專利名稱：蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蜜柚果汁脫苦酶的生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)，主要是以為黑曲霉為菌種， 采用特殊的培養(yǎng)基及發(fā)酵，發(fā)酵生產(chǎn)蜜柚果汁脫苦酶，從菌體及發(fā)酵液中提取脫苦酶并應(yīng) 用于蜜柚果汁脫苦，制備無(wú)苦味的蜜柚果汁。其生產(chǎn)技術(shù)屬于發(fā)酵工程及酶工程的內(nèi)容，其 應(yīng)用技術(shù)屬于農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工的內(nèi)容。
背景技術(shù)：
蜜柚是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水果，它味美香醇，深受人們喜愛(ài)。我國(guó)蜜柚種植歷史悠 久，培育形成了福建琯溪蜜柚、浙江玉環(huán)文旦柚、四川坪山紅心柚、廣西沙田柚等多個(gè)名、 優(yōu)、特品種。近年來(lái)，隨著蜜柚種植面積不斷擴(kuò)大，蜜柚產(chǎn)量逐年上升，鮮銷市場(chǎng)趨于飽和，而 深加工技術(shù)研究滯后，尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的深加工，產(chǎn)供銷矛盾日益突出，售果難，果賤傷農(nóng) 的問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)。果肉汁多味美、酸甜適口，蜜柚果皮及果渣含有豐富的膳食纖維(半纖維素及果 膠)及香精油等成分，加工升值的潛力很大，如，果肉可加工生產(chǎn)蜜柚果汁，果皮可用于生 產(chǎn)香精、果膠及果脯，果渣可用于生產(chǎn)果茶、果醬及提取果膠。然而，蜜柚榨汁獲得的鮮果汁 具有明顯的苦味，需要經(jīng)過(guò)脫苦處理后才能加工成無(wú)苦味的蜜柚果汁產(chǎn)品。由于蜜柚脫苦 方面的技術(shù)還達(dá)不到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此，還不能利用蜜柚果肉生產(chǎn)出大宗的果汁加 工產(chǎn)品。雖然利用蜜柚果皮生產(chǎn)蜜柚果脯、蜜柚香精、蜜柚果膠的技術(shù)日趨成熟，但由于蜜 柚果實(shí)中最有加工價(jià)值的部分——蜜柚果汁無(wú)法利用，僅利用蜜柚的果皮生產(chǎn)果脯、提取 柚香精或生產(chǎn)蜜柚果膠無(wú)利可圖，這導(dǎo)致了蜜柚深加工的技術(shù)體系無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此， 建立蜜柚果汁脫苦的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)，將蜜柚加工成能被市場(chǎng)接受的蜜柚果汁產(chǎn)品是蜜柚深加 工技術(shù)領(lǐng)域急需解決的關(guān)鍵難題。目前，有吸附法、酶法、β-環(huán)糊精包埋、苦味物質(zhì)掩蔽劑、代謝法多種技術(shù)可用于 對(duì)蜜柚果汁進(jìn)行脫苦，β “環(huán)糊精包埋、苦味物質(zhì)掩蔽劑、代謝法等只能去除蜜柚果汁的部 分苦味，不能實(shí)現(xiàn)完全脫苦；雖然用吸附法可實(shí)現(xiàn)完全脫苦，但該法在吸附去除苦味成分的 同時(shí)，也吸附去除蜜柚中的許多營(yíng)養(yǎng)成分，極大地降低了蜜柚果汁的商品價(jià)值。很多研究涉 及了酶法脫苦蜜柚果汁，但由于目前所報(bào)導(dǎo)的研究成果沒(méi)有發(fā)酵獲得檸堿酶及諾米林酶， 雖然獲得了柚苷酶的高產(chǎn)，但由于蜜柚中含有多種苦味物質(zhì)，用柚苷酶處理后，蜜柚果汁仍 然具有非常嚴(yán)重的苦味，不能用于生產(chǎn)果汁、果酒等產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可完全去除果汁苦味、工藝簡(jiǎn)單的蜜柚果汁脫苦酶的 發(fā)酵生產(chǎn)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)解決方案是⑴蜜柚苦味物質(zhì)的提??；⑵ 以蜜柚苦味物質(zhì)為唯一碳源配制培養(yǎng)基；(3)接種黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蜜柚果汁脫苦酶；(4)提
3取蜜柚果汁脫苦酶；(5)酶法分解蜜柚果汁中的苦味物質(zhì)；(6)濃縮制備獲得濃縮果汁。本發(fā)明是一種蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，它包括上述步驟(1)_(4)步驟(1)的蜜柚苦味物質(zhì)的提取是以蜜柚囊衣為材料，在80-100°C的條件烘干、 粉碎過(guò)80目篩、加入20倍(體積/質(zhì)量)丙酮，10-60°C浸提5-85h，真空濃縮得到干品。步驟⑵培養(yǎng)基的組分和含量為培養(yǎng)基的配方為蜜柚苦味物質(zhì)2-40g/L， MgSO4 0. 2-lg/L, KH2PO4 0. 5_2g/L，CaCl2 0. 05-0. 15g/L, (NH4)2SO4 2—lOg/L，ZnSO4 · 7H20 0. 02-0. lg/L，酵母膏0. 5-4g/L，豆餅粉0. 5_8g/L，曲拉通0. 1-0. 5g/L。按發(fā)酵體積稱取各 培養(yǎng)基成分，加水溶解后滅菌備用。步驟(3)蜜柚果汁脫苦酶采用的菌種為黑曲霉，菌種是以斜面孢子作為起始接種 物，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至所需要的體積，菌種培養(yǎng)基為蜜柚苦味物質(zhì)2g/L，MgSO4 0. 2g/L，KH2PO4 0. 5g/L, CaCl2 0.03g/L，酵母膏4g/L，豆餅粉5g/L。將菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度 28-34°C、pH值為6.0士 1、溶氧30士 10%的條件下發(fā)酵8-lld。本發(fā)明的黑曲霉是從平和縣 爛柚子堆集點(diǎn)采集土壤樣品，用特殊的方法(以柚皮苷為唯一碳源)分離得到的能產(chǎn)生柚 苷酶、檸堿酶、諾米林酶等多種脫苦酶的黑曲霉菌株。步驟(4)脫苦酶的提取過(guò)程是分別收集發(fā)酵液和菌體，將菌體破碎后和發(fā)酵液合 并，先用超濾法去除小分子及大顆料，收集20-130kDa的活性組分用Q-瓊脂糖凝膠分離，收 集NaCl濃度范圍為0. 15-0. 3之間的活力組分，再次進(jìn)行超濾濃縮，可同時(shí)純化多個(gè)酶活力 組分。本發(fā)明還提供了一種蜜柚果汁脫苦的方法，步驟(5)酶法分解蜜柚果汁中的苦味 物質(zhì)條件為溫度為20-45°C，加酶量為10U/mL蜜柚果汁(以酶液中柚苷酶活力計(jì))。有益效果采用上述技術(shù)方案后，同時(shí)可發(fā)酵生產(chǎn)得到包括柚苷酶、檸堿酶和諾米林酶等活 性的蜜柚果汁脫苦酶，其中，柚苷酶的活力可達(dá)1400U/ml，檸堿酶的活力可達(dá)140U/ml，諾 米林酶活力可達(dá)52U/ml。酶的純化得率超過(guò)65%，純化倍數(shù)為16.2倍。蜜柚果汁經(jīng)過(guò)處 理后，主要苦味物質(zhì)的去除率都超過(guò)了 90%，脫苦后的蜜柚原果汁沒(méi)有苦味。相比同類相關(guān)研究，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)(1)針對(duì)蜜柚果汁中含有多種苦 味成分，用單一的脫苦酶(如柚苷酶、檸堿酶、諾米林酶)不能完全去除蜜柚的苦味，本發(fā)明 生產(chǎn)復(fù)合脫苦酶對(duì)蜜柚果汁進(jìn)行脫苦；(2)針對(duì)脫苦酶大部分都是誘導(dǎo)酶，且受到碳源分 解代謝調(diào)節(jié)，本發(fā)明用蜜柚的苦味物質(zhì)為唯一碳源培養(yǎng)黑曲霉，解除碳源分解代謝調(diào)節(jié)，經(jīng) 過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，發(fā)酵獲得了柚苷酶、檸堿酶及諾米林酶等多種脫苦酶；(3)同時(shí)對(duì)發(fā)酵液 及菌體中的脫苦酶進(jìn)行處理，脫苦酶的活性組分更完全，用超濾及離子交換純化脫苦酶，操 作簡(jiǎn)便，還可同時(shí)純化得到多個(gè)酶活力組分；(4)用酶處理完全去除了蜜柚果汁的苦味，不 需要再應(yīng)用樹(shù)脂吸附、環(huán)糊精包埋、苦味物質(zhì)掩蔽劑等技術(shù)去除蜜柚果汁的苦味，不影 響產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味、技術(shù)的應(yīng)用性廣，不僅可用于生產(chǎn)適用于不同用途的蜜柚果汁產(chǎn)品， 還可用于對(duì)蜜柚果皮及果渣進(jìn)行脫苦處理(參見(jiàn)表1、表2)。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式一、蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法
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1、方法本發(fā)明是一種蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，它包括以下步驟(1)蜜柚苦味 物質(zhì)的提??；(2)以蜜柚苦味物質(zhì)為唯一碳源配制培養(yǎng)基；(3)接種黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蜜柚果 汁脫苦酶將菌種接至初始培養(yǎng)基中，在溶氧為20-40%，pH為5-6，溫度為28-34°C的條件 下培養(yǎng)，定期檢測(cè)酶活力，發(fā)酵8-lld，當(dāng)柚苷酶活力達(dá)到1200U/mL以上就可放罐；(4)提 取蜜柚果汁脫苦酶離心收集菌體，在10°C以下用超聲波破碎細(xì)胞，將細(xì)胞破壁液與發(fā)酵 液合并，先用超濾法截留20-130kDa的活性組，再用Q-瓊脂糖凝膠分離，收集NaCl濃度為 0. 15-0. 3mol/L的活性組分，再經(jīng)超濾濃縮就得到了具有多種酶活性的脫苦酶液；(5)酶法 分解蜜柚果汁中的苦味物質(zhì)，條件為溫度為20-45°C，加酶量為10U/mL蜜柚果汁(以酶液中 柚苷酶活力計(jì))；(6)濃縮制備獲得濃縮果汁。2、在本實(shí)施例中，培養(yǎng)基及其制備方法實(shí)施例1 培養(yǎng)基的組分和含量為蜜柚苦味物質(zhì)40g/L，MgSO4I g/L, KH2PO4 2g/L, CaCl2 0. 15g/L，(NH4)2SO4 10g/L，ZnSO4 · 7H20 0. lg/L，酵母膏 4g/L，豆餅粉 8g/L，曲拉通 0. 5g/L。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基各成分量的計(jì)算方法以配制IOm3發(fā)酵培養(yǎng)基為例，蜜 柚苦味物質(zhì)=40g/LX1000L/m3X10m3+1000g/kg = 400kg, MgSO4 = lg/LX1000L/ m3X 10m3+ 1000g/kg = 10kg, KH2PO4 = 2g/LX 1000L/m3X IOm3+lOOOg/kg = 20kg, CaCl2 = 0. 15g/LX 1000L/m3X10m3+1000g/kg = 1.5kg，(NH4)2SO4 = 10g/LX1000L/ m3X 10m3+1000g/kg = 100kg, ZnSO4 · 7H20 = 0. lg/LX 1000L/m3X IOOm3+lOOOg/kg =lkg,酵母膏=4g/LX1000L/m3X10m3+1000g/kg = 10kg,豆餅粉=8g/LX1000L/ m3X IOm3+1000g/kg = 80kg，曲拉通 0. 5g/LX 1000L/m3X IOm3+lOOOg/kg = 5kg，水=IOm30培養(yǎng)基的制備方法按照發(fā)酵液的總體積及配方計(jì)算各培養(yǎng)基成分的用量，先將 各培養(yǎng)基成分稱好，加入適量水溶解混合均勻，調(diào)PH至6. 0，用泵打入發(fā)酵罐，加水至10m3， 滅菌、冷卻就制得發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例2 蜜柚苦味物質(zhì)2g/L，MgSO4 0. 2g/L，KH2PO4 0. 5g/L，CaCl2 0. 05g/L，(NH4)2SO4 2g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 02g/L，酵母膏 0. 5g/L，豆餅粉 0. 5g/L，曲拉通 0. 1-0. 5g/L。培養(yǎng)基的配 制、發(fā)酵過(guò)程控制及酶的提取與實(shí)例1相同。實(shí)施例3 蜜柚苦味物質(zhì)21g/L，MgSO4 0. 6g/L, KH2PO4 1. 25g/L, CaCl2 0. lg/L, (NH4)2SO4 6g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 06g/L,酵母膏2. 25g/L，豆餅粉4. 25g/L，曲拉通0. 3g/L。培養(yǎng)基的配制、 發(fā)酵過(guò)程控制及酶的提取與實(shí)例1相同。實(shí)施例4 蜜柚苦味物質(zhì)25g/L，MgSO4 0. 4g/L, KH2PO4 lg/L, CaCl2 0. lg/L, (NH4)2SO4 5g/L， ZnSO4 · 7H20 0. 4g/L，酵母膏 3g/L，豆餅粉 8g/L，曲拉通 0. 2g/L。培養(yǎng)基的配制、發(fā)酵過(guò)程控制及酶的提取與實(shí)例1相同。3、原理本發(fā)明利用蜜柚的苦味物質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉，誘導(dǎo)產(chǎn)生具有多種酶活性的脫苦酶，分 離純化這些脫苦酶，對(duì)蜜柚果汁的苦味進(jìn)行特異性的分解，從而去除其苦味。
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工藝所采用的菌種為黑曲霉，其主要內(nèi)容包括(1)蜜柚苦味物質(zhì)的提??；(2)培 養(yǎng)基的配制；(3)菌種的制備；(3)發(fā)酵產(chǎn)生蜜柚果汁脫苦酶；(4)提取蜜柚果汁脫苦酶； (5)果汁的酶法脫苦；培養(yǎng)基的使用。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵蜜柚果汁脫苦酶的方法，主要特點(diǎn)在于特殊的培養(yǎng)基及酶 的提取方法，概括為以下幾個(gè)方面。(1)從囊衣中提取苦味物質(zhì)，苦味物質(zhì)含量，提取工藝 簡(jiǎn)單；(2)以蜜柚提取的苦味物質(zhì)為唯一碳源，其組成及重量份為蜜柚苦味物質(zhì)2-40g/L， MgSO4 0. 2-lg/L, KH2PO4 0. 5_2g/L，CaCl2 0. 05-0. 15g/L, (NH4)2SO4 2—lOg/L，ZnSO4 · 7H20 0. 02-0. lg/L，酵母膏0. 5-4g/L，豆餅粉0. 5_8g/L，曲拉通0. 1-0. 5g/L，其余成分為水，pH 6. 0 ； (3)采用黑曲霉為菌種，安全性高，酶種類豐富；(4)發(fā)酵時(shí)間為8-llh，有利于黑曲霉 誘導(dǎo)產(chǎn)生多種脫苦酶；(5)用超濾法及離子交換法分離純化酶，收集20-130kDa的活性組分 用Q-瓊脂糖凝膠分離，用集NaCl濃度范圍為0. 15-0. 3之間的活力組分，再次進(jìn)行超濾濃 縮，可同時(shí)純化多個(gè)酶活力組分。二、應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)的蜜柚果汁的酶法脫苦方法實(shí)例1 蜜柚果汁經(jīng)過(guò)100°C煮沸5min，在果汁自然pH，溫度為60°C，加酶量為300U/mL 果汁和條件酶解時(shí)間為0. 5h，，真空濃縮至總糖度66%，制成濃縮果汁冷藏，其中柚皮苷含 量低于150mg/L，檸堿含量低于30mg/L，諾米林含量低于2g/L，稀釋至原果汁后感覺(jué)不到苦 味。實(shí)例2 蜜柚果汁不煮沸，加入酶，在自然pH值、溫度20°C、，加酶量為10U/mL果汁的條件 酶解2h，煮沸滅酶后，其柚皮苷的濃度小于10mg/L，檸堿小于lmg/L，諾米林未檢出，果汁無(wú) 苦味，可直接用于配制蜜柚果汁飲料或真空濃縮至總糖度66%以上，制成濃縮果汁冷藏。實(shí)例3 蜜柚果汁煮沸5min，在果汁自然pH、溫度為40°C、加酶量為155U/mL果汁的條件下 酶解1. 25h，煮沸滅酶后，真空濃縮至糖度66%以上，其中柚皮苷的濃度小于170mg/L，檸堿 小于35mg/L，諾米林小于4mg/L，稀釋到原果汁的糖度(14% )時(shí)無(wú)苦味，可用于提供給飲料 企業(yè)生產(chǎn)各類蜜柚果汁飲料產(chǎn)品。實(shí)例4 蜜柚果汁煮沸5min，在果汁自然pH、溫度20°C、加酶量20U/mL果汁的條件下酶解 0. 8h，煮沸滅酶后，真空濃縮至糖度66%以上，其中柚皮苷的濃度小于130mg/L，檸堿小于 15mg/L，諾米林未檢出，濃縮果汁無(wú)苦味，可用于提供給飲料企業(yè)生產(chǎn)各類蜜柚果汁飲料產(chǎn)
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ΡΠ O表1脫苦酶的各酶活力純化倍數(shù)及回收率
6 表2脫苦前后苦味物成質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分變化
權(quán)利要求
一種蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于它包括以下步驟(1)用丙酮從蜜柚囊衣中提取蜜柚苦味物質(zhì)；(2)以蜜柚苦味物質(zhì)為唯一碳源配制培養(yǎng)基；(3)接種黑曲霉發(fā)酵8 11d，產(chǎn)生蜜柚果汁脫苦酶；(4)同時(shí)提取菌體及發(fā)酵液中脫苦酶，獲得了脫苦酶的各種活性組分；(5)酶法分解蜜柚果汁中的苦味物質(zhì)；(6)濃縮制備獲得濃縮果汁。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(1) 的蜜柚苦味物質(zhì)的提取是以蜜柚囊衣為材料，經(jīng)過(guò)干燥、粉碎、脫脂、丙酮浸提、減壓濃縮而 得到的含有柚皮苷、檸堿、諾米林等多種苦味成分在內(nèi)的粗提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)2所述的蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的丙 酮浸提為囊衣粉用20倍(體積/質(zhì)量)丙酮于10-60°C浸提5-85h，真空濃縮提所得到的 提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2) 培養(yǎng)基的組分和含量為該培養(yǎng)基的配方為蜜柚苦味物質(zhì)2-40g/L，MgSO4 0. 2-lg/L， KH2PO4 0. 5-2g/L, CaCl2 0.05-0. 15g/L, (NH4)2SO4 2-lOg/L，ZnSO4 · 7H20 0.02-0. lg/L，酵母 膏0. 5-4g/L，豆餅粉0. 5-8g/L，曲拉通0. 1-0. 5g/L，其余成分為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(3) 蜜柚果汁脫苦酶發(fā)酵采用的黑曲霉，黑曲霉的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵溫度為28-34°C，培養(yǎng)pH值 為6.0士 1，溶氧為30士 10%，發(fā)酵時(shí)間為8-lld。
6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟 (4)脫苦酶的提取是先收集菌體，用超聲波法在破碎菌體后與發(fā)酵液合并，再用超濾法濃 縮，收集20-130kDa的活性組分用Q-瓊脂糖凝膠分離，用集NaCl濃度范圍為0. 15-0. 3之 間的活力組分，再次進(jìn)行超濾濃縮，得到的脫苦酶有4個(gè)蛋白質(zhì)組分，其分子量分別為120、 95、55、25kDa。
7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(5) 酶法分解蜜柚果汁中的苦味物質(zhì)條件為溫度為20-45°C，加酶量為10U/mL蜜柚果汁。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蜜柚果汁脫苦酶的發(fā)酵生產(chǎn)及使用方法，其主要技術(shù)流程包括蜜柚苦味物質(zhì)的提取→以蜜柚苦味物質(zhì)為唯一碳源配制培養(yǎng)基→接種黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蜜柚果汁脫苦酶→提取蜜柚果汁脫苦酶→酶法水解解蜜柚果汁中的苦味物質(zhì)→濃縮制備獲得濃縮果汁。利用本發(fā)明發(fā)酵的蜜柚果汁脫苦酶包括柚苷酶、檸堿酶和諾米林酶等多種酶系，可特異性地分解蜜柚果汁的苦味物質(zhì)，用其對(duì)蜜柚果汁進(jìn)行脫苦，可得苦味完全去除的蜜柚果汁。本方法不影響產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味、技術(shù)的應(yīng)用性廣，不僅可用于生產(chǎn)適用于不同用途的蜜柚果汁產(chǎn)品，還可用于對(duì)蜜柚果皮及果渣進(jìn)行脫苦處理。
文檔編號(hào)C12R1/685GK101897452SQ201010219099
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者伍菱, 倪輝, 曾琪, 李麗君, 楊秋明, 楊遠(yuǎn)帆, 肖安風(fēng), 胡陽(yáng), 蔡慧農(nóng) 申請(qǐng)人:集美大學(xué)