專利名稱：菌血癥檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床微生物鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定血液樣本病原菌的 試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)成人和兒童菌血癥都是高發(fā)病率和死亡率疾病。每年世界范圍內(nèi)菌血 癥病例有2千萬，即使在發(fā)達國家醫(yī)療實踐中，菌血癥仍然具有很大的挑戰(zhàn)，特別是新生兒 監(jiān)護病房、移植病房，住院病人、免疫抑制和術(shù)后病人、血液病患者等因病原體不能鑒定而 應(yīng)用廣譜抗生素或不適當抗生素治療導(dǎo)致治療延誤的死亡率極高，歐洲每年有135000例 死亡，美國有215000例。為達到較好的治療效果，針對性的抗生素應(yīng)在癥狀發(fā)生6小時內(nèi) 使用。細菌早期鑒定對免疫抑制病人尤為重要，他們較一般患者感染細菌的范圍更廣，更難 以預(yù)知，這樣的選擇主要取決于治病因素一細菌的鑒定，藥敏試驗確證。當鑒定結(jié)果是陰 性，提示臨床醫(yī)生可能是非常見條件致病菌存在。對非培養(yǎng)快速檢測技術(shù)頗有微詞的是不 能提供藥敏結(jié)果，雖然耐藥基因研究已有很大進展，并且能提供更符合體內(nèi)耐藥情況的結(jié) 論，但仍有很多機制不明，特別是泛耐藥情況還難以通過基因手段進行完全解決。然而，每 一地區(qū)流行菌原菌的藥敏情況大多可以通過過去的經(jīng)驗預(yù)知，特別是在一些教學(xué)醫(yī)院，每 月的院感報告可以提供流行病原菌的藥敏信息，這些信息通常為菌血癥患者提供指導(dǎo)治療 方案。因此，快速鑒定病原菌從而盡早開始針對性治療，可以大大改善臨床治療效果。菌血癥病原體診斷的金標準是血培養(yǎng)，獲得陽性結(jié)果需要1-3天，此外，陽性標本 還需要1-2天的細菌鑒定和藥敏試驗，需要特殊培養(yǎng)基的細菌要獲得陽性結(jié)果則需要更長 時間。因血量不足，血液中抗生素的存在及需要特殊營養(yǎng)等條件的限制而導(dǎo)致的敏感性低 也是傳統(tǒng)培養(yǎng)的一個限制因素。此外，傳統(tǒng)的鑒定方法在獲得陽性結(jié)果后還要進行革蘭氏 染色，生化反應(yīng)鑒定等，而這其中有很多潛在的問題①低特異性病原體需要加做試驗；② 往往要多個生化試驗同時進行；③生化鑒定前要分離純化，至少需要1-3天；④表型試驗不 能重復(fù)。因此迫切需要新的更快更精確的細菌鑒定方法?；蛐酒夹g(shù)雖然能夠同時進 行多種細菌的同時鑒定，但涵蓋菌種仍然十分有限，對非常見菌、突變或新菌種更是無能為 力，就目前技術(shù)而言其成本太高也是重要制約因素，雜交方式固有的局限性必然也影響其 特異性。近年來，質(zhì)譜技術(shù)以其快速準確的優(yōu)點被用于微生物鑒定，但質(zhì)譜鑒定必須是培養(yǎng) 后分純的單克隆菌落，加之設(shè)備昂貴，技術(shù)操作難度高等限制了其應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)直接 從臨床樣本中檢測致病菌，與培養(yǎng)相比有很多優(yōu)點，然而，即使PCR擴增技術(shù)早已經(jīng)被廣泛 應(yīng)用于病毒檢測，但由于成本，設(shè)備、不同DNA抽提效率差異，潛在的產(chǎn)物污染等問題，PCR 技術(shù)進行血液細菌鑒定僅限于研究，特別是當檢測多種病原體時更是一個巨大的挑戰(zhàn)。在實際工作中，很短的一段保守/特異序列的測定就可滿足對分子診斷的需要。 由于16SrRNA在所有的細菌中都以多拷貝形式存在，并且包含高度保守和可變區(qū)域，能夠 同時滿足擴增和進行比較的要求，因此以16SrRNA序列分析為基礎(chǔ)，采取毒力和毒素基因鑒定方法，能夠直接使用臨床標本，在最短的時間內(nèi)鑒定未知或不可培養(yǎng)的細菌，對細菌性 新發(fā)傳染病做出準確判定。焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進行 電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反 應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模 板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi)。PPi可 最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入 的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準確地進行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于 構(gòu)建標準化操作流程，因此廣受研究者青睞，并在很多方面已應(yīng)用于臨床微生物的分型鑒 定及耐藥檢測。Monstein等(2001)用焦磷酸測序技術(shù)檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因16S rDNA的Vl和V3區(qū)序列，將胃鏡活檢標本中得到的23個幽門螺桿菌標本依據(jù)其Vl區(qū)的核 苷酸序列差異，鑒定出8種不同的等位基因類型，除11個樣本與幽門螺桿菌26695株序列 一致、1個樣本與199株的序列一致外，根據(jù)Vl區(qū)的改變表現(xiàn)為有1個或2個核苷酸的突 變或單個核苷酸的插入而分為4個等位基因類型。另有2個標本的V3區(qū)出現(xiàn)C至T轉(zhuǎn)換， 證明此技術(shù)可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型。Urmer stad等 (2001)利用焦磷 酸測序技術(shù)對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，根據(jù)inIB基因第 1575位和1578位核苷酸的變化，將血清型l/2a和l/2c分為一組，l/2b和3b分為一組，而 血清型4b又可分為2個組。該技術(shù)還被應(yīng)用于百日咳桿菌(Bordetella pert ussis)與 副百日咳桿菌(Parapert ussis)等細菌的快速鑒定及分型(Ronaghi等，1999)。Martin等 (2006)運用此技術(shù)對百日咳桿菌毒力相關(guān)ptxSl基因進行了分型鑒定，并與定量PCR作了 方法學(xué)的比較，結(jié)果顯示兩種方法具有很好的一致性，焦磷酸測序技術(shù)適合百日咳桿菌的 大規(guī)模篩選。此外，Alistair等(2003)用焦磷酸測序技術(shù)檢測腸球菌的23s rRNA上的抗 利奈唑胺位點，并與PCR-RFLP方法比較，結(jié)果顯示了 100%的一致性。Marjo等(2005)用焦 磷酸測序技術(shù)檢測鳥分支桿菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，空腸彎曲桿菌，流感(嗜血)桿菌 等多種病原體的23S rRNA基因2058位多態(tài)性，以獲得病原體的大環(huán)內(nèi)脂抗藥性信息。趙 錦榮等(2005)建立了基于焦磷酸測序技術(shù)的高通量檢測耐利福平結(jié)核分支桿菌的方法， 并用傳統(tǒng)的測序方法進行驗證，結(jié)果顯示了 100%—致性，他們認為這種方法具有自動化程 度高和結(jié)果準確等特點，相比傳統(tǒng)的測序，具有更快速，簡便等特點，適用于耐利福平結(jié)核 分支桿菌的快速高通量的檢測。本研究通過設(shè)計軟件對常見臨床細菌測序引物隨后25bp的序列進行了排列組 合，產(chǎn)生了多重不同細菌感染的焦磷酸測序虛擬模式數(shù)據(jù)庫，血培養(yǎng)陽性樣品經(jīng)DNA抽提、 通用引物擴增，然后用通用引物作為測序引物，測序結(jié)果與焦磷酸測序虛擬模式數(shù)據(jù)庫比 對判斷型別。該方法能一次測序區(qū)分常見臨床細菌及不同細菌的混合感染，可用于細菌感 染的臨床診斷及耐藥監(jiān)測。采用的空白對照可以在型別判斷中有效扣除可能發(fā)生的污染， 解決了高的靈敏度必然帶來難以控制的污染難題。快速可靠鑒定血液中細菌種屬的重要意 義在于①合理應(yīng)用抗生素，避免無效用藥；②改善預(yù)后；③減緩獲得耐藥；④減少醫(yī)療費 用。不合適抗生素應(yīng)用常常導(dǎo)致治療失敗，而使住院期延長，并發(fā)癥，耐藥以及檢驗費用增 加等后果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速可靠的菌血癥檢測試劑盒。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述試劑盒的檢測方法。為解決上述技 術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種菌血癥檢測試劑盒，它包括(1)擴增細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 和SEQ ID NO 2所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO :1在其5，端標記生物素；在一次檢測中共同使用。上述菌血癥檢測試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取試劑核酸純化柱，Buffer Li, Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, Buffer TE ；(2)反應(yīng)液PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO :1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為0. 1 % (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02 % (ν/ν)明膠，0.06% g/mL BSA,0. 1% (ν/ν) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9Tricine。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH，IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate 溶液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；其中，結(jié)合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火緩沖液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂。(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，熒光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一種菌血癥檢測試劑盒，它包括上述的所有核苷酸序列的堿基互補序列，也就是 包括(1)擴增細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3 和SEQ ID NO 4所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO 3在其5，端標記生物素；在一次檢測中共同使用。上述菌血癥檢測試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取試劑核酸純化柱，Buffer Li, Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, Buffer TE ；(2)反應(yīng)液PCR Buffer，通用引物 SEQ ID NO :3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為:0· 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (w/v) g/mL BSA，0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06M ρΗ8· 9Tricine。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2M NaOH, IOmM pH 7. 6Tris-Acetate 溶液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；其中，結(jié)合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火緩沖液具體為20mM pH 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂。
(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，熒光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。本發(fā)明所檢測的菌為狹義的細菌，包括假單胞菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球 菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬。上述菌血癥檢測試劑盒的檢測方法包括如下步驟(1)提取細菌 DNA ；(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用通用引物進行細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的 PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化；(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對判斷細菌種屬。步驟(2)中，所述的PCR擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :10· 3μ L， SEQ ID NO :20. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加 無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 3min ;28 個循環(huán)(94°C 25s, 42 °C 30s, 72 °C 20s)； 72°C 3min?；蛘邔EQ ID NO 3替換上述SEQ ID NO :1，同時將SEQ IDNO 4替換上述SEQ IDNO :2，其它PCR擴增體系和條件相同。有益效果本發(fā)明的試劑盒利用焦磷酸測序技術(shù)測定的Vl正向區(qū)段的序列和數(shù) 據(jù)庫比對判斷細菌種屬。應(yīng)用此試劑盒能一次測序鑒定血液樣本細菌種屬?？捎糜诰Y 及敗血癥的臨床診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方 便，特異性強的優(yōu)點。本發(fā)明方法可以使血液樣本細菌種屬鑒定時間大大縮短，成本為傳統(tǒng) 鑒定法的三分之一(本發(fā)明方法檢測時間約4 5小時)，另外，通過序列比對鑒定細菌是 菌種鑒定的終極方法，特別是對一些難鑒定菌，序列比對鑒定更具優(yōu)勢。


圖1為1例血培養(yǎng)陰性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為陰性。圖2為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為 GAATCCAGGAGCAAGCTCCC TTCATCCG，與數(shù)據(jù)庫比對判定為銅綠假單胞菌。圖3為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為 AACGTCAGAGGAGCAAGCTC CTCG,與數(shù)據(jù)庫比對判定為表皮葡萄球菌。圖4為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為 AACAGACGAGGAGCTTGCTC CTTTG,與數(shù)據(jù)庫比對判定為人葡萄球菌。圖5為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為 GTAACAGGAAGAAGCTTGCT TC,與數(shù)據(jù)庫比對判定為大腸埃希菌。圖6為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為CCCGTCCCATTTTTCCCCCGGATGGGAAGGACGAACGAACGTCCCGGTTCGG，與數(shù)據(jù)庫比對判定為屎腸球菌和嗜麥芽窄食單胞 菌混合感染。圖7為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為 CCTCTTTTCCGGTGGAGCAA GCTCCGGTGG,與數(shù)據(jù)庫比對判定為屎腸球菌。圖8為1例血培養(yǎng)陽性標本致病菌檢測結(jié)果圖，測序結(jié)果為 CGTCACCCAAGGAGCAAGCT CCTC,與數(shù)據(jù)庫比對判定為弗氏檸檬酸桿菌。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 試劑盒的制備方法。
(I)DNA 提取試劑核酸純化柱，購于杭州新捷生物科技有限公司，Buffer Li, Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, Buffer TE，購于杭州新捷生物科 技有限公司。(2)反應(yīng)液PCR Buffer 0. 1% (v/v)NP_40 (購于美國 Sigma 公司),0. 02% (ν/ν)明膠(購 于美國 Sigma 公司)，0.06% g/mL BSA (購于美國 Sigma 公司)，0· (v/v) Tween-20 (購 于美國Sigma公司)，0. 06M pH8. 9Tricine (購于德國Merck公司)，通用引物SEQ ID NO :1 2或SEQ ID NO 3 4，由上海英俊生物科技有限公司 合成。MgCl2 購于美國Sigma公司，0. 2mM dNTPs 購于上海鼎國生物技術(shù)有限公司，2U/ μ LTaq DNA 聚合酶購自美國 Fermentas 公司。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液購于杭州長征化學(xué)試劑有限公司，0. 2Μ NaOH:購于上海試四赫維化工有限公司，IOmM Tris-Acetate (ρΗ 7.6) :Tris_base 購于美國 Sigma 公司，無水乙酸購于杭 州化學(xué)試劑有限公司，結(jié)合緩沖液由IOmM Tris-HCl (Tris_base購于美國Sigma公司，鹽酸購于杭州化 學(xué)試劑有限公司)，2M NaCl (購于上海試四赫維化工有限公司)，ImM EDTA(購于杭州化學(xué) 試劑有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (購于美國Sigma公司)組成，退火緩沖液由20mM Tris-Acetate (ρΗ 7. 6) (Tris-base 購于美國 Sigma 公司， 無水乙酸購于杭州化學(xué)試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組 成。親和素標記的磁珠(購于 GE healthcare Bioscience AB)。(4)測序試劑DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶購于QIAGEN公司，底物APS和熒光素購于QIAGEN公司，
四種 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)購于 QIAGEN 公司。實施例2 檢測方法。儀器Bio-RadS1000PCR 儀，Beckman Microfuge 22R 臺式微量冷凍離心機，北京六一瓊脂糖凝膠電泳儀、上海培清凝膠成像系統(tǒng)，QIAGEN PyroMark Q96ID測序儀。(1)提取細菌DNA，具體包括如下步驟(Ia)力口 300uL Buffer Ll 到 1. 5mL 離心管中。(Ib)加入400uL全血，蓋上管蓋，漩渦震蕩30秒。(Ic)加入300uL Buffer L2，劇烈搖晃離心管3_5次，再漩渦震蕩30秒混勻。(Id) 13000rpm 離心 2 分鐘。(Ie)將步驟(Id)中的上清液倒入到核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000rpm離心30秒。(If)棄2mL離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL離心管中，在核酸純化柱中 加入500uL Buffer WA,蓋上管蓋，12000rpm離心30秒。(Ig)棄2mL離心管中的濾液，將核酸純化柱置回2mL離心管中，在核酸純化柱中加 入 600uL Buffer WB,蓋上管蓋，12000rpm 離心 30 秒。(Ih)棄2mL離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL離心管中，14000rpm離心 1分鐘。(Ii)棄2ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1. 5mL離心管中，在純化柱中加 入IOOuL 56°C溫育的Buffer TE,蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000rpm離心30秒。(Ij)棄純化柱，洗脫的DNA作為PCR模板。(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用通用引物進行細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的 PCR擴增；其中，所述的PCR 擴增體系為10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ IDNO :20. 3 μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水 至 50 μ L ；PCR擴增條件為-MV 3min ；28 個循環(huán)(94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s) ；72°C 3min ； 或者將SEQ ID NO :3替換上述SEQ ID NO :1，同時將SEQ ID NO :4替換上述SEQ ID NO 2, 其它PCR擴增體系和條件相同。(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化 在使用前，保證所有溶液都達到室溫； 在 PSQ 96 板中加入 45 μ 1 annealing buffer，然后每孔加入 SEQ ID NO :2 測 序引物(IOuM)O. 5uL ； 使用Vertex混勻S印harose beads，將需要使用的s印haroe beads總量(每樣 本3yL)轉(zhuǎn)移至Ij 一個Eppendorf■管中，在s印harose bead中力口入binding buffer，使得平 均每個樣品約有50 μ L的體積，將混合物混勻； 將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50 μ L反應(yīng)體積)中，每樣本50 μ L，將PCR產(chǎn)物在 常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合； 在Vacuum prep workstation中，四個樣品板中依次加入180mL高純水、70%乙 酉享、washing buffer 禾口 120ml Denaturation buffer ； 打開 vacuum prep workstation 的泵，將 vacuum prep tool 在高純水中清洗 30vacuum prep tool PCR , MM sepharose beads, vacuum prep tool 放入70%乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washing buffer中 清洗10秒，把吸頭放在相應(yīng)含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關(guān)掉泵，將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放s印harose beads ； 使用高純水清洗 vacuum pi^p tool。將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫后 放入測序儀中。(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序結(jié)果與美國國家生物信息技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫比對判斷細菌種屬。將本發(fā)明方法用于8例臨床血培養(yǎng)陽性標本的鑒定，測序圖如圖1-8所示 。本發(fā) 明方法鑒定結(jié)果與經(jīng)微生物培養(yǎng)、致病菌分純后用法國生物梅里埃的微生物鑒定系統(tǒng)做比 對，結(jié)果一致。
權(quán)利要求
一種菌血癥檢測試劑盒，其特征在于它包括(1)擴增細菌16S rRNA的V1可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ IDNO1在其5’端標記生物素；在一次檢測中共同使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌血癥檢測試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取試劑核酸純化柱，Buffer Li，Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, BufferTE ；(2)反應(yīng)液PCRBuffer，通用引物 SEQ ID N0:1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaqDNA聚合酶；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate溶液， 結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
3.—種菌血癥檢測試劑盒，其特征在于它包括權(quán)利要求1所述的所有核苷酸序列的堿 基互補序列，也就是包括(1)擴增細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示引物對；(4)測序引物其核苷酸序列如SEQID NO :4所示；(5)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO :3在其5，端標記生物素； 在一次檢測中共同使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血液樣本細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取試劑核酸純化柱，Buffer Li，Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, BufferTE ；(2)反應(yīng)液PCRBuffer，通用引物 SEQ ID N0:3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaqDNA聚合酶；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate溶液， 結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
5.一種菌血癥檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟(1)提取血液中細菌DNA;(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用通用引物進行細菌16SrRNA的Vl可變區(qū)的PCR 擴增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化；(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對判斷細菌種屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌血癥檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所 述的 PCR 擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ ID NO 20. 3μ L, Template DNA 3μ L,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為:94°C 3min ；28 個循環(huán)，94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s ；72°C 3min。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌血癥檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所 述的 PCR擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 30. 3μ L, SEQ ID NO 40. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為:94°C 3min ；28 個循環(huán)，94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s ；72°C 3min。
全文摘要
本發(fā)明涉及臨床微生物鑒定領(lǐng)域，提供了一種快速鑒定血液樣本中細菌的試劑盒及方法。該試劑盒包括2條通用引物擴增細菌16S rRNA的V1可變區(qū)，1條測序引物測定V1正向區(qū)段的序列，親和素標記的磁珠，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對判斷種屬。應(yīng)用此試劑盒能一次測序區(qū)分血液樣本中的細菌，可用于菌血癥以及敗血癥的臨床診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方便，特異性強的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101864490SQ20101022099
公開日2010年10月20日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者任緒義, 呂江峰, 虞閏六 申請人:杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司