專利名稱：一種減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是一種減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì) 胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
目前在實(shí)驗(yàn)室里，一般使用含有動(dòng)物來源血清的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行小批量的貼壁細(xì) 胞培養(yǎng)工作，但是，如果是在產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用當(dāng)中，尤其是培養(yǎng)出的貼壁細(xì)胞作為藥用 時(shí)，使用含有動(dòng)物來源血清的細(xì)胞培養(yǎng)基有著許多不利因素(1)用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清一般要經(jīng)過熱滅活，熱滅活的過程可以防止血清對細(xì)胞 的溶解作用，但是這個(gè)過程也可以使血清中的許多重要成分失活。(2)由于不同批次血清所來源的生物體不同，不同批次血清之間也不可避免地含 有不同的成分，其中有些成分會(huì)給所培養(yǎng)的細(xì)胞帶來變化，導(dǎo)致給終產(chǎn)品帶來無法預(yù)知的 影響，使得其產(chǎn)品質(zhì)量難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。(3)血清中的成分并沒有也不可能在短時(shí)間內(nèi)完全被闡明，因此，它們對所培養(yǎng)細(xì) 胞的影響既是未知的，也是不能控制的。在細(xì)胞治療產(chǎn)品中去除細(xì)胞培養(yǎng)基中的動(dòng)物成分，將提高產(chǎn)品的安全性，減弱或 降低免疫排斥反應(yīng)。理論上在細(xì)胞治療產(chǎn)品中使用無血清培養(yǎng)基也更利于生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化。但是，到目前為止還沒有真正適合于大規(guī)模制備細(xì)胞產(chǎn)品的無血清培養(yǎng)基(1)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的無血清培養(yǎng)基由于要添加各種細(xì)胞因子，導(dǎo)致成本遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于含血清培養(yǎng)基。(2)到目前為止，我們還不了解血清中哪些成分對細(xì)胞增殖、分化、基因穩(wěn)定性等 等產(chǎn)生相應(yīng)作用；所以，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基大規(guī)模制備細(xì)胞治療產(chǎn)品的時(shí)候，很難通過配方 的改進(jìn)和調(diào)整達(dá)到和含血清培養(yǎng)基同樣的效果。(3)到目前為止，各國還沒有對用于培養(yǎng)治療用細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基制定出相應(yīng) 的標(biāo)準(zhǔn)；但對牛血清等是有相應(yīng)的要求。因此在目前，為了在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中更快、更好的擴(kuò)增細(xì)胞，我們還是需要在培養(yǎng)時(shí) 添加血清。最終得到的產(chǎn)品當(dāng)中里會(huì)存在較多的異種蛋白，若是用于臨床，則大大增加了使 用時(shí)的隱患，所以亟需一種減少終產(chǎn)品當(dāng)中異種蛋白含量的細(xì)胞培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種保證細(xì)胞其它生理生化參數(shù)不變的前提下，減少外源蛋 白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，使得培養(yǎng)出的細(xì)胞更適合臨床使用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋 白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟將細(xì)胞接種到含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于二 氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期時(shí)，將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞培養(yǎng)方法為貼壁培養(yǎng)。所述細(xì)胞為在培養(yǎng)時(shí)具有貼壁特性的細(xì)胞。所述細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，再將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。所述細(xì)胞為干細(xì)胞。所述干細(xì)胞為人干細(xì)胞。所述干細(xì)胞為亞全能干細(xì)胞。所述干細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì)胞。所述干細(xì)胞為從體外臍帶胎盤來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞。所述含血清培養(yǎng)基為DMEM/F12、DMEM, MCDB-201或M199中的一種或幾種的組合， 其中含體積比2% 20%的血清。所述血清為牛血清或馬血清。所述培養(yǎng)基中還加入有細(xì)胞因子。所述細(xì)胞因子為EGF、bFGF或VEGF中的一種或幾種組合。所述EGF、bFGF 或 VEGF 的含量均為 1 100ng/ml。所述二氧化碳培養(yǎng)的條件為37°C、飽和濕度、二氧化碳濃度5%，氧濃度為 20%。所述細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶時(shí)的密度為(0. 1 2) X 104/cm2。本發(fā)明的有益效果是用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法得到的貼壁細(xì)胞，由于在最后 步驟中將含血清培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基，所以可以在不影響最終培養(yǎng)效果的基礎(chǔ)上， 有效地降低成品中異種蛋白的含量，若是應(yīng)用于人類干細(xì)胞的培養(yǎng)，則得到的最終產(chǎn)品適 合于臨床直接使用，不良反應(yīng)明顯少于始終使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的產(chǎn)品。


圖1是人絨毛膜亞全能干細(xì)胞不同培養(yǎng)條件MTT結(jié)果；圖2是人絨毛膜亞全能干細(xì)胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果；圖3是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果；圖4是人臍帶血來源細(xì)胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果；圖5是不同換液時(shí)間人絨毛膜亞全能干細(xì)胞制劑牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié) 果；圖6是大鼠胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明實(shí)施例1(1)從合格的細(xì)胞庫取出凍存細(xì)胞，在37°C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；(2)用含體積比濃度 10% (下同)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、 飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到80-90%融合時(shí)，用消化酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)； (3)分別用配制好含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基按合適濃度重懸細(xì) 胞；(4)分成三組含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基組、DMEM/F12培養(yǎng)基組和先用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)到70%融合后再用DMEM/F12培養(yǎng)基換液組，將各組細(xì)胞用96孔 板培養(yǎng)，每組6復(fù)孔；(5)培養(yǎng)結(jié)束前四小時(shí)加入10微升MTT，到培養(yǎng)結(jié)束用專業(yè)人事熟知 的MTT方法檢測每組OD值，OD值高代表活細(xì)胞數(shù)高。結(jié)果無血清培養(yǎng)組OD值最低；換液組OD值略低于含血清組，但P值大于0. 05， 統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著差異(圖1)實(shí)施例2人絨毛膜亞全能干細(xì)胞的擴(kuò)增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)從合格的細(xì)胞庫取出凍存細(xì)胞，在37°C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；(2)用含體積比濃度 10% (下同)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X 104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽 和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到80-90%融合時(shí)按1 3傳代，經(jīng)過3次傳代； (3)在第三次傳代細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)換完全無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)，對 照組不進(jìn)行該換液步驟；(4)用消化酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用配制好細(xì)胞保護(hù)液按合適濃度重 懸細(xì)胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟 知的ELISA方法進(jìn)行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果細(xì)胞在換液12小時(shí)后達(dá)到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為6. 2ng/l X IO7細(xì)胞對照組37. 3ng/l X IO7細(xì)胞(圖2)。實(shí)施例3人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)從合格的細(xì)胞庫取出凍存細(xì)胞，在37 °C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；(2)用含60% DMEM/F12培養(yǎng)液和40 % MCDB-201培養(yǎng)液混合組成，體積比濃度2_10 %的血清，ICT8M dexamethasone (地塞米松)，0. 2-5 X ITS,，0. 1-lOmML-glutamine (L-谷氨酰胺)，I-IOOng/ ml人表皮細(xì)胞生長因子，和Ι-lOOng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子等的培養(yǎng)基按2X IO4/ cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到 80-90%融合時(shí)按1 3傳代，經(jīng)過3次傳代；(3)在第三次傳代細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)換完 全無血清的60% DMEM/F12培養(yǎng)液和40% MCDB-201培養(yǎng)液混合培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，對照 組不進(jìn)行該換液步驟；(4)用消化酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用配制好細(xì)胞保護(hù)液按合適濃度重懸 細(xì)胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟知 的ELISA方法進(jìn)行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果細(xì)胞在換液24小時(shí)后達(dá)到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為2. 7ng/l X IO7細(xì)胞，對照組32. 7ng/l X IO7細(xì)胞(圖3)。實(shí)施例4人臍帶血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)從合格的細(xì)胞庫取出凍存細(xì)胞，在37°C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；(2)用含20%血清、 10ng/ml的VEGF、10U/ml的肝素和4ng/ml的bFGF的M199培養(yǎng)基按2 X 10Vcm2的密度接種 到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到80-90%融合時(shí)按 1 3傳代，(3)在傳代細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)換完全無血清，含lOng/ml的VEGF、10U/ml的 肝素和4ng/ml的bFGF的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，對照組不進(jìn)行該換液步驟；(4)用消化 酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用配制好細(xì)胞保護(hù)液按合適濃度重懸細(xì)胞，分裝入無菌容器中，密封后， 放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟知的ELISA方法進(jìn)行牛血清白蛋白殘 留物檢測。結(jié)果細(xì)胞在換液24小時(shí)后達(dá)到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為8. 3ng/l X IO7細(xì)胞，對照組52. 8ng/l X IO7細(xì)胞(圖4)。
實(shí)施例5不同換液時(shí)間對人絨毛膜亞全能干細(xì)胞制劑牛血清白蛋白殘留的影響(1)從合格的細(xì)胞庫取出凍存細(xì)胞，在37°C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；(2)用含體積比濃度 10% (下同)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X 104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽 和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到80-90%融合時(shí)按1 3傳代，經(jīng)過2次傳代； (3)在第2次傳代細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期時(shí)，分換液4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)及對照組4組，對 照組不進(jìn)行該換液步驟；(4)用消化酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用配制好細(xì)胞保護(hù)液按合適濃度重 懸細(xì)胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟 知的ELISA方法進(jìn)行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果同時(shí)收獲細(xì)胞，制備得到的制劑；檢測牛血清白蛋白殘留4小時(shí)、12小 時(shí)、24小時(shí)及對照組分別為24. Ing/lXlO7細(xì)胞、6. 9ng/l X 107細(xì)胞、3. 2ng/lX107細(xì)胞、 35. Ing/lXlO7 細(xì)胞(圖 5)。實(shí)施例6大鼠胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)取出凍存的大鼠胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞，在37°C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；(2)用含體 積比濃度(下同)10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X 104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置 于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到80-90%融合時(shí)按1 3傳代，經(jīng) 過2次傳代；(3)在第2次傳代細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期時(shí)，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行換液，對照組不進(jìn)行該 換液步驟；(4) 12小時(shí)后用消化酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用配制好細(xì)胞保護(hù)液按合適濃度重懸細(xì) 胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟知的 ELISA方法進(jìn)行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果細(xì)胞在換液12小時(shí)后達(dá)到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為4. 7ng/l X 107細(xì)胞對照組27. 7ng/l X 107細(xì)胞(圖6)。上述實(shí)施例中用的是牛血清，用馬血清也可以，不再舉例。本發(fā)明的方法雖然換液去除了牛血清支持，但對數(shù)增長期細(xì)胞能大量分泌細(xì)胞生 長需要的細(xì)胞因子，可以保證細(xì)胞正常擴(kuò)增；利用該培養(yǎng)方法這樣既保證了細(xì)胞能良好擴(kuò) 增細(xì)胞，也可以大大減少最終收獲細(xì)胞中的異源蛋白含量。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟將細(xì)胞接種到含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期時(shí)，將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述細(xì)胞培養(yǎng)方法為貼壁培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述細(xì)胞為在培養(yǎng)時(shí)具有貼壁特性的細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，再將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法， 其特征在于，所述細(xì)胞為干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述干細(xì)胞為人干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述干細(xì)胞為亞全能干細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述干細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述干細(xì)胞為從體外臍帶胎盤 來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述含血清培養(yǎng)基為DMEM/F12、DMEM、MCDB-201或M199中的一種或幾種的組合，其中 含體積比2 % 20 %的血清。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述血清為牛血清或馬血清。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述培養(yǎng)基中還加入有細(xì)胞因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述細(xì)胞因子為EGF、bFGF或VEGF中的一種或幾種組合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述EGF、bFGF或VEGF的含 量均為1 100ng/ml。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特 征在于，所述二氧化碳培養(yǎng)的條件為37°C、飽和濕度、二氧化碳濃度5%，氧濃度為 20%。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶時(shí)的密度為(0. 1 2) X104/cm2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種減少細(xì)胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟將細(xì)胞接種到含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期時(shí)，將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法得到的貼壁細(xì)胞，由于在最后步驟中將含血清培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基，所以可以在不影響最終培養(yǎng)效果的基礎(chǔ)上，有效地降低成品中異種蛋白的含量，若是應(yīng)用于人類干細(xì)胞的培養(yǎng)，則得到的最終產(chǎn)品適合于臨床直接使用，不良反應(yīng)明顯少于始終使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N5/074GK101892192SQ20101022376
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者王濤, 韓之海 申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司