專利名稱：一種紅曲霉及其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種紅曲霉及其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法與其 在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅曲色素是由紅曲霉屬的絲狀真菌合成的天然色素，是真菌的一種次級(jí)代謝產(chǎn) 物，不僅具有熱穩(wěn)定性好、蛋白著色力強(qiáng)、色調(diào)柔和和對(duì)酸堿穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，還具有可以提高 加工制品對(duì)光和熱、氧穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。紅曲色素屬于聚酮類色素，由6種結(jié)構(gòu)相近的成分組 成，其中，Ankaflavine 與 Monascin 為黃色素，Rubropunctatine 與 Monascorubrine 是橘 黃色素,Rubropunctamine與Monascorubramine為紅色素。紅曲色素是紅曲霉繁殖于大米 或其它糧食作物上的制品，中國早在六百多年前就已經(jīng)作為食品而生產(chǎn)，歷史悠久。與化學(xué) 合成色素相比，紅曲色素作為天然色素，一直以來被認(rèn)為安全性較高，已證明不含黃曲霉毒 素，而且急性毒性試驗(yàn)、安全性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)以及致突變性試驗(yàn)都無毒性，也無 致變作用。由于歷史的原因，目前我國紅曲生產(chǎn)仍然以傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵法為主，以大米為原 料，經(jīng)過浸米、蒸飯、冷卻后，接種紅曲霉種子，通過固體培養(yǎng)法(盒曲法)制取、制作繁瑣， 勞動(dòng)強(qiáng)度大；表層地面培養(yǎng)占地面積多，產(chǎn)量低；技術(shù)難度大，色價(jià)低(最高達(dá)1300U/g)，質(zhì) 量不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種紅曲霉。該紅 曲霉為高產(chǎn)紅曲色素的紅曲霉菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供上述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法。本發(fā)明的再一目的在于提供所述紅曲霉的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種紅曲霉，名稱為紅曲霉突變株 MAlOl (Monascus anka mutant ΜΑΙΟΙ)，于2010年6月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010139。所述紅曲霉突變株MAlOl以紅曲霉突變株ΜΥΜ2 (ΜΥΜ2于申請(qǐng)?zhí)枮?“200710032525. 3”、名稱為“紅曲霉突變株及其發(fā)酵得到黃色素的方法”的國家發(fā)明專利申 請(qǐng)中公開)為出發(fā)菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上重新誘變所得，菌落呈圓形、橙黃色、表面有 毛狀。所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，包含以下步驟(1)菌種活化將紅曲霉突變株MAlOl (Monascus anka mutant ΜΑΙΟΙ)接種于麥 芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基(在含糖濃度為質(zhì)量百分比10%的麥芽汁，加入的瓊脂為1. 5 2% (w/v))上，于29 32°C培養(yǎng)至菌落較密、菌落為橙黃或橙紅色；(2)種子液的制備將活化好的斜面種子接種于液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接 種量為5 IOX IO5個(gè)細(xì)胞/L、29 32°C、150 200r/min培養(yǎng)48 72h，使種子液有紅
3色產(chǎn)生，顏色中等，得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基的配方如下玉米粉30g/L，NaNO3 3g/ L, FeSO4 · 7H20 0. 01g/L, KH2PO4 4g/L，用水定容至 1000ml ；(3)固態(tài)發(fā)酵在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上接種步驟(2)制備得到的種子液，接種量按體 積計(jì)算，為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的8 16% ；于29 32°C、70 85%濕度下放置發(fā)酵，發(fā) 酵至培養(yǎng)基為橙紅色，發(fā)酵中期翻曲補(bǔ)水0 30% (v/w)，翻曲補(bǔ)水步驟應(yīng)在發(fā)酵中期(發(fā) 酵第4天到第7天)的24h內(nèi)完成；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米或玉米粒中的一種或者 兩種形成的混合物，初始含水量為40 60% (w/w)；步驟⑵中所述液體種子培養(yǎng)基的裝載量?jī)?yōu)選為培養(yǎng)容器容積的1/5 2/5 ；步驟(3)中所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為大米與玉米粒按質(zhì)量比1 1 5 1 (w/w)形成的混合物；步驟(3)中所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基特別優(yōu)選為大米與玉米粒按質(zhì)量比2 1 (w/w) 形成的混合物；步驟(3)中所述發(fā)酵的天數(shù)優(yōu)選為至少7天；特別優(yōu)選為7 13天；所述步驟(3)優(yōu)選為在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上接種步驟(2)制備得到的種子液，接種 量按體積計(jì)算，為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的9%;于29 32°C、80%濕度下傾放發(fā)酵12天，發(fā) 酵6天后翻曲補(bǔ)水20% (v/w)；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比2 l(w/ w)形成的混合物，初始含水量為50% (w/w) 0所述紅曲霉應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)色素。所述固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法可用于工業(yè)化生產(chǎn)色素。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明所述的紅曲霉突變株MAlOl為高產(chǎn)紅曲色素的菌株，是一株可以大規(guī) 模生產(chǎn)紅曲色素的優(yōu)良菌株。(2)本發(fā)明所述的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素工藝解決了原菌種不適合固態(tài)發(fā)酵的缺點(diǎn)，提 高了紅曲霉突變株MAlOl發(fā)酵色素的色價(jià)，而且可以同時(shí)產(chǎn)兩種色素(黃色素的平均色價(jià) 可達(dá)6600U/g以上，紅色素色價(jià)可達(dá)7300U/g以上的紅曲色素，色調(diào)平均值為0. 90)，紅曲黃 色素和紅曲紅色素同時(shí)達(dá)到高產(chǎn)，解決固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)量低、色價(jià)低、質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。


圖1是得到紅曲霉突變株MAlOl的流程圖。圖2是紅曲霉突變株MAlOl于不同的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的色素產(chǎn)量圖。圖3是固體發(fā)酵培養(yǎng)基中初始含水量對(duì)紅曲霉素突變株MYM12色素產(chǎn)量的影響 圖。圖4是在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種不同量的搖瓶種子對(duì)紅曲霉突變株MAlOl色素產(chǎn) 量的影響圖。圖5是不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲霉突變株MAlOl色素產(chǎn)量的影響圖。圖6是不同的中期補(bǔ)水量對(duì)紅曲霉素突變株MAlOl色素產(chǎn)量的影響圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限
實(shí)施例1(1)紅曲霉突變株MAlOl的獲得誘變的過程如圖1所示，描述如下A、孢子懸浮液制備紅曲霉突變株MYM2斜面種在31°C培養(yǎng)2 3天后，用5mL生 理鹽水沖洗菌種斜面，經(jīng)玻璃珠打散，無菌擦鏡紙過濾，制成含孢子1 X IO5個(gè)/mL懸浮液。B、誘變先進(jìn)行紫外誘變(18W紫外燈、距離30cm下照射45s，同時(shí)磁力攪拌，紅 光下涂平板后避光培養(yǎng))，再用硫酸二乙酯誘變(5mL孢子懸浮液，0. 4mL的硫酸二乙酯配 制成一定最終濃度，振蕩30min，然后加入硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，接著將孢子液涂布于含有 0. 05% (w/w)氯化鋰的平板中培養(yǎng)，挑選菌落大，顏色深的菌落傳代培養(yǎng)。得到較穩(wěn)定產(chǎn) 黃色素菌株后，再用亞硝基胍誘變，亞硝基胍誘變的具體過程為稱取50mg的亞硝基胍，用 2mL丙酮溶解，然后用水定容至10mL，配成5mg/mL濃度；將其加入菌懸液中，亞硝基胍最終 濃度為2. 0mg/mL，32°C充分振蕩處理30min，離心去上清液，然后用pH7. O的磷酸緩沖液等 梯度大量稀釋孢子沉淀以終止反應(yīng)。篩選方法由于誘變劑對(duì)菌體破壞極大，誘變后在平板上生長的菌落多為白色細(xì) 小的菌落。出現(xiàn)顏色較深、菌落面積較大的菌落時(shí)，即可挑選下來進(jìn)行傳代培養(yǎng)以檢測(cè)其產(chǎn) 色素的能力。然后選擇多次傳代培養(yǎng)后能保持色素高產(chǎn)的菌落，作為目的菌株。得到的高產(chǎn)色素的紅曲霉突變株為圓形菌落，表面有毛狀，初期為白色，斜面培養(yǎng) 兩天后呈橙黃色，將其命名為紅曲霉突變株MAlOl (Monascus ankamutant MA101)，于2010 年6月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010139。(2)將紅曲霉突變株MAlOl進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素，步驟如下①菌種活化將紅曲霉突變株MAlOl (Monascus anka mutant MA101)接種于麥芽 汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于29 32°C培養(yǎng)3天；②種子液的制備將活化好的種子接種于液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶 培養(yǎng)的條件為29 32°C、150 200r/min培養(yǎng)48 72h，得到種子；所述液體種子培養(yǎng) 基的配方如下玉米粉 30g/L, NaNO3 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 01g/L, KH2PO4 4g/L，用水定容至 1000ml ；③固態(tài)發(fā)酵于250mL三角瓶裝20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2ml步驟⑵制備得到 的搖瓶種子，于31°C、80%濕度下傾放發(fā)酵9天，培養(yǎng)中期(4.5d)翻曲補(bǔ)水20% (v/w)；所 述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米、玉米粒以及大米與玉米粒按質(zhì)量比1 1、2 1、3 1、4 1、 5 1混合得到的混合物，121°C滅菌15min，初始含水量均為50%。④色素的檢測(cè)將步驟(3)得到的紅曲霉固態(tài)發(fā)酵物進(jìn)行真空干燥分別取0. 500g 真空干燥好的樣品置于帶刻度的25mL具磨口塞試管中，加入70%乙醇至25mL，搖勻后放 入60°C水浴保溫萃取2h，取出冷卻，然后用同等濃度的乙醇溶液將濾液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用 2802S型紫外可見分光光度計(jì)在波長410nm下測(cè)定其0D410值，此值乘以稀釋倍數(shù)即為黃色 素色價(jià)；在510nm波長下測(cè)得0D510乘以稀釋倍數(shù)即為紅色素色價(jià)。結(jié)果如圖2所示。從圖2中可看出當(dāng)大米玉米粒為2 1時(shí)，得到的紅曲色素色價(jià)最高，黃色素色 價(jià)達(dá)到3532U/g、紅色素色價(jià)達(dá)到3286U/g。實(shí)施例2
5
(1)菌種活化同實(shí)施例1步驟(2)①；(2)種子液的制備同實(shí)施例1步驟⑵②；(3)固態(tài)發(fā)酵于250mL三角瓶裝20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2ml步驟(2)制備得 到的搖瓶種子，于31°C、80%濕度下傾放發(fā)酵9天，培養(yǎng)中期翻曲補(bǔ)水20% ；所述的固體發(fā) 酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比2 1混合得到的混合物，121°C滅菌15min，初始含水量 分別為 40%、45%、50%、55%、60% (v/w)。(4)色素的檢測(cè)同實(shí)施例1步驟(2)④。結(jié)果如圖3所示。從圖3中可看出當(dāng)初始含水量為50%時(shí)，得到的紅曲色素色價(jià)最高，黃色素色價(jià) 達(dá)到5525U/g，紅色素色價(jià)達(dá)到6232U/g。實(shí)施例3(1)菌種活化同實(shí)施例1步驟(2)①；(2)種子液的制備同實(shí)施例1步驟⑵②；(3)固態(tài)發(fā)酵于250mL三角瓶裝20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種步驟(2)制備得到的 搖瓶種子，接種量分別為1. 6ml、2ml、2. 4ml,2. 8ml,3. 2ml，于31°C、80%濕度下傾放發(fā)酵9 天，培養(yǎng)中期(4.5d)翻曲補(bǔ)水20% (v/w)；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量 比2 1混合得到的混合物，121°C滅菌15min，初始含水量分別為50% (w/w)。(4)色素的檢測(cè)同實(shí)施例1步驟(2)④。結(jié)果如圖4所示。從圖4中可看出當(dāng)接種量2. 4ml時(shí)，色素色價(jià)最高，黃色素色價(jià)為4992U/g、紅色素 色價(jià)為5516U/g。實(shí)施例4(1)菌種活化同實(shí)施例1步驟(2)①；(2)種子液的制備同實(shí)施例1步驟⑵②；(3)固態(tài)發(fā)酵于250mL三角瓶裝20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2ml步驟⑵制備得 到的搖瓶種子，于31°C、80%濕度下傾放發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間分別為8d、9d、10d、lld、12d、13d、 14d、15d，培養(yǎng)中期翻曲補(bǔ)水20% (v/w)；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比 2 1混合得到的混合物，121°C滅菌15min，初始含水量分別為50% (w/w)。(4)色素的檢測(cè)同實(shí)施例1步驟(2)④。結(jié)果如圖5所示。從圖5中可看出紅曲色素色價(jià)在13d前隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，而且增長速 度接近線性；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于13d時(shí)，紅曲色素色價(jià)不再增加，維持在5500U/g以上。實(shí)施例5(1)菌種活化同實(shí)施例1步驟(2)①；(2)種子液的制備同實(shí)施例1步驟⑵②；(3)固態(tài)發(fā)酵于250mL三角瓶裝20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2ml步驟⑵制備得 到的搖瓶種子，于31°C、80%濕度下傾放發(fā)酵9天，培養(yǎng)中期(4 5d)翻曲分別補(bǔ)水0%、 5%U0%U5%,20%,25%,30% (v/w)；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比 2 1混合得到的混合物，121°C滅菌15min，初始含水量分別為50% (w/w)。(4)色素的檢測(cè)同實(shí)施例1步驟(2)④。結(jié)果如圖6所示。從圖6中可看出，當(dāng)中期補(bǔ)水量為15% (v/w)時(shí)，紅曲色素色價(jià)達(dá)到最大值，黃色 素色價(jià)為2852U/g，紅色素色價(jià)為3298U/g。
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實(shí)施例6(1)菌種活化同實(shí)施例1步驟(2)①；(2)種子液的制備同實(shí)施例1步驟⑵②；(3)固態(tài)發(fā)酵于250mL三角瓶裝20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為 大米與玉米粒按質(zhì)量比2 1混合得到的混合物，121°C滅菌15min。發(fā)酵條件含水量45% (w/w)、培養(yǎng)時(shí)間12d、中期補(bǔ)水量15% (v/w)、接種量9% (v/w)。(4)色素的檢測(cè)同實(shí)施例1步驟(2)④。結(jié)果黃色素色價(jià)為6656U/g，紅色素色價(jià)為7371U/g，色調(diào)為0.90左右。另外，紅 曲霉突變株MAlOl在固態(tài)發(fā)酵的條件下，其紅曲黃色素和紅曲紅色素能同時(shí)達(dá)到高產(chǎn)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種紅曲霉，其特征在于所述紅曲霉為紅曲霉突變株MA101(Monascusanka mutant MA101)，于2010年6月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010139。
2.權(quán)利要求1所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于包含以下步驟(1)菌種活化將紅曲霉突變株MAlOl接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于29 32°C 培養(yǎng)至菌落為橙黃或橙紅色；所述麥芽汁瓊脂為在含糖濃度為質(zhì)量百分比10%的麥芽汁 中加入質(zhì)量體積比1. 5 2%的瓊脂即得；(2)種子液的制備將活化好的斜面種子接種于液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接種量 為5 IOX IO5個(gè)細(xì)胞/1,29 32°C、150 200r/min培養(yǎng)48 72h，使種子液有紅色產(chǎn) 生，得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基的配方如下玉米粉30g/L，NaNO3 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 01g/L，KH2PO4 4g/L，用水定容至 1000ml ；(3)固態(tài)發(fā)酵在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上接種步驟(2)制備得到的種子液，接種量按體積 計(jì)算，為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的8 16% ；于29 32°C、70 85%濕度下放置發(fā)酵，發(fā)酵 至培養(yǎng)基為橙紅色，發(fā)酵中期翻曲補(bǔ)水體積質(zhì)量百分比0 30%，翻曲補(bǔ)水步驟應(yīng)在發(fā)酵 中期的24h內(nèi)完成；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米或玉米粒中的一種或者兩種形成的混合 物，初始含水量為質(zhì)量百分比40 60%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于步驟(2)中所述 液體種子培養(yǎng)基的使用體積為培養(yǎng)容器容積的1/5 2/5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于步驟(3)中所述 的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比11 51形成的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于步驟(3)中所述 的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比21形成的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于步驟(3)中所述 發(fā)酵的天數(shù)為至少7天。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于步驟(3)中所述 發(fā)酵的天數(shù)為7 13天。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法，其特征在于所述步驟(3)為 在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上接種步驟(2)制備得到的種子液，接種量按體積計(jì)算，為固態(tài)發(fā)酵培 養(yǎng)基質(zhì)量的9% ；于29 32°C、80%濕度下傾放發(fā)酵12天，發(fā)酵6天后翻曲補(bǔ)水體積質(zhì)量 百分比20% ；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為大米與玉米粒按質(zhì)量比2 1形成的混合物，初始 含水量為質(zhì)量百分比50%。
9.權(quán)利要求1所述的紅曲霉應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)色素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅曲霉及其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法和應(yīng)用。該紅曲霉為紅曲霉突變株MA101，于2010年6月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC M 2010139，是一株可大規(guī)模生產(chǎn)紅曲色素的優(yōu)良菌株。本發(fā)明的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法為首先在麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)MA101，再將斜面活化好的種子接種于液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，然后用搖瓶培養(yǎng)得到的種子接著于由大米或玉米粒中的一種或者兩種形成的混合物上，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵周期為7～13天。該固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素方法解決了原菌種不適合固態(tài)發(fā)酵的缺點(diǎn)，突變株MA101大幅度提高了固態(tài)發(fā)酵色素的色價(jià)，使紅曲黃色素和紅曲紅色素同時(shí)達(dá)到高產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P1/02GK101914453SQ20101022686
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者吳振強(qiáng), 夏楓耿, 梁淑娃, 程哲灝 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)