專(zhuān)利名稱(chēng)：快速靈敏檢測(cè)根癌土壤桿菌的pcr引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一對(duì)用于快速靈敏檢測(cè)根癌土壤桿菌的PCR引物序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域，用于土壤，植物組織中根癌土壤桿菌的快速靈敏檢測(cè)。
背景技術(shù)：
由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根癌病是多種果樹(shù)，林木 上的一類(lèi)重要根部病害。該病原菌寄主范圍廣，可侵染93科331屬800多種植物，除危害 桃，葡萄，蘋(píng)果，梨等重要果樹(shù)外，還能侵害李，杏，櫻桃，花紅，木瓜，板栗，胡桃等果樹(shù)；此外 還能危害多種常見(jiàn)的林木，花卉，甚至瓜類(lèi)，在生產(chǎn)上造成非常大的損失。根癌病菌的致病機(jī)制是病原菌通過(guò)傷口侵入寄主后，將其誘癌質(zhì)粒 (Ti-Plasmid，該質(zhì)粒上攜帶誘癌基因)上的一段能夠促使植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素產(chǎn)生 的T-DNA整合到植物細(xì)胞的染色體DNA上，隨著植物本身的生長(zhǎng)代謝，來(lái)刺激植物細(xì)胞異常 分裂和增生，形成癌瘤，而病原菌的菌體并不進(jìn)入植物細(xì)胞。這一特點(diǎn)說(shuō)明根癌病菌具有非 常特殊的致病機(jī)制，一旦有根癌癥狀出現(xiàn)，說(shuō)明細(xì)菌的T-DNA已經(jīng)整合到植物細(xì)胞的染色 體上，再用殺細(xì)菌劑殺滅細(xì)菌已經(jīng)無(wú)法抑制植物細(xì)胞的增生，也無(wú)法使根癌癥狀消失，同樣 也不能阻止癌瘤的發(fā)展和增大。從病菌侵入到顯現(xiàn)癌瘤所需的時(shí)間，一般要經(jīng)幾周到一年 以上。因此，對(duì)于根癌土壤桿菌的診斷就需要在癥狀顯現(xiàn)之前來(lái)進(jìn)行，這樣就要求有靈 敏的快速的方法。以PCR為代表的分子生物學(xué)手段已經(jīng)成為病原菌檢測(cè)的重要武器。綜上 所述，設(shè)計(jì)并優(yōu)化合適的PCR檢測(cè)引物屬于當(dāng)務(wù)之急，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明針對(duì)在根癌土壤桿菌檢測(cè)中的問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一對(duì)靈敏而快速的特異性PCR 擴(kuò)增引物，引物根據(jù)根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒上的tmr位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，名稱(chēng)為tmr236F和 tmr236R,具體核苷酸序列見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。技術(shù)方案一對(duì)用于快速靈敏檢測(cè)根癌土壤桿菌的PCR引物，包括tmr236F =SEQ ID NO. 1和 tmr236R :SEQ ID NO. 2。有益效果經(jīng)BLAST N比對(duì)，本發(fā)明引物序列除了根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒以外與任何已知的核 苷酸序列均不100%匹配。同時(shí)利用該P(yáng)CR反應(yīng)體系擴(kuò)增了包括根癌土壤桿菌在內(nèi)的12個(gè) 常見(jiàn)菌株基因組DNA，只有根癌土壤桿菌擴(kuò)增出了 236bp目標(biāo)片段，剩下的11同屬不同種或 者不同屬的菌株均無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物(附圖1)。 通過(guò)控制模板DNA中的模板拷貝數(shù)量，制備了 一系列DNA模板，其中包含的模板拷 貝數(shù)從IO9到10°，用來(lái)定量檢測(cè)該引物的靈敏性。從擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，該引物可以在只有1個(gè)拷貝數(shù)的模板DNA中擴(kuò)增出236bp目標(biāo)片段(附圖2)。
四

圖1特異性PCR擴(kuò)增根癌土壤桿菌以及其他常見(jiàn)細(xì)菌ii :M :DNA maker ； 1 :H16 (Agrobacterium tumefaciens, ICMP11272) ；2 Pb6 (Agrobacteriumrhizogenes, ICMPl1274) ；3 :Vb8 (Agrobacterium vitis, ICMPl1278)； 4 :GMI1000 (Ralstonia solanacearum, NC_003295) ；5 :1JN2 (Bacillus subtilis, GU549436) ；6 :2BGN8(Serratia marcescens, HM161860) ；7 :3YW8(Myroidesodoratimimus, GU549435) ；8 :2JW6(Stenotrophomonas maltophilia, GU549434) ；9 :3YN16(Enterobacter sp, GU549440) ；10 :Z17(Pantoea agglomerans, HM161866) ；11 :3JW1(Pseudomonas sp, GU991854) ； 12 :N2 (Burkholderia sp, HM161871).圖2PCR擴(kuò)增靈敏性檢測(cè)注=M=DNA maker ；1-10 分別含 IO9-IO0 拷貝數(shù)的 DNA 模板
五具體實(shí)施例方式1，引物設(shè)計(jì)根據(jù)根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒上的tmr位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，包括tmr236F =SEQ ID NO. 1 和 tmr236R :SEQ ID NO. 2。擴(kuò)增目標(biāo)片段 236bp。2，DNA 提取用于檢驗(yàn)該引物特異性的12個(gè)常見(jiàn)細(xì)菌(包括根癌土壤桿菌)基因組DNA采用 上海賽百盛公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，具體方法根據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。3，PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系如下(25 μ 1)
試劑初始濃度終濃度體積(μ )10XPCR Buffer10XIX2.5MgCl225mM3. 75mM3. 75dNTPs2. 5mM0. 2mM2tmr236F10 μ M0. 2μΜ0. 5Tmr236R10μΜ0. 2μΜ0. 5Taq polymerase5υ/μ 10. lU/μ 10.5DNA template1MiliQ14. 25
PCR反應(yīng)體系如下 4，PCR特異性測(cè)試經(jīng)BLAST N比對(duì)，該引物序列除了根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒以外與任何已知的核苷酸 序列均不100%匹配。同時(shí)利用該P(yáng)CR反應(yīng)體系擴(kuò)增了包括根癌土壤桿菌在內(nèi)的12個(gè)常見(jiàn) 菌株基因組DNA，只有根癌土壤桿菌擴(kuò)增出了 236bp目標(biāo)片段，剩下的11同屬不同種或者不 同屬的菌株均無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物(附圖1)。5，PCR靈敏性測(cè)試通過(guò)控制模板DNA中的模板拷貝數(shù)量，制備了一系列DNA模板，其中包含的模板拷 貝數(shù)從IO9到10°，用來(lái)定量檢測(cè)該引物的靈敏性。從擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，該引物可以在只有1個(gè) 拷貝數(shù)的模板DNA中擴(kuò)增出236bp目標(biāo)片段(附圖2)。
權(quán)利要求
一對(duì)用于快速靈敏檢測(cè)根癌土壤桿菌的PCR引物，包括tmr236FSEQ ID NO.1和tmr236RSEQ ID NO.2。
全文摘要
本發(fā)明為快速靈敏檢測(cè)根癌土壤桿菌的PCR引物，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該引物對(duì)根據(jù)根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒tmr位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，前后引物各23個(gè)堿基，擴(kuò)增目標(biāo)片段236bp。通過(guò)核苷酸序列比對(duì)以及常見(jiàn)細(xì)菌擴(kuò)增，只有根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)可以擴(kuò)增出相應(yīng)片段。通過(guò)靈敏性評(píng)估證明，該引物可以從只含有1個(gè)拷貝的模板DNA中擴(kuò)增出相應(yīng)片段。綜上所述，該引物可以用于快速，靈敏的檢測(cè)土壤中以及植物組織中的根癌土壤桿菌，從而大大提高檢測(cè)的靈敏度的效率。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101880718SQ20101022475
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者劉紅霞, 季鐳, 楊威, 郭堅(jiān)華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)