專利名稱：一種茶樹乳酸脫氫酶基因Cam-LDH及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶樹乳酸脫氫酶基因Cam-LDH以及該基因編碼的LDH蛋白，屬于 基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸脫氫酶是以NAD+為輔酶，催化生物體內(nèi)糖代謝過程中乳酸和丙酮酸之間可逆反應(yīng)的一組同工酶，廣泛分布在微生物、動(dòng)植物細(xì)胞中，并具有組織器官特異性。LDH同時(shí)催化乳酸的脫氫反應(yīng)及其逆反應(yīng)，而這兩步反應(yīng)是NAD+和NADH循環(huán)的重要步驟，保證了糖酵解等生理過程的順利進(jìn)行。乳酸脫氫酶分別由LDHA和LDHB兩種基因編碼，有LDH1, LDH2, LDH3、LDH4、LDH5* 5種同工酶形式，此外在動(dòng)物的睪丸和精子中還特異的存在LDHC基因編碼的蛋白。同工酶是同一種或?qū)僦?，由不同基因位點(diǎn)或等位基因編碼的多肽鏈單體，呈純聚體或雜聚體，它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生理功能有所不同，但催化功能相同的多態(tài)性酶類。同工酶廣泛存在于生物界中，現(xiàn)已有60多種動(dòng)、植物體內(nèi)的同工酶被研究報(bào)道。同工酶的特點(diǎn)是具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，既可作為生理指標(biāo)，又是可靠的遺傳標(biāo)志。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)在厭氧條件下能夠催化丙酮酸接受 NADH上的氫，生產(chǎn)乳酸；當(dāng)動(dòng)物體缺乏葡萄糖時(shí)，還可以氧化乳酸生成丙酮酸并經(jīng)葡萄糖異生途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。乳酸作為乳酸脫氫酶的產(chǎn)物具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。乳酸及其鹽類和衍生物可以用于食品、釀造、皮革、卷煙、化工和印染等工業(yè)。尤其近年來，利用乳酸聚合生產(chǎn)生物可降解塑料、綠色包裝材料及農(nóng)用薄膜，來解決日益嚴(yán)重的環(huán)境問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)問題是提供茶樹(龍井43)乳酸脫氫酶全長(zhǎng)序列，并完成了該基因編碼區(qū)的全序列分析。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下提取一種茶樹(龍井43)谷氨酸脫氫酶基因Cam-LDH的總cDNA，通過設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物L(fēng)DH-5和LDH-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其主要特點(diǎn)是上游引物L(fēng)DH-5，其基因型為GAAAAAAACTTAGAGAGAGAAGAAA ；下游引物L(fēng)DH-3，其基因型為TCAAACACCCAACTGGTTTTGCACC ；茶樹谷氨酸脫氫酶基因Cam-LDH的總cDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)變性3min ；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸1. 5min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸 IOmin ；4°C保存。將PCR擴(kuò)增之后的產(chǎn)物經(jīng)過載體連接和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并通過引物M13-47/ RV-M進(jìn)行菌液PCR以驗(yàn)證陽性克隆，最終得到谷氨酸脫氫酶基因Cam-LDH。菌落PCR反應(yīng)的條件為95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸 lmin，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin ；4°C保存。
該基因全長(zhǎng)1300bp，包含一個(gè)ATG起始密碼子和TAG終止密碼子以及24bp的 PolyA尾巴，84bp長(zhǎng)的5'非編碼區(qū)和163bp長(zhǎng)的3 ‘非編碼區(qū)，編碼一個(gè)含有350個(gè)氨基殘基的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)問題是提供以Cam-LDH基因全序列編碼的蘋果酸脫氫酶LDH蛋白。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下通過設(shè)計(jì)引物L(fēng)DH-Fl和LDH-F2實(shí)現(xiàn)pET28b_LDH重組質(zhì)粒的構(gòu)建。其中引物 LDH-Fl 基因型為CATGCCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT，引物 LDH-F2 基因型為CTGTGATTCTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC，以實(shí)施例一中Cam-LDH基因全序列為模板，PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸IminlOs，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C 終止延伸IOmin ;4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過載體雙酶切和陽性克隆后獲得由茶樹LDH基因編碼的表達(dá)質(zhì)粒pET28b-LDH。將pET28b_LDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過液體培養(yǎng)基培養(yǎng)之后得到菌液。取Iml菌液接種于50ml的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)并加入0. 5mM 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)；將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌液離心收集菌體和超聲波破碎后在沉淀中發(fā)現(xiàn)帶有His標(biāo)簽的LDH蛋白(圖4)。本發(fā)明的有益效果是茶樹[Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze]屬于山茶科山茶屬，為多年生常綠木本植物。茶葉是世界上最流行的無酒精飲品之一，具有許多生理保健作用。在包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家，茶樹是重要的木本經(jīng)濟(jì)作物之一。它含有許多有重要價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物如黃酮類、生物堿類、多酚類化合物等，其中以多酚類化合物中的兒茶素對(duì)于人體健康效果最為突出，它不僅具有防治腫瘤的效果，而且對(duì)增強(qiáng)微血管強(qiáng)韌性，降低血糖、血脂、血壓，預(yù)防肝臟及冠狀動(dòng)脈硬化都有明顯療效。迄今為止，尚無茶樹(龍井43) 完整LDH基因克隆報(bào)告。


圖ICam-LDH基因的PCR擴(kuò)增M =Marker DL2000 ； 1 基因的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物圖2Cam-LDH基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的擴(kuò)增M =Marker DL2000 ；1 蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3重組質(zhì)粒的雙酶切檢測(cè)M =Marker DL2000 ；1 雙酶切的重組質(zhì)粒pET28b_LDH 雙酶切的后的LDH ；3 雙酶切后的pET28b質(zhì)粒圖4pET28b_LDH的蛋白質(zhì)電泳圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一茶葉總RNA的提取與cDNA的獲得。
采用植物總RNA純化試劑盒(MACHEREY-NAGEL公司)提取茶樹(龍井43)總RNA， 將提取出的茶樹總RNA采用Reverse Transcription System試劑盒(Promega公司)獲得總cDNA，并將總cDNA于_20°C保存。實(shí)施例二 乳酸脫氫酶全序列的獲得。設(shè)計(jì)上下游引物L(fēng)DH-5和LDH-3 LDH-5 序列GAAAAAAACTTAGAGAGAGAAGAAA，LDH-3 序列TCAAACACCCAACTGGTTTTGCACC，以茶樹總cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C，3min預(yù)變性；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。1 %瓊脂糖凝膠電泳分離 PCR產(chǎn)物，AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD19_T載體 (TaKaRa公司生產(chǎn))上，16°C連接過夜，把連接液轉(zhuǎn)移到大腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，倒LB固體培養(yǎng)基(含Amp)并在其表面均勻涂布40 μ 15-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷和7 μ 1異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，12h培養(yǎng)后，挑取白斑，將白斑放在LB (含Amp) 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用PMD19-T載體試劑中的引物M13-47/RV-M，進(jìn)行菌液PCR(菌落PCR條件為95°C，3min 預(yù)變性；95°C 30s, 55°C 45s, 72°C Imin 反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ； 4°C保存)驗(yàn)證陽性克隆，得到Cam-LDH基因，送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。序列分析該基因全長(zhǎng)1300bp，包含一個(gè)ATG起始密碼子和TAG終止密碼子以及24bp的 PolyA尾巴，84bp長(zhǎng)的5'非編碼區(qū)和163bp長(zhǎng)的3 ‘非編碼區(qū)，編碼一個(gè)含有350個(gè)氨基殘基的蛋白質(zhì)。用 Protparam (http //au. expasy. org/tools/protparam. html)預(yù)SllJ茶豐對(duì) LDH 蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白分子式為C1688H2713N4670506S5，相對(duì)分子質(zhì)量為37. 806kD, 等電點(diǎn)PI為6. 37 ；理論推導(dǎo)半衰期大約為30h，不穩(wěn)定參數(shù)為35. 98，屬于穩(wěn)定蛋白(超過40認(rèn)為蛋白質(zhì)不穩(wěn)定)。該蛋白中含量比較多的氨基酸是Leu(39個(gè)，11. )、Ala(32 個(gè)，9. )、Ser (32個(gè)，9. 1 ，該蛋白中含量比較少的氨基酸是Met (4個(gè)，1. 1% ),Trp(3 個(gè)，0.9% )、Cys(l個(gè)，0.3% )。總的帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)為34，帶正電荷的殘基 (Arg+Lys)為 31。脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為 106. 97。親水性平均數(shù)(GRAVY)為 0. 057， 預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)。實(shí)施例三1、pET28b-LDH重組質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物L(fēng)DH-Fl :CATGCCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT ；LDH-F2 CTGTGATTCTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC,下劃線分別為 Nco I 和 Xho I 酶切位點(diǎn)。以實(shí)施例1中Cam-LDH基因全序列為模板，PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，反應(yīng)條件為95°C，3min 預(yù)變性；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C IminlOs 反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ； 4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)與載體pET28b采用Nco I和Xho I雙酶切4小時(shí)候，連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，倒LB平板，篩選陽性克隆，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET28b_LDH。采用Nco I和Xho I雙酶切鑒定后(圖3)，送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1結(jié)果一致，擴(kuò)增的序列確為茶樹LDH編碼基因。
2、乳酸脫氫酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將pET28b_LDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于含5 ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C，225rpm，培養(yǎng)12小時(shí)，得到菌液。取Iml菌液接種于50ml的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C，225rpm,振蕩培養(yǎng)至 0D600為0. 4-1. O時(shí)(最好0. 6)；加入0. 5mM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，20°C誘導(dǎo)表達(dá)16h ；將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌液于4°C，5，OOOrpm,離心5min，收集菌體，超聲波破碎，在沉淀中發(fā)現(xiàn)帶有His標(biāo)簽的LDH蛋白(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH蛋白，其特征在于，該基因全長(zhǎng)1300bp，包含一個(gè)ATG起始密碼子和TAG終止密碼子以及24bp的polyA尾巴，84bp長(zhǎng)的5'非編碼區(qū)和163bp長(zhǎng)的3'非編碼區(qū)，編碼一個(gè)含有350個(gè)氨基殘基的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，所述茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH是PCR擴(kuò)增之后的產(chǎn)物經(jīng)過載體連接和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并通過引物M13-47/RV-M進(jìn)行菌液PCR以驗(yàn)證陽性克隆所獲得。
3.如權(quán)利要求2所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增通過設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物L(fēng)DH-5和LDH-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 其擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸1. 5min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin ；4°C保存。
4.如權(quán)利要求2所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，所述菌落PCR反應(yīng)的條件為95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s，55°C退火 45s，72°C延伸lmin，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin ；4°C保存。
5.如權(quán)利要求3所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，上游引物 LDH-5，其基因型為GAAAAAAACTTAGAGAGAGAAGAAA ；下游引物 LDH-3，其基因型為TCAAACACCCAACTGGTTTTGCACC ；
6.如權(quán)利要求1所述的由茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH編碼的蘋果酸脫氫酶LDH蛋白，其特征在于，該蛋白由茶樹LDH基因編碼的表達(dá)質(zhì)粒pET28b-LDH經(jīng)過液體培養(yǎng)基培養(yǎng)之后得到菌液，再經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)；將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌液離心收集菌體和超聲波破碎后在沉淀中獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，所述蛋白由茶樹LDH基因編碼的表達(dá)質(zhì)粒pET28b-LDH通過設(shè)計(jì)引物 LDH-Fl和LDH-F2以Cam-LDH基因全序列為模板，PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過載體雙酶切和陽性克隆后獲得。
8.如權(quán)利要求7所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，引物 LDH-Fl 基因型為CATGCCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT，引物 LDH-F2 基因型為CTGTGATTCTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC，
9.如權(quán)利要求7所述的茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH及其編碼的蘋果酸脫氫酶LDH 蛋白，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 0C預(yù)變性3min ；95 °C變性30s，55 °C退火 30s，72°C延伸IminlOs，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin ；4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自于茶樹乳酸脫氫酶新基因Cam-LDH(GenBank登錄號(hào)為HM114228)，表達(dá)蛋白為乳酸脫氫酶。本發(fā)明過程主要包括以下步驟(1)該基因保守區(qū)域的獲得設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，從茶樹中擴(kuò)增出中間保守片段；(2)RACE擴(kuò)增兩端區(qū)域利用巢式PCR，根據(jù)已經(jīng)獲得的保守片段的序列，擴(kuò)增獲得兩端序列；(3)全序列拼接；(4)全序列分析該基因共1300bp，編碼產(chǎn)生一個(gè)350個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的是為乳酸脫氫酶的生物學(xué)研究以及其催化產(chǎn)物乳酸的工業(yè)應(yīng)用提供服務(wù)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102311962SQ201010220658
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者宣守芹, 曹正宇, 朱國(guó)萍, 王寶娟, 王暉, 王鵬, 翟羽佳, 陳露露 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)