專利名稱：用Rahnella sp.PJT09菌株生產(chǎn)的果聚糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物技術(shù)
背景技術(shù)：
果聚糖是由以β_(2，6)_鍵和β _(2，1)-鍵連接的呋喃果糖基組成的同多糖。第一屆國際性果聚糖學(xué)術(shù)會(huì)議規(guī)定，凡組成以果糖為主且含有一個(gè)以上果糖單體的碳水化合物聚合體稱為果聚糖。根據(jù)連接鍵的不同，分為兩種類型菊粉型果聚糖(inulin-type)， 是由β _(2，1)-鍵連接的呋喃果糖組成；另一種為Ievan果聚糖(levan-type)，又稱為左聚糖，是由β_(2，6)_鍵連接D-呋喃果糖基連接形成的線狀結(jié)構(gòu)，也有一些β-(2， 1)鍵連接的分支結(jié)構(gòu)。已報(bào)告的levan型果聚糖在分子的一個(gè)末端都有葡萄糖基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)為G-F-F(n)。Levan型果聚糖主要來源于微生物，由微生物果聚糖合成酶合成，尤其是高分子量的果聚糖更多的是由微生物生產(chǎn)的。目前，報(bào)道的果聚糖的微生物來源主要有環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、產(chǎn)果聚糖氣桿菌(Aerobacterlevanicum)、 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)、鏈球菌(Mi^ptococcus)、多黏芽孢桿菌 (Bacilluspolymyxa)、鹽單胞菌(Halomonas)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomoas mobilis)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、酉乍酸菌 (Gluconoacetobacterxy 1 inus)、產(chǎn)左聚糖微桿菌(Microbacterium laevaniformans)、角軍淀粉歐文菌(Erwinia amylovora)、假單胞菌(I^seudomonas syringae)。與植物果聚糖相比，微生物來源的果聚糖具有生產(chǎn)周期短、不受氣候和地理環(huán)境條件限制和生理活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。果聚糖及其衍生物因具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和較強(qiáng)的增強(qiáng)免疫、抗輻射、降低血脂的生物活性而被廣泛地應(yīng)用于食品醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化妝品和食品等工業(yè)中，因此，對(duì)果聚糖的研究具有重要的意義和價(jià)值。中國發(fā)明專利報(bào)告了用Cellulomonas sp. nov. GJT07菌株生產(chǎn)果聚糖，涉及一種能產(chǎn)生果聚糖的微生物Cellulomonas sp. nov. GJT07以及利用該菌株生產(chǎn)果聚糖的方法。此發(fā)明從果園土壤中分離純化出的細(xì)菌Cellulomonas sp. nov. GJT07具有產(chǎn)生重均分子量為720kDa果聚糖的特性。在我國已投入工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖產(chǎn)品只有葡聚糖(Glucan)、黃原膠(Xanthan gum)、結(jié)冷膠(Gellan gum)、熱凝多糖(Curdlan)和透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)等少數(shù)幾個(gè)品種，而且產(chǎn)量不足我國市場需求的1/3，大部分需要依靠進(jìn)口。因此，篩選產(chǎn)糖性狀優(yōu)良的菌株，開發(fā)新的具有工業(yè)化生產(chǎn)潛力的微生物多糖是促進(jìn)我國多糖工業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。本研究涉及的拉恩氏菌屬(Rahnella)只有一個(gè)種，為水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)是拉恩氏菌屬的模式種。水生拉恩氏菌通過胞外酶法合成的方式產(chǎn)生果聚糖，即首先克隆菌體產(chǎn)生的果聚糖蔗糖酶的基因，將其在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，以無細(xì)胞培養(yǎng)合成果聚糖。本發(fā)明所用的菌株經(jīng)16sRNA比對(duì)和生理生化鑒定為不同于Rahnella aquatilis 的菌種，命名為=Rahnella sp. PJT09
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能產(chǎn)生果聚糖的微生物Rahnella sp. PJT09以及利用該菌株生產(chǎn)均一分子量的果聚糖的方法。本發(fā)明分離純化出一株來源于一種分離于大型真菌子實(shí)體的細(xì)菌Rahnella sp. PJT09，其具有產(chǎn)生果聚糖的特性。采用革蘭氏染色、莢膜、鞭毛、運(yùn)動(dòng)性觀察等形態(tài)學(xué)觀察作為菌種的初步鑒定，然后根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定。通過16SrDNA基因測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定結(jié)果為Rahnella菌屬。但其形態(tài)和生理生化特征與水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)相比有所不同。命名該菌株為Rahnella sp.PJT09。菌種保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。 地址中國武漢，武漢大學(xué)。保藏日期為2009年10月四日，保藏號(hào)為M209M2。經(jīng)GPC測定得到該多糖重均分子量為320kDa，采用13C-NMR對(duì)拉恩氏菌Rahnella sp. PJT09產(chǎn)生的胞外多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，確定為線形β _(2，6)-D-Fruf (Ievan型果聚糖)。


圖1 菌株P(guān)JT09進(jìn)化樹分析 2 =Rahnella sp. PJT09 果聚糖的 S印hacryl S-300HR 柱層析圖譜圖3 =Rahnella sp. PJT09 產(chǎn)生果聚糖的 13C-NMR 圖譜
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是通過以下技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)的1、菌種分離鑒定將大型真菌樣品，加入到裝有25ml富集培養(yǎng)基的三角瓶中， 30°C,160r/min搖瓶培養(yǎng)48h。然后將富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水10倍稀釋后，取0. 2ml 涂布分離培養(yǎng)基平板。30°C倒置培養(yǎng)48h，獲得在平板上有粘稠透明外觀的菌落，得到能產(chǎn)胞外多糖的細(xì)菌。富集培養(yǎng)基由蔗糖2g，酵母膏3g，NaN03 lg, K2HP04 0. 5g, MgS04 0. 5g, NH4C10. 5g, FeS04 0. Olg組成，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH7. 5 ；分離培養(yǎng)基由蔗糖10g，酵母膏 3g，NaN03 lg，K2HP04 0. 5g，MgS04 0. 5g, NH4C1 0. 5g，F(xiàn)eS04 0. Olg，瓊脂 15g 組成，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH7. 5。按常規(guī)方法對(duì)菌株進(jìn)行16SrDNA基因測序，將測序結(jié)果與Genebank 中拉恩氏菌(Rahnella sp.)的序列進(jìn)行比對(duì)相似度最高。通過進(jìn)化樹分析(見附圖1)， 確定實(shí)驗(yàn)菌種為拉恩氏菌Rahnella。由于該菌株形態(tài)和生理生化特征與水生拉恩氏菌 (Rahnellaaquatilis)相比有所不同(如表1)，因此命名該菌株為Rahnella sp. PJT09。菌種保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。地址中國武漢，武漢大學(xué)。保藏日期為2009年 10月29日，保藏號(hào)為M209M2。表IRahnella sp. PJT09菌株與水生拉恩氏菌生化特征差異對(duì)比
生化試驗(yàn)生拉恩氏菌 Rahnella sp. PJT09 _ __ —_ ^ Rahnella aquatilis__ ____ _ __
——n———————————...—...-…――^“―D-阿拉伯糖醇
棉籽糖 D-木糖
丙二酸利用
+ + + +
2、拉恩氏菌Rahnella sp. PJT09胞外多糖的生產(chǎn)方法其特征在于培養(yǎng)基組分、 發(fā)酵條件、制備方法以及所得胞外多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)糖培養(yǎng)基組分(g/L)蔗糖40，酵母膏 5，NaCl 1. 5，ZnCl2O. 3，K2HPO4I0發(fā)酵條件裝液量為每250mL三角瓶裝IOOmL培養(yǎng)基，接種量為3% (v/v)，初始pH 值為 6. 0，28 °C，160r/min 培養(yǎng) 70h。生產(chǎn)步驟(1)菌種活化將保存菌種接于PDA斜面培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)24h后，保存在4°C冰箱備用。(2)接種培養(yǎng)制備種子液種子液培養(yǎng)基組分為(g/L)蔗糖20，酵母膏2. 5， K2HPO4I, pH 7. 2，裝液量每250mL裝75mL培養(yǎng)基。將步驟(1)中的PDA斜面菌種接種于種子液培養(yǎng)基，于搖床培養(yǎng)2d，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為160r/min。(3)產(chǎn)糖培養(yǎng)基與產(chǎn)糖培養(yǎng)產(chǎn)糖培養(yǎng)基組分與含量為(g/L)蔗糖40，酵母膏5， NaCl 1. 5,ZnCl2O. 3，Κ2ΗΡ041，ρΗ值為6. 0。將步驟(2)發(fā)酵好的種子液以3% (ν/ν)接種量接種于產(chǎn)糖培養(yǎng)基，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)條件為裝液量為250mL三角瓶裝IOOmL培養(yǎng)基， 接種量為 3% &八)，281，16017/1^11培養(yǎng)7011。(4)多糖的制備將步驟(3)得到的發(fā)酵培養(yǎng)物3600rpm離心5min離心去除菌體后，將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/2，再將pH調(diào)至8，最后用2倍95%乙醇沉淀，在4°C冰箱內(nèi)靜置過夜，3600rpm離心IOmin得到白色沉淀，沉淀溶于水，將得到的復(fù)溶液3600rpm 離心lOmin，除去不溶物。復(fù)溶液再次沉淀多糖，沉淀用無水乙醇洗兩次，即得Rahnella sp. PJT09生產(chǎn)的果聚糖。3、多糖鑒定(1)多糖純度鑒定稱取50mg，溶于IL蒸餾水使其溶解，3600r/min離心lOmin，取上清液0. 5mL過kphacryl S-300HR凝膠層析，用超純水洗脫，流速0. 4mL/min。經(jīng)自動(dòng)部分收集器收集后，各層析組分用苯酚-硫酸法檢測糖分布，并以管號(hào)對(duì)OD49tlnm值作圖。結(jié)果表明產(chǎn)品為均一正態(tài)峰，即為局均一分子量片段的多糖。(見附圖2)(2)多糖分子量測定采用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeationchromatography, HPGPC)測定分子量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品Dextran (重均分子量為lOOkDa，50kDa, 20kDa, 5kDa, Sigma)，加超純水配成5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPGPC分析軟件以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPGPC操作條件儀器高效液相色譜儀Agilent 1100型；凝膠柱 Shodex0HpakSB-806 (日本 shodex 公司)；流動(dòng)相0· 02% NaN3-水；流速0. 5mL/min ；檢測器示差折光檢測器(RI)；溫度35°C ；進(jìn)樣量20 μ L。采用GPC測定多糖分子量，結(jié)果為 320kDa。(3)多糖結(jié)構(gòu)鑒定將30mg P09多糖樣品用1. OmL 99% D2O溶解，置于核磁管內(nèi)， 加入一滴丙酮作為內(nèi)標(biāo)。在23°C下，采用JEOL JNM-ECP 600核磁共振波譜儀，測定13C-NMR 譜圖(見附圖3)。通過圖譜分析及文獻(xiàn)比對(duì)，Rahnella sp. PJT09胞外多糖為β-(2， 6)-Fruf (levari 型果聚糖)。
權(quán)利要求
1.一種Rahnella sp. PJT09菌株，該菌種保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。地址 中國武漢，武漢大學(xué)。保藏日期為2009年10月四日，保藏號(hào)為M209M2。
2.Rahnella sp. PJT09菌株的遺傳標(biāo)志是16SrDNA核酸序列為 CACTTTTTCCCCTTAATCAAGTGGTATCGCCCTCCGAAGGTTAAAGCTACCTACTTCTTTT GCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCG TAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCC AATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGTTCGCTTCTCTTTGT ATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCAT CCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACATGACTCGCTG GCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACG AGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACTAAGCTATCTCT AGCGAATTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCA CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGT ACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAA CCTCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC CACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATT CCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAGACTCT AGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAA CAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTACGTCAATCGCTGC AGCTATT。
3.一種Rahnella sp. PJT09菌株產(chǎn)生的果聚糖，為其重均分子量為320kDa。
全文摘要
本發(fā)明分離純化出一株來源于一種分離于大型真菌子實(shí)體的細(xì)菌Rahnella sp.PJT09，其具有產(chǎn)生果聚糖的特性，該菌株具有營養(yǎng)要求簡單、易培養(yǎng)、性狀穩(wěn)定、產(chǎn)糖量高等特點(diǎn)。采用革蘭氏染色、莢膜、鞭毛、運(yùn)動(dòng)性觀察等形態(tài)學(xué)觀察作為菌種的初步鑒定，然后根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定。通過16SrDNA基因測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定結(jié)果為Rahnella菌屬。但其形態(tài)和生理生化特征與水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)相比有所不同。命名該菌株為Rahnella sp.PJT09。經(jīng)GPC測定得到該多糖重均分子量為320kDa，采用13C-NMR對(duì)拉恩氏菌Rahnella sp.PJT09產(chǎn)生的胞外多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，確定為線形β-(2，6)-D-Fruf(levan型果聚糖)。將本發(fā)明的Rahnella sp.PJT09菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃搖瓶培養(yǎng)70h后，產(chǎn)生重均分子量為320kDa的β-(2，6)-D-Fruf(屬于levan型果聚糖)，產(chǎn)量達(dá)20g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到64％。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102311931SQ20101022837
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者江曉路, 郭靜 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)