糾正血友病患者的出血傾向，臨床得到了滿意的結(jié)果。FVIII在體外的表達(dá)量明顯低于與其性質(zhì)類(lèi)似的基因，如FVIII的表達(dá)水平只有 FIX的1%，這說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)存在對(duì)FVIII表達(dá)的負(fù)調(diào)控機(jī)制，使FVIII在細(xì)胞內(nèi)的水平保持在一較低的狀態(tài)。這可能是機(jī)體對(duì)FVIII需求的反映，但對(duì)通過(guò)體外重組表達(dá)FVIII來(lái)講是一主要障礙。除此之外，目前國(guó)際上對(duì)血友病的基因治療的嘗試中也發(fā)現(xiàn)維持FVIII的表達(dá)量在治療水平有較大的難度，其原因也是人工構(gòu)建的FVIII表達(dá)體系中FVIII表達(dá)量不能滿足治療所需.這對(duì)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉的FVIII造成了很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)基因的改建，從而構(gòu)建新型的重組FVIII表達(dá)質(zhì)粒，建立表達(dá)體系，并進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)株的全面篩選，有效地提高在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的FVIII的表達(dá)量，為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種提高重組人凝血因子VIII表達(dá)量的方法，包括如下步驟將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列IRES進(jìn)行弱化處理；弱化后的所述序列一端連接目的基因，另一端連接篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建含有雙重
3篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，其中，所述目的基因和篩選標(biāo)記基因共用一個(gè)啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述篩選標(biāo)記基因是二氫葉酸還原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表達(dá)載體是pIRES-DHFR。進(jìn)一步的，通過(guò)氨甲喋呤或MSX加壓擴(kuò)增篩選標(biāo)記基因兩翼的基因。進(jìn)一步的，還包括構(gòu)建不同的凝血因子VIII表達(dá)系統(tǒng)，包括B domain缺失但包含新穎的Linker序列的VIII因子[凝血因子VIII ( Δ B)]，和凝血因子VIII重、輕鏈共表達(dá)的VIII因子[凝血因子VIII (HL)].將以上不同基因結(jié)構(gòu)的FVIII cDNA(FVIII 全長(zhǎng) cDNA，F(xiàn)VIII ( Δ B) cDNA，， FVIII-HL)克隆于表達(dá)載體pIRES-dhfr中，轉(zhuǎn)染CH0、BHK細(xì)胞，48小時(shí)收集培養(yǎng)液，離心后測(cè)定FVIII的生物活性和抗原量。本發(fā)明通過(guò)一系列的基因結(jié)構(gòu)改建以及含弱化的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列的含有雙重篩選標(biāo)記的表達(dá)載體來(lái)表達(dá)重組FVIII，極大地簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，提高篩選效率，獲得高表達(dá)穩(wěn)定株，，F(xiàn)VIII的表達(dá)量有所提高，特別是將FVIII重、輕鏈共表達(dá)后，表達(dá)量有明顯的增加，BHK細(xì)胞表達(dá)體系活性最高，達(dá)到1. 27U/ml/day/106cellS。


圖1是本發(fā)明中具有雙重篩選標(biāo)記的表達(dá)載體pIRES-DHFR/GS示意圖。圖2是不同的FVIII表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3是不同的FVIII表達(dá)質(zhì)粒分別克隆進(jìn)入pIRES-DHFR/GS的示意圖。圖4是FVIII-HC/FVIII-LC雙表達(dá)質(zhì)粒示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1凝血因子VIII基因序列的獲得(I)DNA 及 RNA 的制備高分子量DNA是從一正常人的外周血的細(xì)胞中按常規(guī)方法進(jìn)行抽提。總RNA從新鮮胚胎組織中提取，用異硫氰酸胍-氯化銫梯度法進(jìn)行，并用寡聚脫氧腺苷酸(Oligo-dT) 纖維素柱分離mRNA。(2)寡聚核苷酸引物的設(shè)計(jì)和聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)計(jì)并合成七對(duì)引物，為了便于整個(gè)分子的克隆，每對(duì)引物所擴(kuò)增出的片段兩側(cè)均含有相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。對(duì)引物采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT/PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，其中各對(duì)引物的第二個(gè)引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在40ul體積中進(jìn)行。 包括mRNA 1. 5ug，逆轉(zhuǎn)錄引物IOOng及MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(BRL) 200U。PCR反應(yīng)體系在IOOul體積中進(jìn)行，包括逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)產(chǎn)物IOul (第7對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用的模板為基因組DNA，2ug)，寡核苷酸引物各IOOpmol，dNIPs各為200mmol ； Tris-HCl pH 8.410mmol ；MgCl 21.5mmol ；BSA 20ug/ml ；KCl 50mmol。擴(kuò)增條件變性94°C 45秒；退火55°C 45秒；延伸72°C 1分種，反應(yīng)30個(gè)周期第一周期變性條件為94°C 4分鐘，最后一個(gè)周期延伸時(shí)間增至10分鐘。FVIII基因的14號(hào)外顯子是目前所克隆的人類(lèi)最大的外顯子之一，長(zhǎng)為3. 11Λ。為克隆這部分DNA，用一 RT/PCR產(chǎn)物(長(zhǎng)800bp，含有外顯子14的部分序列)作為探針。篩選基因組文庫(kù)，得到一含外顯子14序列陽(yáng)性克隆。從中分離得到兩個(gè)cDNA片段，分別為 2. 5kb的EcoR I-BamH I片段及420bp的BamHI-Pst I片段。序列分析后分別將這兩個(gè)片段亞克隆至pBluscript SK+質(zhì)粒中，按FVIII cDNA順序?qū)⑵芜M(jìn)行FVIII cDNA組裝。C3)全長(zhǎng) FVIII cDNA 的克隆利用pGEM-3Z及pBluscript SK+的的多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物片段及 2個(gè)來(lái)自基因組文庫(kù)克隆的外顯子14的片段，按照FVIII cDNA順序進(jìn)行組裝。拼接后，得到了 FVIII全部編碼序列的cDNA分子，長(zhǎng)7^8bp，包括5'端非翻譯區(qū)82bp，F(xiàn)VIII編碼序列7053bp及3'端非翻譯區(qū)693bp。在該分子的5'及3'端分別附加有Ml I和Not I 人工接頭，這兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)在整個(gè)分子中并不存在，因此可用于克隆到表達(dá)載體中。 (圖2 實(shí)施例2凝血因子VIII B結(jié)構(gòu)域缺失cDNA (FVIII ( Δ B))的構(gòu)建設(shè)計(jì)寡核苷酸弓I物四條，應(yīng)用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對(duì)FVIII大部分B結(jié)構(gòu)域進(jìn)行缺失突變。得到PCR產(chǎn)物Α，B分別對(duì)應(yīng)于FVIII的1868_2334bp和4974-5164bp。產(chǎn)物 A，B經(jīng)過(guò)變性、再退火后，有16bp的核酸序列可以雜交，這種雜交產(chǎn)物可作為模板，擴(kuò)增得到產(chǎn)物 C(658bp)，對(duì)應(yīng)于 FVIII 基因的 1868_2334bp 和 4974_5164bp。用 BamHI 禾Π PstI 限制性酶切PCR產(chǎn)物C和FVIII金長(zhǎng)cDNA，用PCR產(chǎn)物C替代FVIII全長(zhǎng)cDNA的相應(yīng)片段，這樣就產(chǎn)生了 B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII cDNA(參見(jiàn)圖2)，命名為FVIII(AB)。這種FVIII(AB) 相比全長(zhǎng)FVIII cDNA而言，缺少了 FVIII cDNA中2334_4974bp的堿基序列。(圖2A)實(shí)施例3FVIII cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)將以上FVIII cDNA(FVIII 全長(zhǎng) cDNA，F(xiàn)VIII(AB)cDNA，，F(xiàn)VIII-HL)克隆于表達(dá)載體pIRES-dhfr中。圖2是不同的FVIII表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖，圖3是不同的FVIII 表達(dá)質(zhì)粒分別克隆進(jìn)入pIRES-DHFR/GS的示意圖，圖4是FVIII-HC/FVIII-LC雙表達(dá)質(zhì)粒示意圖，如圖2、圖3、圖4所示，構(gòu)建不同的FVIII表達(dá)質(zhì)粒，包括B domain缺失和FVIII 重、輕鏈共表達(dá)質(zhì)粒，克隆FVIII全長(zhǎng)cDNA(FVIII-W)，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建完成多種分子改建體，包括B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIIKFVIII-Δ B)，F(xiàn)VIII的重鏈部分(FVIII-HC)和FVIII的輕鏈部分(FVIII-LC)，并將其分別克隆進(jìn)入pIRES-DHFR/GS的A多克隆位點(diǎn)，將克隆進(jìn)入 pIRES-DHFR/GS的FVIII-HC和FVIII-LC，分別酶切克隆到pBudCE4. 1質(zhì)粒中，構(gòu)建雙表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO、BHK細(xì)胞，48小時(shí)收集培養(yǎng)液，離心后測(cè)定FVIII的生物活性和抗原量。從下表中可以看到，通過(guò)一系列的基因結(jié)構(gòu)改建，F(xiàn)VIII的表達(dá)量有所提高，特別是將FVIII重、輕鏈共表達(dá)后，表達(dá)量有很明顯的增加，BHK細(xì)胞表達(dá)體系活性最高，達(dá)到 1.27U/ml/day/106cellso表不同基因結(jié)構(gòu)、細(xì)胞表達(dá)系對(duì)凝血因子VIII表達(dá)的影響
權(quán)利要求
1.一種凝血因子VIII重鏈；一種凝血因子VIII輕鏈；一種B結(jié)構(gòu)域缺失的 FVIII(FVI11-Δ B)。
2.一種提高基因重組人凝血因子VIII表達(dá)量的方法，其特征是包括如下步驟將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列IRES進(jìn)行弱化處理；弱化后的所述序列一端連接目的基因，另一端連接篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建含有雙重篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，其中，所述目的基因和篩選標(biāo)記基因共用一個(gè)啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求2所述的一種提高基因重組凝血因子VIII表達(dá)量的方法，其特征是所述篩選標(biāo)記基因是二氫葉酸還原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表達(dá)載體是 pIRES-DHFR或pIRES_GS。還包括通過(guò)氨甲喋呤或MSX加壓擴(kuò)增篩選標(biāo)記基因兩翼的基因。
4.一種表達(dá)載體，其特征是它含有權(quán)利要求1所述的DNA，權(quán)利3的載體所構(gòu)建含所述表達(dá)載體的凝血因子VIII表達(dá)系統(tǒng)，包括B domain缺失的含Linker序列的VIII因子 [凝血因子VIII ( Δ B)]、凝血因子VIII重、輕鏈共表達(dá)的VIII因子[凝血因子VIII (HL)]。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的載體。
6.如權(quán)利要求5所示的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞。
7.一種產(chǎn)生凝血因子VIII的方法，其特征在于，(1)在適合表達(dá)所述凝血因子VIII重鏈和輕鏈的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的凝血因子VIII的重鏈和輕鏈，形成重組的凝血因子VIII ；和(2) 分離所述的凝血因子VIII。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型重組人凝血因子VIII及其生產(chǎn)方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人源凝血因子VIII基因的改建，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建含弱化的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，簡(jiǎn)稱(chēng)為“IRES”)序列及雙重篩選標(biāo)記的新型表達(dá)載體，本載體可用來(lái)高效重組表達(dá)人凝血因子VIII，使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系中的表達(dá)量增加。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102311495SQ20101021352
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者何勝祥, 李昂, 王志強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海同科生物科技有限公司