專利名稱：一種用于檢測牙齦卟啉菌及其亞型鑒別的多重pcr試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口腔致病菌的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測牙齦卟啉菌及其亞型 鑒別的多重PCR試劑盒及使用方法。
背景技術(shù)：
牙周病是指發(fā)生在牙支持組織的疾病，包括僅累及牙齦組織的牙齦病和波及深層 牙周組織的牙周炎兩大類。是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類牙齒和 全身健康的主要口腔疾病之一。我國成年人中80 % 97 %患有不同程度的牙周疾病。近來 越來越多的研究表明，牙周病與許多系統(tǒng)性疾病如，血管疾病、糖尿病、低體質(zhì)量早產(chǎn)兒、消 化系統(tǒng)疾病等存在著密切的相關(guān)性，成為許多系統(tǒng)性疾病的潛在危險因素。牙周病作為慢 性、非特異性、感染性疾病，其主要感染源為細菌。而牙齦卟啉菌(P. gingivalis)是牙周病 的重要致病菌，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發(fā)性全身性系統(tǒng) 疾病密切相關(guān)。P. gingivalis是革蘭陰性短桿菌，專性厭氧、無芽胞、無動力?；蚪MG+C 含量為40 52%。研究已證實P. gingivalis存在毒力株和無毒株，無毒株形成了 口腔正 常的微生態(tài)群，而毒力株則成為牙周病的重要致病菌。1999年Curtis等在對P. gingivalis W50菌株的研究中發(fā)現(xiàn)，其外膜上存在著一個由重組活化基因(recombination activation gene，rag) B編碼的相對分子質(zhì)量為5. 5 X IO4的免疫顯性表面抗原。該基因位于ragA基因 的上游，兩者為共轉(zhuǎn)錄基因，ragA基因編碼假定的tonB依賴性受體，同時也發(fā)現(xiàn)rag基因座 (ragA和ragB)，僅存在于毒力株中，有利于P. gingivalis在牙周組織中的的定植與致病。 Hall等發(fā)現(xiàn)，rag基因座有4種等位基因型，存在遺傳多態(tài)性，其中rag-Ι型為高毒力基因 型。然而，P. gingivalis遺傳的多態(tài)性給該菌的診斷及清除帶來了巨大的挑戰(zhàn)，迄今為止， 臨床并無有效地的診斷試劑盒問世。因此P. gingivalis診斷及亞型鑒別診斷試劑盒的發(fā) 明，對于防治牙周疾病的發(fā)生，提高人民生活質(zhì)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
P. gingivalis是一種重要的口腔致病菌，存在著致病型與非致病型。非致病型 P. gingivalis構(gòu)成了 口腔正常的微生物群，而致病型P. gingivalis存在rag基因座。Rag 基因座有四種不同的基因型，其致病能力不同。目前對該菌的診斷主要依靠培養(yǎng)，培養(yǎng)需時 常、步驟繁瑣，不利于臨床快速診斷的需求，同時培養(yǎng)出的細菌需要進行進一步的PCR鑒定 才能夠區(qū)分出致病型與非致病型。本發(fā)明提供一種快速、簡便的方法不僅能夠鑒別出有無 P. gingivalis感染而且還能夠同時鑒定出其亞型。本發(fā)明針對目前P. gingivalis診斷耗時長，步驟繁瑣，不利于臨床快速診斷的需 求。通過Clustral X比對設(shè)計出針對P. gingivalis以及四種不同rag基因型的特異性引 物，保證這些引物擴增片段大小具有明顯不同、且具有相同的退火溫度。把這五種不同的引 物與Taq酶、buffer, dNTP和ddH20混合做成mix (反應(yīng)混合液)。2/3頁 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種用于檢測牙齦卟啉菌及其亞型 鑒別的多重PCR試劑盒，主要成分是下述5種針對牙齦卟啉菌16s rRNA的特異性引物，還 包括其他PCR試劑；針對牙齦卟啉菌16srRNA的特異性引物如下
Forward primer:5，-AGGCAGCTTGCCΑΤΑCTGCG-3，(SEQ ID NO. 1)
Reverse primer:5，-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3，(SEQ ID NO. 2)
ragl(W50)，
Forward primer:5，-CGCGACCCCGAAGGAAAAGAT T-3，(SEQ ID NO. 3)
Reverse primer:5，-CACGGCTCACATAAAGAACGC T-3，(SEQ ID NO. 4)
rag2 (Thai)，
Forward primer:5，-GCTTTGCCGCTTGTGACTTGG-3，(SEQ ID NO. 5)
Reverse primer:5，-CCACCGTCACCGTTCACCTTG-3，(SEQ ID NO. 6)
rag3 (QML)，
Forward primer:5，-CCGGAAGATAAGGCCAAGAAA GA-3，(SEQ ID NO. 7)
Reverse primer:5，-ACGCCAATT CGC CAAAGC T--3，(SEQ ID NO. 8)
rag4(381)，
Forward primer:5，-CCGGATGGAAGTGATGAACAG A-3，(SEQ ID NO. 9)
Reverse primer:5，-CGCGGTAAACCTCAGCAAATT-3，。(SEQ ID NO. 10)
上述所說的PCR試劑是Taq酶、buffer、dNTP和ddH20。
本發(fā)明的試劑盒:在使用時，先將5種引物按相同體積混合，制得反應(yīng)1液；再將其
他PCR試劑混合制得反應(yīng)2液，然后把反應(yīng)1液與反應(yīng)2液混合得到反應(yīng)混合液。檢測時取待檢測樣本放入到有雙蒸水的Ependorf管中，加熱煮沸后加入到反應(yīng) 混合液中進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，再根據(jù)電泳條帶的位置確定有無牙齦 卟啉菌及其亞型。具體的操作是用口腔棉拭子，吸取齦溝液，放入到潔凈的含有200 μ 1雙蒸水的 Ependorf管中，加熱煮沸后取4μ 1到6μ 1反應(yīng)混合液中(10 μ 1反應(yīng)體系)在任何一臺 PCR儀器上進行擴增，然后采用12%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶的位置不但 能夠快速檢測出樣本中有無P. gingivalis存在，存在的P. gingivalis是致病型還是非致 病型而且能夠同時鑒別出是那種致病型。本發(fā)明的有益效果是，步驟簡便、快速、易于普查以及口腔疾病患者的篩查。


下面結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進一步說明。圖1是本發(fā)明中的引物設(shè)計原理圖。圖2是mix的制備過程示意圖。圖3是齦溝液的采集及PCR反應(yīng)過程示意圖。圖4是瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的判斷示意圖。①陽性對照、②口腔中有牙齦卟啉菌定居、③口腔中有牙齦卟啉菌定居且為ragl 致病型、④口腔中有牙齦卟啉菌定居且為rag2致病型、⑤口腔中有牙齦卟啉菌定居且為rag3致病型、⑥口腔中有牙齦卟啉菌定居且為rag4致病型、⑦陰性對照具體實施例方式在圖1中，首先在PUBMED數(shù)據(jù)庫中搜索P. gingivalis 16S rRNA，然后利用primer pick程序設(shè)計P. gingivalis引物，同時限定擴增片段的大小、退火溫度，并判斷該引物擴 增P. gingivalis的特異性；然后在PUBMED基因數(shù)據(jù)庫中下載P. gingivalis rag基因座的 四種不同亞型，利用Clustral X比對四條基因序列，在四條基因高變區(qū)設(shè)計引物、限定退火 溫度、并保證四對擴增引物擴增片段的長短不同，并把設(shè)計的引物放入到primer pick程序 中檢驗其擴增片段的特異性。在圖2所示實施例中，首先將五對不同的引物稀釋，每對引物按照 1:1:1:1: 1的體積比例混合在一起，做成反應(yīng)1液。將Taq酶、PCR反應(yīng)buffer、 dNTP和ddH20按照1 20 16 23體積比例混合，做成反應(yīng)2液；按反應(yīng)1液反應(yīng)2液 為1 2的體積比將反應(yīng)1液加入到反應(yīng)2液中做成mix。如圖3所示，用棉拭子蘸取就診病人齦溝液，取出后放入到含有200 μ 1雙蒸水的 潔凈Ependorf管中，煮沸5分鐘，取出4μ 1力口入到6μ 1的反應(yīng)mix中；離心后進行PCR。 PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性45s，60°C退火30s，72°C延伸45s，30個循環(huán)，最 后72°C延伸10分鐘。在圖4所示中為瓊脂糖凝膠電泳后PCR結(jié)果示意圖。16S rRNA擴增片段大小 為200bp、ragl擴增片段大小為628bp、rag2擴增片段大小為979bp、rag3擴增片段大小 為423bp、rag4擴增片段大小為738bp。如果僅有16S rRNA片段出現(xiàn)意味著檢測樣本有 P. gingivalis存在，并不一定意味著是致病型P. gingivalis。若16S rRNA片段與其他任 何一 rag片段(ragl-4)同時出現(xiàn)意味著檢測樣本中有致病型P. gingivalis存在(圖4)。
權(quán)利要求
一種用于檢測牙齦卟啉菌及其亞型鑒別的多重PCR試劑盒，包括特異性引物和PCR試劑，其特征在于，所說的特異性引物是下述5對針對牙齦卟啉菌16s rRNA的特異性引物，還包括其他；(1)Forward primer5’ AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG 3’ Reverse primer5’ ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT 3’(2)Forward primer5’ CGC GAC CCC GAA GGA AAA GAT T 3’ Reverse primer5’ CAC GGC TCA CAT AAA GAA CGC T 3’(3)Forward primer5’ GCT TTG CCG CTT GTG ACT TGG 3’ Reverse frimer5’ CCA CCG TCA CCG TTC ACC TTG 3’(4)Forward primer5’ CCG GAA GAT AAG GCC AAG AAA GA 3’ Reverse primer5’ ACG CCA ATT CGC CAA AGC T 3’(5)Forward primer5’ CCG GAT GGAAGT GAT GAACAGA 3’ Reverse primer5’ CGC GGT AAA CCT CAG CAA ATT 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中所說的PCR試劑是Taq酶、buffer、 dNTP 禾口 ddH20。
3.權(quán)利要求1所述的試劑盒的使用方法，是先將5種引物按相同體積混合，制得反應(yīng) 1液；再將其他PCR試劑混合制得反應(yīng)2液，然后把反應(yīng)1液與反應(yīng)2液混合得到反應(yīng)混合 液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其中所說的反應(yīng)2液是Taq酶、buffer, dNTP和ddH20按1 20 16 23的體積比混合得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，按1 2的體積比將反應(yīng)1液與反應(yīng)2液 混合得到反應(yīng)混合液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，取待檢測樣本放入到有雙蒸水的 Ependorf管中，加熱煮沸后加入到反應(yīng)混合液中進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳， 再根據(jù)電泳條帶的位置確定有無牙齦卟啉菌及其亞型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測牙齦卟啉菌及其亞型鑒別的多重PCR試劑盒及其使用方法。所說的試劑盒包括PCR試劑和5對針對牙齦卟啉菌16s rRNA的特異性引物特異性引物。使用時先將五對特異性檢測引物和PCR試劑按照一定比例配成的反應(yīng)混合液，再將采集的齦溝液煮沸后加入到反應(yīng)混合液中通過PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶的位置即可確定有無牙齦卟啉菌感染及其感染牙齦卟啉菌的亞型。本發(fā)明具有步驟簡便、快速的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK101899510SQ20101022297
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日 公開號201010222973.發(fā)明者周成林, 孔凡芝, 王勝軍, 蘇兆亮, 許化溪, 鄭冬, 陳建國 申請人:江蘇大學(xué)