專利名稱：一種高效表達重組蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物細胞培養(yǎng)領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種采用動物細胞流加培養(yǎng)方式高效表達重組蛋白的方法。
背景技術：
動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)被廣泛應用于生產(chǎn)各類生物活性物質(zhì)如單克隆抗體、病毒疫苗、免疫調(diào)節(jié)因子、生長因子、特定腫瘤抗原以及各種基因重組蛋白質(zhì)藥物。動物細胞同微生物相比具有轉(zhuǎn)錄后修飾的能力，能夠高效地表達和生產(chǎn)各類高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，就操作方式而言，主要分為分批式(Batch)，流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三種操作方式。簡單的分批培養(yǎng) (Batch)中，隨著營養(yǎng)物的消耗和副產(chǎn)物積累，細胞停止生長并開始死亡，產(chǎn)物也停止表達， 生產(chǎn)效率很低。流加培養(yǎng)(Fed-batch)，即在培養(yǎng)過程中，根據(jù)細胞代謝需求，連續(xù)或間歇地向反應器內(nèi)加入特定的流加培養(yǎng)基，補充新的營養(yǎng)物質(zhì)，減少副產(chǎn)物，克服了批培養(yǎng)的弊端。流加培養(yǎng)同批培養(yǎng)相比，培養(yǎng)周期延長，能夠最終獲得更高的活細胞密度和產(chǎn)物濃度 (J. B.Griffith, Animal Cell Culture and Production of Biologicals, pp.401-410, Klumer Academic Publishers, R. Sasaki and K. Ikura(eds. ), (1991), Robbinson DK, Seamans TC, et al. optimization of a fed-batch process for production of a recombinant antibody. Annals NY Academy Sciences, (1994)，745 :185—296)。 3 會賣 流培養(yǎng)(Perfusion)是指把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將消耗過的培養(yǎng)基排出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基的方法。目前，流加式(Fed-batch)培養(yǎng)是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組蛋白藥物較為推崇的一種操作方式。此外，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的有關研究內(nèi)容還包括高密度和高表達細胞的培養(yǎng)環(huán)境及條件，促進單個細胞的基因合成和產(chǎn)物表達，改進培養(yǎng)系統(tǒng)的氧傳遞方式，以及減少剪切力和降低生產(chǎn)成本的培養(yǎng)條件等。其中，培養(yǎng)溫度是影響重組蛋白生產(chǎn)的重要因素之一， 優(yōu)化培養(yǎng)溫度，可提高重組蛋白的產(chǎn)量，與其他方法相比，此方法操作簡便，有較好的實用價值。CN 200510011774.5(發(fā)明名稱為一種高效表達目的蛋白的方法)公開了一種高效表達目的蛋白的方法，該方法通過優(yōu)化穩(wěn)定表達目的蛋白的工程化CHO細胞株的培養(yǎng)溫度，并利用兩階段培養(yǎng)策略，使融合蛋白表達量得到顯著提高。但一些研究表明，僅通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度，并不能使重組蛋白的產(chǎn)量提高到理想水平(Yoon SK, Song JY, Lee GM. Effect of low culture temperature on specific productivity, transcription level, and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 2003,82(3) J89-98)，這是因為降低培養(yǎng)溫度可提高目的蛋白的比生成率，但同時導致細胞增殖抑制，降低了細胞的相對數(shù)量，從而影響了目的蛋白產(chǎn)量的提高。而且溫度不僅僅是影響重組蛋白表達的唯一因素。因此，結(jié)合優(yōu)化培養(yǎng)溫度綜合考慮其它因素使重組蛋白高效表達是本領域技術人員一直期待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的申請人公開了一種高效表達重組蛋白的方法，其中重組蛋白為抗IgE單抗，本方法采用動物細胞流加培養(yǎng)方式，包括如下步驟(1)細胞培養(yǎng)溫度36°C -38°C, pH值6. 5-6. 9，培養(yǎng)M-48小時，當動物細胞生長至適當密度時補加流加培養(yǎng)基，進行流加培養(yǎng)；(2)細胞培養(yǎng)溫度降至32. 50C -350C，pH值7. 0-7. 3，進行流加培養(yǎng)；(3)停止流加，細胞培養(yǎng)溫度升至36°C -38°C，pH值7. 0-7. 3，進行培養(yǎng)。本發(fā)明選擇動物細胞流加培養(yǎng)方式進行重組蛋白的表達，并在流加培養(yǎng)的不同階段控制不同范圍的細胞培養(yǎng)溫度和PH值，通過增加單位體積的細胞數(shù)量和單個細胞的蛋白表達量以期達到重組蛋白高效表達的目的。培養(yǎng)溫度是影響重組蛋白生產(chǎn)的重要因素之一。大多數(shù)動物細胞適宜的生長溫度在37°C左右。在36°c-38°c的培養(yǎng)溫度下，動物細胞增殖速度很快。當溫度逐漸下降， 細胞的增殖速度也逐漸減慢，但細胞表達重組蛋白的比生成率則顯著提高。因此，細胞在 360C _38°C下處于生長期，以細胞增殖為主；而在32. 5°C _35°C下，細胞增殖受到抑制，細胞處于維持期，此時以重組蛋白表達為主。pH值的變化是培養(yǎng)環(huán)境及條件的另一個重要因素。一定范圍的pH環(huán)境將有利于細胞的生長。大多數(shù)動物細胞的適宜PH為6. 8-7. 4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。對于同一種細胞.生長期和維持期最適PH也不盡相同。對大多數(shù)細胞來說，偏酸環(huán)境更利于生長.而偏堿環(huán)境更利于維持。本發(fā)明方法采用三段法。第一階段，即流加培養(yǎng)過程步驟(1)中，細胞培養(yǎng)環(huán)境溫度36°C -38pH值
6.5-6. 9。此時的細胞處于旺盛的生長期，選擇偏酸的培養(yǎng)環(huán)境還有利于減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，如乳酸累積。培養(yǎng)M-48小時，當細胞生長至適當密度時通過補加流加培養(yǎng)基，讓細胞繼續(xù)充分生長。第二階段，即流加培養(yǎng)過程步驟O)中，細胞培養(yǎng)環(huán)境溫度32. 5°C -35pH值 7.0-7.3。此時的細胞進入維持期，細胞以表達重組蛋白為主。此時選擇一定的流加稀釋率和流加時間，盡量使單個細胞的重組蛋白得到充分表達。第三階段，即流加培養(yǎng)過程步驟(3)中，細胞培養(yǎng)環(huán)境溫度36°C -38pH值
7.0-7. 3。此時的細胞接近生長末期，停止添加流加培養(yǎng)基，再培養(yǎng)一段時間使細胞在適宜的溫度下繼續(xù)生長，并完成蛋白表達的最后過程。經(jīng)過以上步驟，于合適的時間收集上清，經(jīng)檢測重組蛋白的產(chǎn)量得到顯著提高。本發(fā)明選擇流加培養(yǎng)方式培養(yǎng)動物細胞，通過生物反應器電加熱系統(tǒng)控制培養(yǎng)溫度，并通過向生物反應器中通入(X)2氣體使PH值下降或者加入NaHCO3溶液使pH值上升。 除了溫度和PH值以外的其他培養(yǎng)條件采用本領域的常規(guī)做法。本發(fā)明與CN 200510011774.5(發(fā)明名稱為一種高效表達目的蛋白的方法)公開的細胞兩階段培養(yǎng)方法相比較，在細胞大規(guī)模培養(yǎng)(50升及以上規(guī)模)生產(chǎn)重組蛋白方面， 本發(fā)明三段法的蛋白表達量高于對比文獻兩段法的蛋白表達量30%以上，對于重組蛋白藥物產(chǎn)業(yè)化更具有實際意義。本發(fā)明利用動物細胞的生長特點，通過改變溫度和pH值達到提高重組蛋白產(chǎn)量的目的。該方法的優(yōu)點在于操作簡便，容易實施，在提高蛋白產(chǎn)量的同時不提高成本，適合于大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)，尤其是應用于生產(chǎn)各類生物活性物質(zhì)如單克隆抗體、融合蛋白以及各種基因重組蛋白質(zhì)。


圖1為本發(fā)明“三段法”表達抗IgE人源化單抗與對比文獻“兩段法”培養(yǎng)過程中的細胞生長比較圖。圖2為本發(fā)明“三段法”表達抗IgE人源化單抗與對比文獻“兩段法”培養(yǎng)過程中的蛋白產(chǎn)量比較圖。
具體實施例方式以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例ICHO細胞“三段法”表達融合蛋白1.材料穩(wěn)定表達抗IgE人源化單抗的CHO細胞株(按照專利申請?zhí)?00710101487. 2， 發(fā)明名稱《重組抗人IGE單克隆抗體及其制備方法和用途》的中國專利申請中的方法制Excel 1325-PF培養(yǎng)基(美國JRH公司生產(chǎn))作為基礎培養(yǎng)基；Excell325-PF培養(yǎng)基中加入葡萄糖(濃度為60-90mmol/L)和谷氨酰胺(濃度為 5. 0-7. 8mmol/L)作為流加培養(yǎng)基。2.生物反應器Biostat D-50生物反應器(德國貝朗公司)。3. CHO細胞流加培養(yǎng)三段法(1)將穩(wěn)定表達抗IgE人源化單抗的CHO細胞株在第1天接種后以 5.0X105cells/ml于生物反應器中?？刂茰囟仍?7°C左右，上下浮動不超過1°C，pH值控制在6. 5-6. 9之間。培養(yǎng)48小時，當CHO細胞密度達到2. 0-3. 5X 106cells/ml時添加流加培養(yǎng)基，控制流加稀釋率為0. 1-0. 3/天，流加時間72小時。(2)降低培養(yǎng)溫度，將溫度控制在32. 50C -35°C，同時控制pH值7. 0-7. 3?？刂屏骷酉♂屄蕿?. 1-0. 2/天，流加時間120小時。(3)升高細胞培養(yǎng)溫度至36°C -38°C，pH值7. 0-7. 3。停止添加流加培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時。整個培養(yǎng)過程中反應器的攪拌轉(zhuǎn)速為50_60rpm，溶氧為40-50%空氣飽和度。4.本發(fā)明“三段法”與對比文獻“兩段法”進行比較(1) “兩段法”的CHO細胞培養(yǎng)方法第一階段將穩(wěn)定表達抗IgE人源化單抗的CHO細胞株在第1天接種后以 5.0X105cells/ml于生物反應器中，控制溫度在36. 5°C -37. 8°C, pH值控制在6. 8-7. 4，反應器的攪拌轉(zhuǎn)速為50-60rpm，溶氧為40-50%空氣飽和度。培養(yǎng)48小時后開始添加流加培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)環(huán)境控制流加稀釋率，流加時間72小時。第二階段將培養(yǎng)溫度降至25°C _32°C，繼續(xù)流加培養(yǎng)120小時，其他培養(yǎng)條件不變。停止添加流加培養(yǎng)基，再培養(yǎng)M小時。(2)本發(fā)明“三段法”與“兩段法”細胞密度的測定在用“三段法”與“兩段法”分別進行細胞培養(yǎng)的過程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11和12天，常規(guī)采用血球計數(shù)法檢測細胞密度，結(jié)果見附圖1。(3)本發(fā)明“三段法”與“兩段法”蛋白表達量的測定在用“三段法”與“兩段法”分別進行細胞培養(yǎng)的過程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11和12天，常規(guī)采用ELISA法，按照專利申請?zhí)?00710101487. 2，發(fā)明名稱《重組抗人IGE單克隆抗體及其制備方法和用途》的中國專利申請中的方法，檢測抗IgE人源化單抗的表達量，結(jié)果見附圖2。(4)本發(fā)明“三段法”與“兩段法”的比較結(jié)果細胞密度的比較兩種細胞培養(yǎng)方法中，從第1天到第5天，細胞均處于旺盛的生長期；在第5天，細胞生長達到最高峰；此后，細胞生長處于維持期，細胞生長速度減慢，細胞密度曲線呈現(xiàn)一個平臺期，但“三段法”的細胞密度明顯高于“兩段法”的細胞密度；在第 12天，細胞密度達到最低點，見附圖1。蛋白表達量的比較兩種細胞培養(yǎng)方法中，從第1天到第5天，蛋白表達量處于緩慢增長期；從第5天到第9天，蛋白表達量增長迅速；從第10天開始，“兩段法”的蛋白表達量增長趨于平緩，而“三段法”的蛋白表達量增長依然顯著；在第12天，“三段法”的蛋白表達量達到1. 02g/L，而“兩段法”的蛋白表達量為0. 71g/L，“三段法”的蛋白表達量提高 43. 66%，見附圖2。根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明提供的“三段法”由于在提高蛋白產(chǎn)量的同時不提高成本， 并且操作簡便、容易實施，更適合于大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)，尤其是可以應用于生產(chǎn)各類生物活性物質(zhì)如單克隆抗體、融合蛋白以及各種基因重組蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種高效表達重組蛋白的方法，其特征在于，所述重組蛋白為抗IgE單抗，所述方法采用動物細胞流加培養(yǎng)方式，包括如下步驟(1)細胞培養(yǎng)溫度36°C-38pH值6. 5-6. 9，培養(yǎng)M-48小時，當動物細胞生長至適當密度時補加流加培養(yǎng)基，進行流加培養(yǎng)；(2)細胞培養(yǎng)溫度降至32.5°C _35°C，pH值7. 0-7. 3，進行流加培養(yǎng)；(3)停止流加，細胞培養(yǎng)溫度升至36°C-38°C，pH值7. 0-7. 3，進行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的細胞適當密度為 2. 0-3. 5X106cells/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，流加稀釋率為0.1-0. 3/天，流加培養(yǎng)時間72-96小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，流加稀釋率為0.1-0. 2/天，流加培養(yǎng)時間120-144小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的培養(yǎng)時間為M-48小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的流加培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述的動物細胞是CHO細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效表達抗IgE單抗重組蛋白的方法。該方法選擇動物細胞流加培養(yǎng)方式進行重組蛋白的表達，并在流加培養(yǎng)的不同階段控制不同范圍的細胞培養(yǎng)溫度和pH值，以期達到重組蛋白高效表達的目的。本發(fā)明操作簡便，容易實施，在提高蛋白產(chǎn)量的同時不提高成本，適合于大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)。
文檔編號C12P21/08GK102329847SQ201010225400
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者侯盛, 寇庚, 李晶, 王皓, 胡輝 申請人:上海張江生物技術有限公司