專利名稱：向日葵中由缺水條件和脫落酸誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子基因、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種向日葵(Helianthus annuus)中由缺水和脫落酸誘導(dǎo)的編碼轉(zhuǎn)錄 因子的新基因，該轉(zhuǎn)錄因子具有與亮氨酸拉鏈相關(guān)的同源域。在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或植物的DNA 構(gòu)建體中克隆該轉(zhuǎn)錄因子是有利的。包括該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)如缺水脅迫和高鹽的 不利環(huán)境條件具有抗性。也提供了核酸啟動(dòng)序列及包括該序列的構(gòu)建體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基 因植物，其中該序列為水缺乏或脫落酸誘導(dǎo)的。
背景技術(shù)：
同源域?yàn)樵S多涉及發(fā)育過程的真核轉(zhuǎn)錄因子中出現(xiàn)的60個(gè)氨基酸的基元 (Gehring，Science 236，1245-1252，1987)。從包括真菌、哺乳動(dòng)物和植物的許多真核生 物中已經(jīng)分離得到含有同源框的基因(Gehring, W. J.，et al.，Annu. Rev. Biochem. 63, 487-526,1994)。根據(jù)同源域內(nèi)外的序列保守性和結(jié)構(gòu)可以將植物的同源框分為許多家 族(Chan，R. L.，et al. Biochim. Biophys. Acta 1442 (1)，1-19，1998)。這些家族之一的 成員具有獨(dú)特的特征因?yàn)樗鼈儼ㄅc一種涉及二聚作用的螺旋_螺旋結(jié)構(gòu)的亮氨酸拉 鏈相關(guān)的同源域，因此，其編碼稱為Hd-Zip的蛋白質(zhì)。Hd-Zip僅有效地結(jié)合二聚物形式 的 DNA(Sessa，G.，et al.，EMBO J. 12，3507—3517，1993 ；Palena C. M.，et al.，Biochem J. 341,81-87,1999) 0已提出這些蛋白可能涉及調(diào)控與植物對(duì)環(huán)境條件的應(yīng)答相關(guān)的發(fā)育 過程(Chan, R.L.，et al. Biochim. Biophys. Acta 1442 (1)，1-19，1998，Carabelli，Μ.，et al.，Plant J. 4，469-479，1993 ；Schena, Μ.，et al.，Genes Devel. 7，367-379，1993)。缺 水是植物所面對(duì)的最常見的環(huán)境脅迫之一。盡管許多種子耐受極度缺水，但是植物的生長 性部位卻極少為耐受性的。植物通過表達(dá)特異性的一系列基因而應(yīng)答水脅迫，這樣使其 適應(yīng)變化的環(huán)境條件(Bray，Ε. A. Trends Plant Sci. 2,48-54,1997 y Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki，K. Plant Physiol. 115，327-334，1997)。激素脫落酸(ABA)在這 些應(yīng)答的子系列應(yīng)答中起重要的作用(Shinozaki，K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. Plant Physiol. 115,327-334,1997 y Leung, J.and Giraudat, J.Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol.49，199—222，1998)。水脅迫耐受性和抗性所涉及的基因的啟動(dòng)區(qū)域的特征說明存在應(yīng)答ABA的元件， 即ABRE，和應(yīng)答干旱的元件，即DRE。S5derman等已經(jīng)公開了(描述)脫落酸和缺水誘導(dǎo)的阿布屬(Arabidopsis)基 因(兩種)ATHB-7 和 ATHB-6(SddermanE. et al. ,The Plant Journal 10:375-381,1996 and Soderman Ε. et al. Plant Molecular Biology 40 :1073-1083，1999)。作者沒有說明 這些基因的超表達(dá)提供缺水耐受性。US N0. 5，981，729公開了 一種由缺水和脫落酸誘導(dǎo)的、并且編碼擬南芥 (A. Thaliana)的轉(zhuǎn)錄因子的新基因。該專利并沒有公開任何關(guān)于攜帶本發(fā)明的基因、并且 抗水脅迫條件的轉(zhuǎn)基因植物的參考內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種分離的編碼轉(zhuǎn)錄因子Hahb-4、其功能性活性片段 或變異體的核酸分子，該分離的核酸分子具有SEQ IDNo. 1或其片段的核酸序列，其中，該核 酸分子源于向日葵(Helianthus annuus)，并且其可以為SEQ ID No. 2的mRNA或cDNA，其 中，該分子能夠結(jié)合5’ -CAAT(A/T)ATTG-3’ DNA序列或植物品種的干旱轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。本發(fā)明的另一目的是提供一種載體，該載體包括與選自包括SEQID No. 1、SEQ ID No. 2及其片段的組的核酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子，其中，該載體驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子 Hahb-4、其功能性活性片段或變異體的表達(dá)，并且其中所述轉(zhuǎn)錄因子Hahb-4、其功能性活性 片段或變異體能夠結(jié)合植物品種的干旱轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，其中，與該宿主細(xì)胞的野生型品種 相比，載體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)增加了細(xì)胞對(duì)如水脅迫的環(huán)境脅迫的耐受性。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的為提供一種被具有選自包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2及 其片段的組的序列的核酸分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其中，該核酸分子編碼轉(zhuǎn)錄因子 Hahb-4、其功能性活性片段或變異體，并且其中與該植物的野生型品種相比，該植物具有對(duì) 環(huán)境脅迫、如干旱、鹽、滲透性及其它、優(yōu)選對(duì)水脅迫的增強(qiáng)的耐受性，其中，通過轉(zhuǎn)錄因子 Hahb-4、其功能性活性片段或變異體和植物的干旱轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域結(jié)合，從而可以為單子葉、 雙子葉或任何其它農(nóng)業(yè)植物的植物是水脅迫耐受性的。本發(fā)明的再一目的為提供一種被具有選自包括SEQ ID No. 1、SEQID No. 2及其 片段的組的序列的核酸分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的植物種子，其中該核酸分子序列編碼轉(zhuǎn)錄因子 Hahb-4、其功能性活性片段或變異體。本發(fā)明的再一目的為提供一種被具有選自包括SEQ ID No. 1、SEQID No. 2及其片 段的組的序列的核酸分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中該核酸分子編碼轉(zhuǎn)錄因子Hahb-4、 其功能性活性片段或變異體，其中宿主細(xì)胞選自包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和動(dòng)物細(xì)胞的 組，優(yōu)選地，其為植物細(xì)胞。本發(fā)明的再一目的為提供一種生產(chǎn)水脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括 用選自包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2及其片段的組的核酸序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或細(xì) 胞系、并且將該細(xì)胞或細(xì)胞系再生為植株的步驟。本發(fā)明的另一目的為提供一種選自包括以下核酸分子的組的分離的核酸分子(a)具有核苷酸序列SEQ ID No. 3的核酸分子；(b)具有核苷酸序列SEQ ID No. 10的核酸分子；(c)具有SEQ ID No. 3的805 1221核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(d)具有SEQ ID No. 3的904 1221核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(e)具有SEQ ID No. 3的1011 1221核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(f)具有SEQ ID No. 3的15 622核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(g)具有SEQ ID No. 10的15 409核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(h)具有與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列的 核酸分子；和⑴具有至少150個(gè)核苷酸長度、和與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的 核酸分子具有至少80%的序列一致性的核酸分子，其中，所述核酸分子能夠促進(jìn)異源核酸
4分子在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織中的表達(dá)，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織選自包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物或 動(dòng)物細(xì)胞、胚胎組織、植物愈傷組織和植物種子的組。本發(fā)明的再一目的是提供一種含有選自包括以下核酸分子的組的第一核酸分子 的核酸構(gòu)建體(a)具有核苷酸序列SEQ ID No. 3的核酸分子；(b)具有核苷酸序列SEQ ID No. 10的核酸分子；(c)具有SEQ ID No. 3的805 1221核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(d)具有SEQ ID No. 3的904 1221核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(e)具有SEQ ID No. 3的1011 1221核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(f)具有SEQ ID No. 3的15 622核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(g)具有SEQ ID No. 10的15 409核苷酸的核苷酸序列的核酸分子；(h)具有與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列的 核酸分子；和⑴與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的核酸分子具有至少80%的同源 性或長度為至少150個(gè)核苷酸的核酸分子，其中，所述第一核酸分子可操作地連接于編碼 目的蛋白的第二核酸分子和3'非翻譯區(qū)域。優(yōu)選地，核酸分子為具有SEQ ID No.3或SEQ ID No. 10的啟動(dòng)子。并且，提供被至少上述構(gòu)建體之一穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植 物。本發(fā)明的再一目的為提供一種在宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種目的蛋白的方法，該方 法包括向宿主細(xì)胞中引入上述構(gòu)建體之一、并且使宿主細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白，其中該宿主細(xì) 胞選自包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和動(dòng)物細(xì)胞的組。本發(fā)明的再一目的為提供一種獲得表達(dá)至少一種目的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法， 該方法包括用上述核酸構(gòu)建體之一穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或細(xì)胞系、然后使該細(xì)胞或細(xì)胞系 再生為表達(dá)至少一種蛋白的完整的植株，其中，該轉(zhuǎn)基因植物選自包括單子葉和雙子葉植 物的組。本發(fā)明的再一目的為提供一種被至少一種上述構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物， 其中，目的蛋白為具有選自包括SEQ ID No. 1、SEQ IDNo. 2及其片段的組的核酸序列的轉(zhuǎn) 錄因子Hahb-4，并且其中植物選自包括單子葉和雙子葉植物的組，所述植物對(duì)如干旱、高 鹽、高滲透壓及其它的條件為環(huán)境脅迫耐受性的，優(yōu)選地，該植物對(duì)缺水具有抗性和耐受 性。最優(yōu)選地，通過轉(zhuǎn)錄因子Hahb-4、其功能性活性片段或變異體和植物的干旱轉(zhuǎn)錄調(diào)控 區(qū)域結(jié)合，從而該植物為水脅迫耐受性的，所述植物的干旱轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域?yàn)?’ -CAAT(AZT) ATTG-3，DNA 序列。結(jié)合附圖和說明，可以更好地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征及優(yōu)點(diǎn)。


通過以下附圖中的例子解釋本發(fā)明，其中圖1顯示了編碼本發(fā)明的向日葵Hahb-4的基因組序列。下面的核苷酸序列表示開 放閱讀框的推導(dǎo)蛋白序列。以紅色表示同源域；以粗體和下劃線表示亮氨酸拉鏈中的亮氨 酸。圖的下方顯示Hahb-4的Hd-Zip區(qū)域與Athb-U _6、7和12的Hd-Zip區(qū)域的一致性。
5陰影框表示相同的氨基酸。圖2a為表示了 RNA核糖探針(箭頭)的長度和極性、以及Hahb-4mRNA保護(hù)的區(qū) 域(+81 +429 ；陰影框)的Hahb-4 cDNA的示意圖。圖2b顯示了經(jīng)受不同處理的水脅迫誘導(dǎo)的Hahb-4的表達(dá)。如下處理4日齡的幼 苗:100μΜ的ABA，24小時(shí)；水脅迫，2小時(shí)；4 °C, 24小時(shí)；42°C，2小時(shí)；0. 5M甘露醇，4小 時(shí)。圖2c顯示了在不同器官處水脅迫2h所誘導(dǎo)的Hahb-4的表達(dá)，分析胚和干種子。圖3顯示了在根、莖和葉處的水脅迫誘導(dǎo)Hahb-4的時(shí)間依賴性。將幼苗進(jìn)行水脅 迫處理0. 5或lh，或者在Ih干旱處理后的不同時(shí)間再水化種子。相同的濾紙作為RNA加樣 和轉(zhuǎn)移的對(duì)照與rRNA探針雜交(下板)。圖4顯示了 Hahb-4對(duì)ABA應(yīng)答的時(shí)間依賴性。如各道所示，從未處理的、或用 100 μ M ABA處理不同時(shí)間的幼苗中分離總RNA(20 μ g)。在下板中，相同的濾紙作為RNA加 樣和轉(zhuǎn)移的對(duì)照與rRNA探針雜交。圖5顯示了在根、莖和葉處的水脅迫誘導(dǎo)Hahb-4的時(shí)間依賴性。由對(duì)照、30分鐘 (1)、60分鐘(2)或90分鐘(3)水脅迫處理的植株的不同器官制備RNA。相同的濾紙作為 RNA加樣和轉(zhuǎn)移的對(duì)照與rRNA探針雜交(右板)。圖6顯示了 ABA和水脅迫誘導(dǎo)特異性結(jié)合Hahb_4DNA靶序列的核蛋白的表達(dá)。道 0，僅DNA ；道1，對(duì)照植物；道2，ABA處理的植物；道3，水脅迫處理的植物；A和B表示使用 核提取物觀察到的兩種不同的遷移帶。圖7說明克隆處于CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼Hahb_4的cDNA所使用的 策略的圖。質(zhì)粒P35SHB4構(gòu)建于大腸桿菌(E.coli)中，然后其用于轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)的CV2260系。將具有包括處于CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下的Hahb-4 cDNA 的質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌命名為ATH4。BD和BI 右和左邊緣；Pnos 胭脂堿合成酶基因啟動(dòng) 子；Tnos 胭脂堿合成酶的終止序列；Knf 卡那霉素抗性基因；P35S :35ScaMV啟動(dòng)子，gus β-葡糖醛酸糖苷酶基因。圖8為說明以在4°C處理48小時(shí)后發(fā)芽植物的百分比(η = 22)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化 植物(黑色條帶)和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物(白色條帶)的發(fā)芽時(shí)間的圖。圖9為說明從自發(fā)芽起28天 33天時(shí)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物(黑色條帶)和非轉(zhuǎn)化 的對(duì)照植物(白色條帶)的以毫米測(cè)量的莖長度的圖。兩個(gè)末端條帶顯示了進(jìn)行水脅迫試 驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因植物的莖長，其中在對(duì)照植物的組中無存活苗。圖10為說明在植物，即非轉(zhuǎn)化植物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植物(黑色條帶)，的 發(fā)育過程中形成的長角果的量的柱狀圖。兩個(gè)末端條帶說明了經(jīng)受水脅迫試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因植 物的長角果的量，其中在對(duì)照植物的組中無存活苗。在周期結(jié)束時(shí)澆灌植物，并且一旦復(fù)原 時(shí)，記錄感興趣的參數(shù)。圖11為說明在50mM甘露醇存在下、在打破休眠后的不同時(shí)間發(fā)芽的非轉(zhuǎn)化的對(duì) 照植物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植物(黑色條帶)的百分率的柱狀圖。圖12為說明在200mM甘露醇存在下、在打破休眠后的不同時(shí)間發(fā)芽的非轉(zhuǎn)化對(duì)照 植物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植物(黑色條帶)的百分率的柱狀圖。圖13為說明在300mM甘露醇存在下、在打破休眠后的不同時(shí)間發(fā)芽的非轉(zhuǎn)化對(duì)照
6植物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植物(黑色條帶)的百分率的柱狀圖。圖14為說明在50mM NaCl存在下、在打破休眠后的不同時(shí)間發(fā)芽的非轉(zhuǎn)化對(duì)照植 物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植物(黑色條帶)的百分率的柱狀圖。圖15為說明在150mM NaCl存在下、在打破休眠后的不同時(shí)間發(fā)芽的非轉(zhuǎn)化對(duì)照 植物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植物(黑色條帶)的百分率的柱狀圖。圖16為說明在三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中的非轉(zhuǎn)化對(duì)照存活植物(白色條帶)和轉(zhuǎn)基因植 物(黑色植物)的百分率的柱狀圖。在第一個(gè)試驗(yàn)(1)中，當(dāng)植物成熟時(shí)(繁殖階段)發(fā) 生脅迫。在第二個(gè)試驗(yàn)(2)中，植物處于有利的生長階段(完全的瓣?duì)铙w)。在第三個(gè)試驗(yàn) (3)中，在發(fā)芽時(shí)發(fā)生脅迫。圖17顯示了對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植物的表型。(a)轉(zhuǎn)基因植物(第一和第二排)、和非 轉(zhuǎn)化植物(第三和第四排)的表型是可觀察的。在成熟時(shí)對(duì)這些植物進(jìn)行水脅迫處理、并 且在生命周期結(jié)束時(shí)再次澆灌。在b中，轉(zhuǎn)基因(左側(cè))和非轉(zhuǎn)化的(右側(cè))植物的表型 是可觀察的。這組植物在處于生長期時(shí)進(jìn)行水脅迫處理。在c中，自發(fā)芽時(shí)進(jìn)行水處理脅 迫、然后被再次澆灌的轉(zhuǎn)基因植物(左側(cè))和非轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物(右側(cè))的表型是可觀測(cè) 的。(d)在d中，顯示了在生長階段遭受極度干旱的轉(zhuǎn)基因植物的表型。圖18顯示了 Hahb-4基因的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，其中標(biāo)注了 TATA盒所對(duì)應(yīng) 的序列、應(yīng)答水脅迫/低溫的元件、ABRE區(qū)域和表示Myb和Myc的識(shí)別位點(diǎn)的序列。圖19為克隆Hahb-4啟動(dòng)子的多個(gè)片段所用的pBI 101.3載體的示意圖。表示了 β-葡糖醛酸糖苷酶基因，以及提供對(duì)大腸桿菌和根瘤農(nóng)桿菌中的卡那霉素抗性的基因。也 標(biāo)注了大腸桿菌和根瘤農(nóng)桿菌的復(fù)制起點(diǎn)。圖20顯示對(duì)比在分別攜帶0 -400序列(SEQ ID No. 3的805 1221核苷酸) (左側(cè))和0 -1015序列(小等位基因)(右側(cè))的啟動(dòng)子的構(gòu)建體的10日齡幼苗中、通 過gus基因的組織化學(xué)測(cè)定的表達(dá)水平的照片。圖21顯示在擬南芥的根中的gus的表達(dá)。(a)顯示在用0 -400的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化 的植物的20日齡的根中的gus基因的表達(dá)。(b)顯示在用0 -1015的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物 的20日齡的根中的gus基因的表達(dá)。(c)顯示在用0 -1015的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的10 日齡根中的gus基因的表達(dá)。圖22顯示用0 -400的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的20日齡幼苗中的ABA處理的效果。在左 側(cè)顯示對(duì)照植物，在右側(cè)顯示用ABA處理的幼苗。圖23顯示Hahb-4基因結(jié)構(gòu)的示意圖。上部大等位基因，下部小等位基因。顯 示啟動(dòng)區(qū)域的分離和重組質(zhì)粒的構(gòu)建、以及植物轉(zhuǎn)化所用的寡核苷酸。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在，詳細(xì)地說明本發(fā)明，新基因Hd-Zip的特征指相同的內(nèi)容，即對(duì)水脅迫條件 應(yīng)答的向日葵Hahb-4基因。在同源域中，Hahb-4顯示與擬南芥的兩種相關(guān)蛋白Athb_7和 Athb-12的部分同源性。蛋白Hahb-4具有位于緊鄰N末端的同源域。本發(fā)明公開了 cDNA文庫中的一個(gè)克隆。該克隆代表被命名為Hahb-4的Htd-Zip 家族的成員。通過PCR獲得5’和3’端所對(duì)應(yīng)的序列。通過該方法獲得全cDNA序列長 674bp (SEQ ID No. 2)，并且含有177個(gè)氨基酸的開放閱讀框(圖1)。
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對(duì)比被編碼的蛋白質(zhì)和其它Hd-Zip蛋白質(zhì)序列表明其可能屬于Hd-Zip蛋白質(zhì)的 亞家族I，該被編碼的蛋白與除Athb-7和Athb-12之外的該亞家族的其它成員在同源域內(nèi) 具有約50%相同的氨基酸，與Athb-7和Athb-12在該區(qū)域內(nèi)分別具有60%和53%的一致 性(圖1)。也值得注意的是Hahb-4同源域幾乎位于該蛋白的氨基末端(17 76氨基酸)。 因此，Hahb-4缺少Hd-Zip蛋白家族的其它成員中存在的與同源域的N-末端相鄰的酸性區(qū) 域。該特征也與Athb-7和Athb-12相同。為了研究Hahb-4基因的基因結(jié)構(gòu)，已用包括全 cDNA的多個(gè)寡核苷酸擴(kuò)增了基因組DNA (基因組DNA為SEQ ID No. 1)。在cDNA的381和 382核苷酸(氨基酸108和109)之間發(fā)現(xiàn)了 IOlbp的單內(nèi)含子。Northern斑點(diǎn)分析表明本發(fā)明的Hahb_4基因在處于控制的正常環(huán)境條件下生長 的向日葵中以極低的水平表達(dá)。從多種組織和發(fā)育階段提取的總RNA僅獲得微弱的信號(hào)。通過RNA酶保護(hù)(RNAse protection)分析在不同環(huán)境條件下(即水、滲透性、鹽、 寒冷、熱、和氧化脅迫)的Hahb-4的表達(dá)，RNA酶保護(hù)比Northern技術(shù)更靈敏(圖2)。圖 2b說明在處于正常條件下生長4日齡幼苗中沒有檢測(cè)到Hahb-4。然而，在水脅迫的種子中， 檢測(cè)到強(qiáng)信號(hào)。甘露醇也誘導(dǎo)Hahb-4表達(dá)，盡管表達(dá)水平較低，但是可能反應(yīng)由該化合物 導(dǎo)致的水活性的降低(圖2b)。用NaCl獲得相同的結(jié)果。由于ABA調(diào)節(jié)許多對(duì)水脅迫的應(yīng)答，因此也分析了該激素對(duì)表達(dá)的影響。如圖2b 所示，在用100 μ M ABA處理澆灌的幼苗24小時(shí)后，觀察誘導(dǎo)。使用10 μ M ABA也觀測(cè)到轉(zhuǎn) 錄水平的少量的、但顯著的提高。當(dāng)幼苗處于寒冷(4°C )或熱(42°C )脅迫條件時(shí)，沒有觀 察到可檢測(cè)的作用(圖2b)。這些結(jié)果說明水脅迫的效果是特異性的。圖2c說明在較老(21日齡)的植物的根、莖和葉處也觀察到了對(duì)水脅迫條件的應(yīng) 答。在植物的處于空氣中的部位處的誘導(dǎo)水平與在幼苗中觀測(cè)到的誘導(dǎo)水平相似。相反， 根部在水脅迫條件下表現(xiàn)相當(dāng)?shù)偷霓D(zhuǎn)錄水平。因?yàn)锳BA也參與涉及干旱過程的后期的胚發(fā)生過程中的種子發(fā)育，所以，分析向 日葵胚(授粉后20天)和干種子中的Hahb-4的轉(zhuǎn)錄水平。在RNA酶保護(hù)試驗(yàn)中沒有獲得 信號(hào)(圖2c)，這說明Hahb-4對(duì)水脅迫和ABA的應(yīng)答為發(fā)育的生長期的特征。在水脅迫條件下觀察到的高水平的誘導(dǎo)使能夠通過Northern實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)錄水平 的時(shí)間依賴性增加。圖3說明處于干旱的幼苗僅在30分鐘后就明顯提高其Hahb-4的轉(zhuǎn) 錄水平；在拒給水1小時(shí)后應(yīng)答達(dá)到最大值。在該時(shí)間后，沒有觀察到Hahb-4轉(zhuǎn)錄水平的 進(jìn)一步的增加。幼苗的再水化較緩慢地降低了 Hahb-4的轉(zhuǎn)錄水平，2小時(shí)后僅降低約50% (圖3，道4和5)。ABA處理的效果也是時(shí)間依賴性的。如圖4所示，在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到對(duì) ABA的應(yīng)答，并且在3 6h后達(dá)到最大值。之后，轉(zhuǎn)錄水平緩慢降低，但是在處理24h后，仍 非常高。在向日葵植物再水化后，本發(fā)明的高Hahb-4轉(zhuǎn)錄水平復(fù)原，因此，再次說明所述基 因參與對(duì)水脅迫的應(yīng)答。在水培生長3周的植物的不同器官處，Hahb-4對(duì)水脅迫的應(yīng)答也是快速的。在根 部，轉(zhuǎn)錄水平在脅迫處理60分鐘后達(dá)到最大值(圖5)。在葉和莖處，在更長時(shí)間的處理后，觀察到最大應(yīng)答。這可能與由根完成水脅迫的 初始感知的事實(shí)相關(guān)，根合成ABA，然后ABA轉(zhuǎn)移到植物的處于空氣中的部位。該結(jié)果結(jié)合 上述圖2 4中所顯示的結(jié)果最可能說明Hahb-4表達(dá)與處于水脅迫的植物中的內(nèi)源ABA 水平相關(guān)。
使用包括體外結(jié)合細(xì)菌中表達(dá)的Hahb-4的序列5' -CAAT (A/T) ATTG-3‘的合成 雙鏈寡核苷酸、通過電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assays)分 析向日葵的核中的結(jié)合蛋白質(zhì)的功能DNA的出現(xiàn)。以4日齡的幼苗制備的核提取物顯示不 同的遷移帶，這說明存在至少兩種不同的結(jié)合該序列的蛋白復(fù)合體(圖6)。兩種復(fù)合體的 量在以ABA處理的植物獲得的提取物中顯著地增加。相反，當(dāng)植物遭受水脅迫時(shí)，僅遷移較 慢的復(fù)合體增加。過量的相同的未標(biāo)記DNA使兩種復(fù)合體的形成幾乎完全停止，但是等量 的含有不結(jié)合Hahb-4的5’ -CACT (A/T)AGTG-3'序列的相似的DNA序列卻不能(圖6)。該 結(jié)果有力地說明在ABA存在時(shí)、或在水脅迫條件下，至少一種具有與Hahb-4相同的DNA結(jié) 合特異性的功能蛋白被合成、并運(yùn)送至核。僅在遭受水脅迫、或用ABA處理的植物中檢測(cè)到強(qiáng)的Hahb-4的表達(dá)。熱、寒冷和 氧化脅迫不誘導(dǎo)該表達(dá)。鹽和滲透處理僅產(chǎn)生Hahb-4轉(zhuǎn)錄水平的少量增加。當(dāng)再水化植 物時(shí)，水脅迫效果完全逆轉(zhuǎn)。這些特征說明本發(fā)明的Hahb-4表達(dá)直接應(yīng)答植物性細(xì)胞的含 水情況、以及該誘導(dǎo)并不是破壞或通常的脅迫的結(jié)果。如實(shí)施例3和圖7所示，為了獲得超表達(dá)本發(fā)明的向日葵Hahb-4的擬南芥的轉(zhuǎn)基 因植物，使用載體PBI121和“花浸蘸”法。結(jié)果，獲得許多轉(zhuǎn)基因植物的獨(dú)立系，其中使用特 異性寡核苷酸的PCR陽性反應(yīng)、在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長的植物為耐性或抗性。從 獲得的獨(dú)立系中選取轉(zhuǎn)基因(本發(fā)明的Hahb-4基因)穩(wěn)定表達(dá)的植株。結(jié)果，選擇純合系 F3分析表型。如圖8所示，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物相比，攜帶本發(fā)明的基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因 植株發(fā)芽較快。14小時(shí)后，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株與未轉(zhuǎn)化的植株的發(fā)芽率的比為 85% 58%。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的莖生長較慢，并且其最大高度為在相同條件下生長的 對(duì)照植物(提供正常的水獲得量-圖9)的高度的85%。而且，遭受水脅迫的轉(zhuǎn)基因植物與 具有正常水獲得量的轉(zhuǎn)基因植物達(dá)到相同的莖高，這說明水脅迫并不影響本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因 植物的莖生長(圖9)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物不僅耐受水脅迫，而且在缺水的條件下也能正 常生長，而在觀察的表型方面無重要的改變。形成的長角果的數(shù)量在野生型和轉(zhuǎn)基因植物之間沒有顯著地改變，而且，盡管花 梗縮短，但是該數(shù)目在轉(zhuǎn)基因植物中略高(圖10)。當(dāng)在水脅迫條件下生長的轉(zhuǎn)基因植物 與在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長的相同植物相比時(shí)，在遭受脅迫的轉(zhuǎn)基因植物形成長角果的數(shù)目較高 (圖10)。此外，如表1所示，根據(jù)本發(fā)明的被轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子的總重量比未轉(zhuǎn)化的對(duì) 照植物的種子的總重量高約15%。表 1
轉(zhuǎn)基因植物對(duì)照植物平均種子重0. 09640. 0803SD0.03500. 0224
9 由于Hahb-4產(chǎn)物起轉(zhuǎn)錄因子的作用、并且其在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)似乎受水的獲得 量或存在/缺乏調(diào)控，因此，已進(jìn)行測(cè)定超表達(dá)本發(fā)明的向日葵Hahb-4基因的轉(zhuǎn)化植物對(duì) 水脅迫的耐受性的研究。首先，在如甘露醇存在的模擬缺水的條件下、和其它產(chǎn)生鹽脅迫的條件下分析發(fā) 芽過程。圖11、12和13顯示了根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物與對(duì)照植物相比的發(fā)芽時(shí)間。甘露 醇的存在延遲了發(fā)芽。該效果在較高的碳水化合物的濃度時(shí)更明顯。然而，轉(zhuǎn)化的植物即 使在高濃度的甘露醇條件下也保持優(yōu)良的發(fā)芽率。當(dāng)在不同濃度的NaCl存在時(shí)進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)時(shí)，獲得的結(jié)果與甘露醇的情況相似。 如圖14和15所示，超表達(dá)Hahb-4使轉(zhuǎn)化的植物在鹽培養(yǎng)基中具有較高的發(fā)芽能力。值得注意的是被測(cè)試或試驗(yàn)的在不同脅迫條件下生長的轉(zhuǎn)基因植物的根大于對(duì) 照植物的根，這表示一種對(duì)許多脅迫條件都具有耐受性的表型。隨后，在多個(gè)土壤中培養(yǎng)的植物發(fā)育階段進(jìn)行干旱試驗(yàn)。圖16顯示了對(duì)水脅迫存 活的三個(gè)試驗(yàn)。清楚地，當(dāng)與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物相比時(shí)，觀察到了在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物中對(duì) 水脅迫具有較高耐受性。當(dāng)植物在不同發(fā)育階段遭受到水脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)化的植物表現(xiàn)較強(qiáng)的對(duì)脅迫條件的耐 受性。圖17顯示了在不同生長階段的遭受了缺水條件后的植物狀態(tài)。無論植物在任何階 段遭受水脅迫，攜帶本發(fā)明的Hahb-4基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)上述條件具有較強(qiáng)的耐受性和 抗性。簡言之，本發(fā)明公開了擬南芥轉(zhuǎn)化植物的獲得，該轉(zhuǎn)化植物超表達(dá)處于35S花椰 菜花葉病毒啟動(dòng)子的調(diào)控下的本發(fā)明的向日葵Hahb-4基因，即超表達(dá)如圖7所示的構(gòu)建 體。最初從向日葵中分離的本發(fā)明的基因編碼具有與亮氨酸拉鏈相關(guān)的同源域類型的蛋白 域的Hd-Zip蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可知可以使用任何驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的基因表達(dá)的 啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體，而并不改變本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。還可以制備使本發(fā)明的基因能夠 在如細(xì)菌、酵母、真菌、動(dòng)物和植物性細(xì)胞的任何宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸構(gòu)建體。在本發(fā)明 的優(yōu)選實(shí)施例中，基因在植物細(xì)胞和組織中表達(dá)。表達(dá)Hahb-4的轉(zhuǎn)化植物在正常生長條件下一般具有較短的莖。如組織學(xué)研究所 示，似乎這種特征主要是由于抑制細(xì)胞膨脹、但又沒有抑制細(xì)胞分裂。除上述論述外，與非轉(zhuǎn)化植物的成年葉片比，轉(zhuǎn)基因植物的成年葉片更圓、并且較 短。合并兩個(gè)特征似乎說明基因產(chǎn)物起細(xì)胞膨脹和伸長的抑制因子的作用。這些表型特征 (短莖和圓葉)作為“節(jié)水”機(jī)制應(yīng)該與轉(zhuǎn)基因植物的耐受和抵抗缺水或匱乏的能力直接相 關(guān)。相反，與未轉(zhuǎn)化的植物的根部相比本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的根較長。這應(yīng)該說明另一種 獲水的有利機(jī)制的出現(xiàn)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在不同的生長階段，在發(fā)芽階段以及在早期和末期生長階 段、以及在繁殖階段都表現(xiàn)顯著的水脅迫耐受性。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化的植物都遭受干 旱條件時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于在非轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物中所觀察到的存活率。通過所有這些結(jié)果，可以得出Hahb-4基因參與植物對(duì)水脅迫的應(yīng)答、以及其特異 性功能能夠產(chǎn)生增強(qiáng)植物對(duì)缺水的耐受性的表型改變。產(chǎn)量和發(fā)芽產(chǎn)生不利的影響。相反，轉(zhuǎn)基因植 物的種子產(chǎn)量(以重量測(cè)定)高于未轉(zhuǎn)化的植物的產(chǎn)量?？梢允褂帽景l(fā)明的Hahb-4生產(chǎn)具有商業(yè)利益的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物具有對(duì)水脅迫的特異耐受性?？梢灶A(yù)料所述的遭受水脅迫的具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的植物的產(chǎn)率 與未轉(zhuǎn)化的、并且未遭受該脅迫條件的品種的產(chǎn)率相同。作為例子，該具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的植物 可以包括向日葵、小麥、大麥、大豆、馬鈴薯、玉米、甘蔗或水稻，但并不限于此。值得重點(diǎn)注意的是當(dāng)植物遭受水脅迫時(shí)沒有大量的超表達(dá)的基因，并且沒有具體 的關(guān)于所述基因能夠如本發(fā)明的Hahb-4那樣使植物具有對(duì)干旱的耐受性。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)分離向日葵Hahb-4的啟動(dòng)區(qū)域的序列，并確定 其特征。使用在某一階段獲得的信息用于設(shè)計(jì)下一階段所用的新寡核苷酸對(duì)，通過反向 PCR(inverse PCR)技術(shù)以三個(gè)階段進(jìn)行Hahb-4啟動(dòng)區(qū)域的分離。將通過PCR反應(yīng)所獲得 的片段克隆到pGEM.-T easy載體(pGEM.-T easy vector) (Promega)上，并且通過交疊各 構(gòu)建體的重復(fù)區(qū)域而手工地測(cè)定啟動(dòng)區(qū)域的序列。Hahb-4啟動(dòng)子的序列(SEQ ID No. 3)對(duì)應(yīng)于1221bp序列，包括位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 的上游24bp處的TATA盒。該序列與數(shù)據(jù)庫中存在的序列的對(duì)比表明存在與被認(rèn)為參與對(duì) 多個(gè)環(huán)境因子，如光、脫落酸和激素的應(yīng)答的序列具有同源性的區(qū)域。作為例子，圖18顯示 了 ABRE型的假定的ABA應(yīng)答元件、以及DRE型的干旱脅迫或低溫應(yīng)答元件。也鑒定了聯(lián)合參與轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子的一致序列，如Myb和Myc 家族的蛋白質(zhì)(Abe et al.，Plant cell 9 1859-1868,1997 ；Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki，Plant Physol. 115 :327_334，1997，此處作為參考文獻(xiàn)而被包括)。分離和測(cè)序Hahb-4啟動(dòng)子后，尋找涉及驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的序列。特別地，提供器官 特異性和對(duì)水脅迫和ABA的存在應(yīng)答的序列。為此，在所述啟動(dòng)子的全序列或部分所述序 列的調(diào)控下，轉(zhuǎn)化具有包括報(bào)告基因(gus基因)的構(gòu)建體的擬南芥植株。將啟動(dòng)子的全序列克隆到一個(gè)構(gòu)建體上。為此，設(shè)計(jì)兩種與啟動(dòng)區(qū)域的末端雜交 的特異性寡核苷酸，并且在以向日葵基因組DNA作為模板的PCR反應(yīng)中使用這兩種特異性 寡核苷酸。作為擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，得到兩條約1000和1200bp的條帶。考慮到這些試驗(yàn)所 使用的生長材料是從雜交體(contiflor 15)中分離的，因此，出現(xiàn)兩條帶似乎說明基因組 中存在兩種不同的等位基因。將兩種PCR產(chǎn)物克隆到PGEM-Teasy載體(Promega)中。如實(shí)施例4所示，用限制 性內(nèi)切酶BamHI和HindIII切割PCR產(chǎn)物、并克隆到載體ρΒΙΙΟΙ. 3中(圖19)。獲得各包 括啟動(dòng)子的等位基因之一的兩個(gè)構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子等位基因驅(qū)動(dòng)gus基因的表達(dá)。然后，將包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的不同的啟動(dòng)子片段克隆到載體ρΒΙΙΟΙ. 3中。為了克 隆距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較遠(yuǎn)的啟動(dòng)子片段，使用修飾的PBI載體，該載體攜帶包括TATA盒的最 小的啟動(dòng)子(_90CaMV35S)。得到的克隆如下所述克隆416 被克隆到ρΒΙΙΟΙ. 3的Hindlll/BamHI上的啟動(dòng)子的含有O -400區(qū) 域的片段(從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上至IPCR4) (SEQ ID No. 4)?？寺?16包括SEQ ID No. 3的 第805 1221的核苷酸。克隆1015 被克隆到ρΒΙΙΟΙ. 3的Sall/BamHI處的含有以核苷酸IPCR10和 IPCR8(分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6)獲得的0 -1015啟動(dòng)子區(qū)域(小等位基因)
11的片段。克隆1221 被克隆到ρΒΙΙΟΙ. 3的Sall/BamHI處的含有以寡核苷酸IPCRlO和 IPCR8 (分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6)獲得的0 -1221啟動(dòng)子區(qū)域(大等位基因) 的片段?？寺?18 被克隆到ρΒΙΙΟΙ.3的Hindlll/BamHI處的含有啟動(dòng)子的由寡核苷酸 IPCR6/IPCR8 (SEQ ID No. 7/SEQ ID No. 6)擴(kuò)增的0 -300區(qū)域(從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上至 IPCR6 (SEQ ID No. 7))的片段?？寺?18包括SEQ ID No. 3的從904 1221的核苷酸?？寺?11 被克隆到ρΒΙΙΟΙ.3的Hindlll/BamHI處的含有啟動(dòng)子的由寡核苷酸 IPCR7/IPCR8 (SEQ ID No. 8/SEQ ID No. 6)擴(kuò)增的0 -211區(qū)域(從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上至 IPCR7 (SEQ ID No. 8))的片段。克隆211包括SEQ ID No. 3的從1011 1221的核苷酸?？寺?08:被克隆到具有最小啟動(dòng)子的pBI-90的SalI處的、5’啟動(dòng)子區(qū)域(用 IPCR5/IPCR10(SEQ ID No. 9/SEQ ID No. 5)擴(kuò)增)所對(duì)應(yīng)的608bp的片段(來自大等位基 因)。克隆608包括SEQ ID No. 3的從15 622的核苷酸?？寺?07:被克隆到具有最小啟動(dòng)子的pBI-90的SalI處的、5’啟動(dòng)子區(qū)域(用 IPCR5/IPCR10(SEQ ID No. 9/SEQ ID No. 5)擴(kuò)增)所對(duì)應(yīng)的407bp的片段(來自小等位基 因)?？寺?07包括SEQ ID No. 10的從15 409的核苷酸。然后，用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化擬南芥植株，選擇轉(zhuǎn)化的植株，并且挑選多個(gè)獨(dú)立系用于 在第三代中分離純合體子系。通過組織化學(xué)和熒光測(cè)定法，使用選擇的純合體植株確定 Hahb-4啟動(dòng)子的等位基因和不同區(qū)域的特性。啟動(dòng)子的0 -400區(qū)域足以驅(qū)動(dòng)gus基因在2天的發(fā)芽幼苗的子葉中表達(dá)。在 發(fā)芽10天的幼嫩幼苗中沒有檢測(cè)到該表達(dá)。當(dāng)使用包括小等位基因的完整片段的構(gòu)建體時(shí)，也觀察到gus基因在2天的發(fā)芽 幼苗的子葉中表達(dá)。然而，不同于0 -400區(qū)域，gus基因在嫩幼苗的葉和根部表達(dá)很強(qiáng) (圖20)。最后，在繁殖階段，沒有檢測(cè)到任何gus基因的表達(dá)。這些結(jié)果說明盡管在相同的器官發(fā)生表達(dá)，但是該表達(dá)的強(qiáng)度不同。雖然驅(qū)動(dòng)在 子葉和葉片中的特異性表達(dá)所必須序列為0 -400區(qū)域，但是在-400 -1015區(qū)域中可 能存在對(duì)于轉(zhuǎn)錄激活重要的序列。當(dāng)分析gus基因在轉(zhuǎn)基因植物的根部的表達(dá)時(shí)，已發(fā)現(xiàn)由0 -400構(gòu)建體驅(qū)動(dòng)的 20日齡植物的根部的表達(dá)在側(cè)根原基和在已發(fā)育的側(cè)根的中間區(qū)域持續(xù)較強(qiáng)。此外，發(fā)現(xiàn) 在用0 -400構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的根部，在維管柱細(xì)胞內(nèi)也檢測(cè)到了 gus基因的表 達(dá)(圖21)。發(fā)芽后10天，觀察到在所有主、側(cè)根部位的強(qiáng)表達(dá)，和在根基區(qū)域的更強(qiáng)的表 達(dá)(圖21c)。通過熒光測(cè)試法得到的結(jié)果說明包括全片段的構(gòu)建體具的啟動(dòng)活性比構(gòu)建體 0 -400的啟動(dòng)活性高10倍。并且，如圖22所示，ABA能夠誘導(dǎo)構(gòu)建體0 -400。對(duì)于以包括0 -300區(qū)域或0 -200區(qū)域的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的多個(gè)獨(dú)立系的 分析顯示gus基因在所有研究的器官中的在不同的發(fā)育階段都表達(dá)，并且ABA不誘導(dǎo)所述 啟動(dòng)區(qū)域。本發(fā)明的發(fā)明人也公開了僅出現(xiàn)一個(gè)打斷亮氨酸拉鏈編碼序列的區(qū)域的內(nèi)含子。 該內(nèi)含子長度為lOlbp，并且特異性地位于編碼亮氨酸拉鏈域的第六和第七七倍體(108和109氨基酸)的序列之間，并且對(duì)應(yīng)在其它生物的內(nèi)含子中出現(xiàn)的5’ -GT.......AG-3’規(guī)
則。該內(nèi)含子的位置和序列的示意圖如圖1所示。因此，本發(fā)明包括Hahb-4啟動(dòng)子(SEQ ID No. 1)和所述基因的cDNA(SEQ ID No. 2)，其中所述基因編碼向日葵的Hd-Zip家族的蛋白質(zhì)。該啟動(dòng)子具有兩個(gè)已被克隆和 測(cè)序的等位基因，等位基因在-900核苷酸周圍具有差異的或不保守的區(qū)域。大等位基因包 括1221bp的序列，小等位基因包括1015bp的序列(分別為SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 10)。啟動(dòng)子核苷酸序列的分析表明具有與參與多種環(huán)境因子，如光、脫落酸和激素應(yīng) 答的不同序列同源的區(qū)域。本發(fā)明的啟動(dòng)子包括通常命名為ABRE的假定的ABA應(yīng)答元件、 以及命名為DRE的對(duì)缺水或低溫產(chǎn)生的脅迫應(yīng)答的元件。也鑒定了連接涉及環(huán)境因子應(yīng)答 的轉(zhuǎn)錄因子的一致序列。當(dāng)分析本發(fā)明的啟動(dòng)子的不同區(qū)域的活性時(shí)，得到的結(jié)果說明盡管在轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)和上游的300個(gè)核苷酸之間具有兩個(gè)假定元件ABRE，但是，該片段不能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因gus 的活性，這說明盡管該片段是必須的，但是其不足以引發(fā)轉(zhuǎn)錄。相反，通過使用與位置+1相 鄰的第一個(gè)400個(gè)核苷酸，已觀察到在發(fā)芽2天后的子葉和根部的gus基因的表達(dá)。表達(dá) 不是很強(qiáng)，但是特異性的，并且能夠被ABA誘導(dǎo)。另一方面，啟動(dòng)區(qū)域的全片段產(chǎn)生至少比由0 -400片段產(chǎn)生的表達(dá)水平高10 倍的表達(dá)水平。反之，該表達(dá)在發(fā)育的較晚階段(發(fā)芽達(dá)20天的植物)和在根的中心區(qū)域 是明顯的?？梢允褂帽景l(fā)明的啟動(dòng)子(兩個(gè)等位基因)、其片段或部分驅(qū)動(dòng)任何目的基因的 表達(dá)。優(yōu)選地，可以在對(duì)于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞有用的核酸構(gòu)建體中使用本發(fā)明的啟動(dòng)子(兩個(gè) 等位基因或其片段)，其中所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)任何目的蛋白的表達(dá)。宿主細(xì)胞可以為細(xì)菌、酵 母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。也可以構(gòu)建載體，其中本發(fā)明的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的Hahb-4基因在植物細(xì)胞中 表達(dá)。所述構(gòu)建體對(duì)于獲得耐受水脅迫的轉(zhuǎn)基因植物是有用的。攜帶本發(fā)明的Hahb-4基 因和本發(fā)明的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物可以是包括向日葵、小麥、大麥、大豆、馬鈴薯、玉米、甘 蔗或水稻的經(jīng)濟(jì)作物。根據(jù)以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，但是這些實(shí)施例不限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。相反，必須清楚地理解本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明的說明書后可以提出許多 其它的實(shí)施方式、修飾和本發(fā)明的內(nèi)容等價(jià)的改變，而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和/或附加的 權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1 分離和確定為編碼屬于Hd-Zip I家族的蛋白質(zhì)的基因的向日葵中的新 基因Hahb-4Α.分離 Hahb-4 基因 cDNA為了分離含有同源框序列的部分cDNA克隆，如上所述(Gonzdlez and Chan, Trends in Genetics 9 :231_232，1993，此處作為參考文獻(xiàn)被引用)，使用在λ gtlO中構(gòu)建 的向日葵莖cDNA文庫的總DNA進(jìn)行基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的策略。通過使用XgtlO 測(cè)序引物和與cDNA序列的81 100核苷酸匹配的特異性引物H41 (5，-GGCGGATCCAACAGAA ACAACCACCAGG-3，(SEQ ID No. 11))的 PCR 獲得代表 Hahb-4 轉(zhuǎn)錄本的 3，端的序列(SEQ IDNo. 2 禾口圖 1)。根據(jù) Frohman (Frohman Cloning PCR products. In The Polymerase Chain Reaction, eds. K. B. Mullis, F. Fre, & R. A. Gibas, pages 14-37. Birkhauser, Boston, MA, USA, 1994，此處作為參考文獻(xiàn)被引用)，使用特異性寡核苷酸IPCRO 5，-GGCGGATCCCCTGGTG GTTGTTTCTGTT-3，(SEQ IDNo. 12)和引物 Qt 及 Qo (分別為 SEQ ID No. 13 禾Π 14)，對(duì)由遭受 水脅迫的向日葵莖的RNA和polyA進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，從而獲得轉(zhuǎn)錄本的5’ 端。B. Hahb-4基因組序列的分離根據(jù) Ochman、Ayala 禾口 Hartl (In Methods of Enzymology (ed R. ffu) Vol 218， pages 309-321. Academic Press, San Diego，CA. USA，1993)，使用反向 PCR 確定 Hagb-4 的5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域的特征。用Sau3A或HindII在控制的條件下部分消化向日葵的基因組 DNA。根據(jù)廠商的說明，在消化和純化后，在5U T4DNA連接酶(PromegaCorp.，Madison， WI,USA)存在下進(jìn)行過夜DNA環(huán)化。擴(kuò)增所使用的引物對(duì)為5’ -GGCGGATCCCCTGGTGGTTGTT TCTGTT-3，(SEQ ID No. 12)和 5，-GCCGAATTCAGATTGAGCAAGAGTATAAC-3，(SEQ ID No. 15)， 或 5，-ACCTTTATAAAGACCACTC-3，(SEQ ID No. 16)和 5，ACGCAATGGTGAGTTGTAC-3，(SEQ ID No. 17)。C. DNA序列分析將PCR 產(chǎn)物克隆到 pUC119 或 pGEM-Teasy (Promega Corp.)。使用 fmol 測(cè)序體系 (Promega Corp.)通過鏈終止法獲得插入體的序列。實(shí)施例2 說明缺水誘導(dǎo)Hahb-4的試騎A.植物材料、生長條件和水脅迫處理對(duì)向日葵(Helianthus annuus L.)(向日葵品種contifIor 15，來自阿根廷的 Balcarce的Zeneca ；或者品種Sunweed，來自法國里昂的Rhdne-Poulenc)種子進(jìn)行表面 消毒，并且在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙上生長4天。然后將幼苗轉(zhuǎn)移到含有Hoagland培養(yǎng)基的塑料 載體上，并一直生長至具有6個(gè)葉片(約3周)。通過將4日齡的幼苗轉(zhuǎn)移到具有干濾紙的 培養(yǎng)皿、或者將植物從溶液培養(yǎng)中取出而施加水脅迫。處理時(shí)間如圖所示。B. RNA酶保護(hù)分析對(duì)于RNA酶保護(hù)分析，根據(jù)廠商的說明(Boehringer Mannheim,Mannheim,德國)， 使用 T3 RNA 聚合酶和[32P] CTP 將上述制備的總 RNA (15 μ g) (Almoguera C.，et. al. ；Plant
molecular Biology 19 =781-792,1992)與通過體外轉(zhuǎn)錄合成的特異性Hahb-4 RNA探針雜 、-父。將包括+81和+429之間的編碼區(qū)所對(duì)應(yīng)的插入體的模板(圖1和SEQ ID No. 1) 克隆到pBlue-script SK-的Spel/BamHI位點(diǎn)。cDNA中不存在的BamHI位點(diǎn)源自上述的使 用寡核苷酸H41的擴(kuò)增。用EcoRI限制性消化該模板DNA，使含有63個(gè)載體的核苷酸(從 T3啟動(dòng)子至多位點(diǎn)接頭的SpeI位點(diǎn)，和從BamHI至EcoRI位點(diǎn))的411-核苷酸RNA探針 轉(zhuǎn)錄。以上描述了 RNA探針制備、雜交、使用RNA酶A消化、和被保護(hù)的RNA片段的隨后的 電泳分析的條件(Coca M :A :et. al. ；Plant Molecular Biology 31 :863_876，1996，此處 作為參考文獻(xiàn)被引用)。C. Northern 分析基本如Sambrook、Fritsch和Maniatis (1989)所述，使用甲酰胺和甲醛變性總
14RNA(20yg)，在1.5% (w/v)的瓊脂糖/(6%)甲醛凝膠上分離，并且將分離的變性RNA加 樣至丨J尼龍膜上(Hybond N ；Amersham-Pharmacia, Buckinghamshire,英國)。在65°C 下，在 6XSSC(1XSSC 為 0. 15M NaCl、0. 015M 檸檬酸鈉，pH 7. 0) ,0. 1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮、0.1% (w/v)牛血清白蛋白、0.1% (w/v)菲可(水溶性聚蔗糖) (Ficoll),0.5% (w/v)十二烷基磺酸鈉(SDS)中進(jìn)行過夜雜交。用[32P]dATP(1 X 108dpm μ g4)，通過隨機(jī)標(biāo)記(Sambrook等.1989)標(biāo)記Hahb_4 cDNA的3，非編碼區(qū)域和編碼區(qū)域 的最后177個(gè)核苷酸所對(duì)應(yīng)的不包括Hd-Zip區(qū)域的Spel/EcoRI片段，并作為探針。使用 Bio-Max的膜和增感屏(transcreen) (Eastman Kodak，Rochester，美國，紐約)對(duì)濾紙進(jìn)行 過夜放射自顯影。為了確定各道中加入的總RNA的量，然后，除在62°C下進(jìn)行雜交外，在與 上述相似的條件下用蠶豆(Vicia faba)的25Sr RNA再探測(cè)濾紙。D.核的制備IfligMal(Methods in Plant Molecular Biology. ALaboratory Course Manual, pages 233-260. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA，1995，此處通過參考而引用)，以對(duì)照、水脅迫、或ABA處理的幼苗(4日 齡)制備向日葵的核以及核提取物。如Sedmak J.等所述(Analytical Biochemistry 79 544-552,1977)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析蛋白質(zhì)圖，并且測(cè)定蛋白質(zhì)的總 濃度。E. DNA結(jié)合試驗(yàn)對(duì)于電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，將純化的核蛋白的等分試樣(30 μ g)與通 過互補(bǔ)的寡核苷酸 5，-AATTCAGA TCTCAATAATTGAGAG-3，和 5’ -GATCCTCTCAATTATTG GATCTG-3，(SEQ ID No. 18和SEQID No. 19) (Hahb_4的結(jié)合位點(diǎn)被標(biāo)記下劃線)的雜交而得 到的雙鏈DNA (0. 3 0. 6ng，30000c. p. m.，通過使用DNA聚合酶的Klenow片段在3，端添加 [32P]dATP 而被標(biāo)記)孵育。含有 20mM HEPES-NaOH(pH7. 6)、40mM NaCl、0. 2mM 乙二胺四乙 酸(EDTA)、1. OmM 二硫蘇糖醇(DTT) ,0. 5% Triton X-100，20% 甘油、和 1.5yg聚(dl-dC) 的結(jié)合反應(yīng)物(20 μ L)在25°C下孵育20分鐘，補(bǔ)充2. 5% (w/v)水溶性聚蔗糖(Ficoll)， 并立即加到電泳膠(溶解于0. 5 X TBE和2. 5%甘油中的5%丙烯酰胺、0. 08%二丙烯酰胺； lXTBE*90mM Tris-硼酸，pH 8. 3,2mM EDTA)上。凝膠以 30mA 在 0. 5XTBE 中電泳 1. 5 小時(shí)，并且在發(fā)射性自顯影前被干燥。實(shí)施例3 使攜帶本發(fā)明的向日葵Hahb-4的擬南芥具有水脅迫耐受性的試驗(yàn)A.生物材料使用大腸桿菌系DH5ci和根瘤農(nóng)桿菌系GV2260。對(duì)于轉(zhuǎn)化植物試驗(yàn)，使用擬南芥 生態(tài)型Columbia-O的種子。B.分子克隆為了克隆處于CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的Hahb_4，通過使用cDNA所對(duì)應(yīng)的克隆作為 模板(Gago et al.，Plant Cell & Environment 25 :633_640，2002，此處作為參考文獻(xiàn)引 用)、并使用兩個(gè)與編碼區(qū)的兩個(gè)末端雜交的特異性寡核苷酸Tl 5' -GCGGGATCCACCATGTC TCTTCAACAAGTA-3‘ ；(SEQ ID No. 20)和T2 :5‘ -GCCGAGCTCTTAGAACTCCCAACCACCFTTTG-3‘ (SEQID No. 21)進(jìn)行PCR反應(yīng)。在該方法中，去除了不編碼信使RNA的3’和5’區(qū)域，因此， 降低了可能的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。設(shè)計(jì)寡核苷酸，以使能夠在質(zhì)粒的BamHI和SacI位點(diǎn)處
15引入使用該寡核苷酸擴(kuò)增的片段。此外，在5’cDNA末端的寡核苷酸(寡核苷酸Tl)處添加 確定為與最優(yōu)翻譯一致的序列。純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用上述酶消化該P(yáng)CR反應(yīng)產(chǎn)物，并且使 用大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將酶消化過的PCR反應(yīng)產(chǎn)物克隆到pBI 121載體上用于轉(zhuǎn)化。一旦得 到需要的克隆，則根據(jù)由HSfgen和 Willmitzer (H6fgenand ffillmitzer, Nucleic Acid Research 16 =9977,1998)公開的方法，將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌中。具有其中g(shù)us基因 已由Hahb-4取代的pBI121質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌命名為ATH4。克隆和檢測(cè)技術(shù)采用Sambrook，J.、Fritsch, Ε. F.和 Maniatis，Τ. (1989)的 Molecular Cloning :A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y。C.擬南芥轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化擬南芥所使用的方法為由Clough和Bent所描述的使用浸入(花浸蘸)的方 法(Clough and Bent, Plant J. 16 =735-743,1998) 消毒由轉(zhuǎn)化試驗(yàn)獲得的種子，并在含 有添加40mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)種子。將抗性植株(Fl)轉(zhuǎn)移到土壤 中，并生長至產(chǎn)生種子。使用PCR分析所得品系(F2)的轉(zhuǎn)基因(Hahb-4基因)的出現(xiàn)，并 且也通過Northern分析對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。繁殖表達(dá)轉(zhuǎn)基因的品系直至獲得純合的子系。根據(jù) Carpenter 禾口 Simon 公開的方法(Carpenter, C. and Simon, Α. (1998) Preparation of RNA. EnIn :Methods in Molecular Biology, vol 82 :Arabidopsis Protocols. J. M. Martinez-Zapater and J. Salinas(Eds. ), Humana Press Inc., Totowa, New Jersey)制備擬南芥的總RNA。對(duì)于Northern分析，進(jìn)行公開的方法(Ausubel，F(xiàn). M.， Brent, R. , Kingston, R. Ε. , Moore, D. D. , Seidman, J. G. , Smith, J. A. and Struhl, K. (1983) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N. Y.)。為了通過PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)化的擬南芥植株，使用Li和Chory公開的快速方法制 備總 DNA(Li, J. and Chory, J. (1998)Preparation of DNAfrom Arabidopsis. In :Methods in Molecular Biology, vol. 82 :Arabidopsis Protocols. J. M. Martinez-Zapater and J.Salinas(Eds. )，Humana Press Inc.，Totowa, New Jersey)。D.表型分析Dl.培養(yǎng)皿中的分析通過用70% (ν/ν)乙醇洗1分鐘、氯5% -SDS 洗15分鐘和無菌蒸餾水洗3次 消毒擬南芥的種子。然后，將種子懸浮于8ml 0. 的瓊脂中，并播種于含有添加Gamborg 生產(chǎn)的維生素的MS培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿在4°C放置2天，然后放置到調(diào)光、調(diào)溫 的培養(yǎng)箱中(24°C光照16小時(shí)，21°C黑暗8小時(shí))。通過使植株與6個(gè)熒光燈管保持25cm 的距離、相鄰位置插入白光和Grolux燈管(購自Sylvania)，從而人工地獲得所需的光照條 件(150 200μ E/m2)。在無菌條件下進(jìn)行植物材料的操作。MS培養(yǎng)基在高壓滅菌器中滅菌，并且隨后通 過過濾加入維生素。D2: 土壤中的測(cè)試在直徑12cm、高IOcm的花盆中進(jìn)行土壤中的測(cè)試。根據(jù)試驗(yàn)，各盆中種約1 3 粒擬南芥種子，并且等距離分布。用透明的塑料材料覆蓋花盆，直至出苗，然后去除塑料。將 各16個(gè)盆置于塑料托盤內(nèi)，并且植株在培養(yǎng)箱內(nèi)、在與上述公開相同的光照條件下生長。澆灌的水加到塑料托盤內(nèi)。為了進(jìn)行水脅迫試驗(yàn)，開始時(shí)向盤內(nèi)加入1、1. 5或2升的水。所有的情況下直至 生殖周期結(jié)束時(shí)不再加入任何水。當(dāng)植株分別長出2對(duì)葉子、完整的瓣?duì)铙w或發(fā)育的花時(shí)， 這些通過保持培養(yǎng)箱處于極低的濕度條件的澆灌條件使植株處于水脅迫。由土壤的干旱和 裂縫、葉片膨脹的消失、和植物的最終死亡可以觀察水脅迫。t施例4 :Hahb-4啟動(dòng)子、含有i亥啟動(dòng)子的不同片段的構(gòu)律體禾Π含有所沭構(gòu)律體 的擬南芥的轉(zhuǎn)基因棺株的分離和特征。Α.植物材料、培養(yǎng)和處理?xiàng)l件使用ContifIor 15 的向日葵種子(Helianthus annuus L. ) (Zeneca)。對(duì)于植物轉(zhuǎn) 化試驗(yàn)使用擬南芥生態(tài)型Columbia-O。通過用70% (ν/ν)乙醇洗1分鐘、氯5% -SDS 洗15分鐘和無菌蒸餾水洗3次 消毒擬南芥的種子。然后，將種子懸浮于8ml 0. 的瓊脂中，并播種于含有添加Gamborg 生產(chǎn)的維生素的MS培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿在4°C放置2天，然后放置到調(diào)節(jié)光和 溫度的培養(yǎng)箱中(24°C光照16小時(shí)，21°C黑暗8小時(shí))。在可調(diào)光、和溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)擬南芥的植株(24°C光照16小時(shí)，21°C黑暗8小 時(shí))。通過使植株與6個(gè)熒光燈管保持25cm的距離、相鄰位置插入白光和Grolux燈管，從 而人工地獲得所需的光照條件(150 200 μ E/m2)。B.植物DNA的純化為了提取植物的總DNA，使用由Doyle，J. J.和Doyle, J. L.公開的方法(Doyle, J. J. and Doyle, J. L. (1987)。進(jìn)行少量的嫩葉片組織的快速DNA分離過程(Phytochemical Bulletin 19,11-15)。C.使用的質(zhì)粒、菌株和分子克隆方法質(zhì)粒pGEM. -T easy (Promega)用于克隆使用Taq DNA聚合酶(Promega)的擴(kuò)增反 應(yīng)的產(chǎn)物。也使用ρΒΙΙΟΙ 質(zhì)粒(Jefferson et al.，EMBO J. 6 :3901_3907，1987)，該質(zhì)粒為 PBIN19 二元載體的衍生物。其含有具胭脂堿合成酶的多腺苷酸化信號(hào)(nos)的編碼大腸桿 菌β葡糖醛酸糖苷酶的基因(gus)。ρΒΙΙΟΙ質(zhì)粒也包括使植物具有卡那霉素抗性的nptll 基因。該載體的其它相關(guān)序列包括使細(xì)菌具有卡那霉素抗性的基因、和細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)RK2。 該質(zhì)粒用于以位于gus基因的上游的單一限制性位點(diǎn)、在擬南芥中克隆向日葵Hahb-4啟動(dòng) 子的不同片段。通過先使用大腸桿菌DH5 α感受態(tài)宿主細(xì)胞以T-easy或pBI載體克隆構(gòu)建體， 然后進(jìn)行如Sambrook所述的經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法或電穿孔(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Ε. F. and Maniatis, Τ. (1989)Molecular Cloning :ALaboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y)。對(duì)于制備根瘤農(nóng)桿菌感 受態(tài)細(xì)胞及其進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化，使用H0fgen和Willmitzer描述的方法(Hijfgen，R. and Willmitzer,L. (1988)Storage of competent Agrobacterium cells for transformation was carried out according to. Nucleic Acids Res. 16，1977)0D. DNA片段的分子克隆為了克隆本發(fā)明的基因的啟動(dòng)區(qū)域，Ochman等所述的反向PCR策略(Ochman，
17H. , Ayala, F. J. and Hartl, D. L. (1993)Use of polymerase chain reaction to amplify segments outside boundaries of known sequences. In :Methods in Enzimology vol 218. R. Wu (Ed.)，Academic Press, SanDiego, CA)進(jìn)行如下。如上所述提取向日葵基因組DNA，取5 μ g DNA,并且對(duì)于每微克DNA使用1 3U的 SauIIIA或HindIII(Promega)t5在酶消化被檢測(cè)后(通過在0.7% (ρ/ν)的瓊脂糖凝膠中 加入等分試樣)，則通過加入1/10體積的3Μ NaAc (ρΗ5. 2)和2體積的無水乙醇沉淀片段。為了促進(jìn)限制性片段的再連接，以100 μ L的終體積進(jìn)行反應(yīng)，加入2、10和20ng 各反應(yīng)獲得的片段和5U T4 DNA連接酶(Promega)。反應(yīng)在14°C進(jìn)行16小時(shí)。沉淀并純 化片段，用于作為PCR反應(yīng)的模板。以回收用SauIIIA消化的片段的DNA作為模板、使用寡核苷酸IPCR0/IPCR1 (SEQ ID No. 12/SEQ ID No. 15)、當(dāng)用 HindIII 消化 DNA 時(shí)使用寡核苷酸 IPCR2/IPCR3 (SEQ ID No. 16/SEQ ID No. 17)進(jìn)行第一步中的PCR反應(yīng)。根據(jù)廠商建議的方法，將獲得的片段克隆 到/ G _ -TeaSy載體(Promega)中。檢測(cè)克隆后，測(cè)定對(duì)應(yīng)的序列，并且設(shè)計(jì)下一步所 需要的寡核苷酸。在下一克隆步驟中所用的寡核苷酸的序列和位置如圖23所示。IPCRO[5‘ -GGCGGATCCCCTGGTGGTTGTTTCTGTTG-3‘]IPCRl[5‘ -GCCGAATTCAGATTGAGCAAGAGTATAAC-3‘]IPCR2[5' -ACCTTTATAAAGACCACTC-3‘]IPCR3[5' -ACGCAATGGTGAGTTGTAC-3‘]IPCR4[5' -GCGAAGCTTGATGCGAACGAGTGGTTTA]IPCR5[5' -ATTTCGCAAGTAGTCCATT-3‘]IPCR6[5' -CCCAAGCTTAACCTAAGTCCGCCTTTG-3']IPCR7[5' -GGCAAGCTTATCTCAACCGAAAGTGAC-3]最后，由于該技術(shù)適于片段克隆，因此使用以向日葵基因組DNA作為模板、利用聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、和兩個(gè)被設(shè)計(jì)為與對(duì)應(yīng)的末端雜交的寡核苷酸(IPCR10 :GCGGTCGACACCTGG CACATCGTATCT (SEQID No. 5)和 IPCR8 :CGCGGATCCGAGGGTTTGATAAGTGAT (SEQID No. 6))擴(kuò)增 完整片段的序列知識(shí)。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到PGEM-T easy載體，然后測(cè)定其序列。反向PCR以及構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物所用的重組質(zhì)粒所用的策略如圖23所示。然后將包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動(dòng)子的不同片段克隆到IOlpBI. 3載體?？蛇x擇 地，為了研究距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較遠(yuǎn)的啟動(dòng)子片段，使用攜帶包括TATA盒的最小啟動(dòng)子 (-90CaMV35S)的修飾的pBI載體。該載體也含有作為指示的gus基因，因此，能夠測(cè)定各克 隆片段的啟動(dòng)活性。E. Hahb-4內(nèi)含子的克隆為了克隆Hahb-4內(nèi)含子，通過以向日葵基因組DNA作為模板、并使用寡核苷酸IP CRl (5' -GCCGAATTCAGATTGAGCAAGAGTATMC-3 (SEQ ID No. 15)和 Nl (5 ‘ -GCGGGATCCGTCTGG CAGTTGTTCTTC-3 ‘ SEQ ID No. 22))進(jìn)行PCR反應(yīng)。用EcoRI和BamHI (由核苷酸提供的位 點(diǎn))消化所得的產(chǎn)物，并且隨后被克隆至已被相同酶消化過的PUC119質(zhì)粒中。核實(shí)在某些 白色的所得克隆中出現(xiàn)具有預(yù)期大小的內(nèi)含子后，如下所述測(cè)定其序列。F.用以上步驟中獲得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化擬南芥植株。轉(zhuǎn)化擬南芥植株所用的方法為如Clough和Bent所述的浸入法(花浸
18蘸)(Clough, S. J.and Bent, Α. F. (1998)Floral dip :a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J. 16, 735-743)。對(duì)于各構(gòu)建體，向10 12個(gè)直徑為IOcm的花盆中加入土壤、并用纖維織物覆蓋。 固定覆蓋的布、使其較好地附于土表面。然后，將種子較好地分散于土壤中，并且將花盆置 于用透明尼龍紙覆蓋的托盤中。在上述條件下培養(yǎng)植物；一周后，去除尼龍紙，并且選擇最 強(qiáng)壯的植株。培養(yǎng)該植株直至開花期(約4周)。當(dāng)花梗露出時(shí)(1 2cm的瓣?duì)铙w)，注意不 要傷害莖葉而切下花序。上述切割后4 6天，新的花序長出。等到所有的花序至少具有 4朵未開的花，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。為了制備轉(zhuǎn)化體，農(nóng)桿菌在3個(gè)含有IOml添加了 50mg/L利福平和50mg/L的 卡那霉素的LB培養(yǎng)基的燒瓶中、在28°C攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。將這些培養(yǎng)物接種于3個(gè)含 有200ml相同的培養(yǎng)基的錐形瓶中，并生長至穩(wěn)定期(stationary stage)(在28°C下攪 拌12 16小時(shí))。通過以5500Xg離心20分鐘收集細(xì)胞。在1升的含有300 μ Silwet L-77(0SISpecialties, Inc.)的5%蔗糖溶液中再懸浮離心得到的沉淀，并且將懸浮液置 于具有磁力攪拌器的沉淀杯中。將植物在其中浸潤10 60秒，同時(shí)防止液體接觸土壤。然 后，將花盆水平地放在托盤中，用尼龍紙覆蓋，并放于培養(yǎng)箱內(nèi)。第二天，將花盆以正常的位 置放置，將水加到托盤中，植株生長至種子成熟(4 5周)。最后，分別收集各花盆的種子，并且手工清洗長角果和土壤。將種子放于冰箱中用 于進(jìn)一步的分析。為了選擇轉(zhuǎn)化的植株，將轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中收集的種子消毒，并且如上所述，將種子種于 含有添加了 40mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的第一天內(nèi)，大部 分種子發(fā)芽(95 99% )。在約10天時(shí)，敏感植物的子葉變黃，而轉(zhuǎn)化植物的子葉仍為綠色。將平皿在培養(yǎng) 箱中再放置7天，在此期間，僅在轉(zhuǎn)化的植株中才能觀察非常綠的真正的葉片。非轉(zhuǎn)化植株 死亡。將抗性植株轉(zhuǎn)移到有土的花盆中。為了防止?jié)穸鹊耐蝗唤档?，將花盆置于有水的?盤內(nèi)，并用透明的尼龍紙覆蓋一周。在該階段之后，去除覆蓋花盆的紙，并且培養(yǎng)植株直至 種子成熟，收集種子，并將其置于冰箱內(nèi)用于進(jìn)一步的分析。除了通過其對(duì)卡那霉素的抗性 選擇植株外，還通過特異性PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的出現(xiàn)。最后，通過在含有卡那霉素的平皿中種植、并觀察多個(gè)子系的100%耐受性而獲得 第三代植株的純合系。G.本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的葡糖醛酸糖苷酶活性的組織化學(xué)分析將通過卡那霉素抗性選擇和PCR反應(yīng)鑒定得到的本發(fā)明的擬南芥植株進(jìn)行 β-葡糖醛酸糖苷酶活性的組織化學(xué)試驗(yàn)。用50mM pH7的妝2朋04緩沖液洗用于試 驗(yàn)的胚和器官。然后將其轉(zhuǎn)移至50mM pH7的Na2HPO4溶液、0. 1 % Triton X_100、2mM X-gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-葡糖苷酸)的溶液，進(jìn)行真空處理5分鐘、并且在37 °C 下在黑暗中孵育2 12小時(shí)。孵育后，在室溫下將其在10%甲醛溶液、50%乙醇和5%乙 酸中放置10分鐘。去除甲醛，加入70%乙醇，并在4°C保藏。以在含有MS培養(yǎng)基和0. 8%瓊脂的培養(yǎng)皿中生長的2、10和20日齡的幼苗、和在含有土壤的花盆中生長的成年植株進(jìn)行組織化學(xué)分析。H.本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的β -葡糖醛酸糖苷酶活性的熒光分析通過PCR反應(yīng)鑒定為陽性的抗生素抗性的、并且組織化學(xué)試驗(yàn)為表達(dá)β -葡糖醛 酸糖苷酶的轉(zhuǎn)化植株用于通過熒光檢測(cè)研究啟動(dòng)區(qū)域的調(diào)控。在具有MS-瓊脂培養(yǎng)基的 30mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)30 50粒各系的種子。適當(dāng)生長后，將植株轉(zhuǎn)移到具有添加或未添加 ABA的MS液體培養(yǎng)基的試管中，并且如以下詳細(xì)說明孵育不同的時(shí)間。孵育后，將植株置于 液氮中直至使用。通過將植物材料(約2 5mg)均質(zhì)化為細(xì)粉而獲得蛋白提取物。然后加入500 μ 1 提取緩沖液(50mM Na2HPO4 pH 7、10mM EDTA.O. 1% SDSUOmM β -巰基乙醇、1 % Trit0n X-100)。將懸浮液轉(zhuǎn)移到微離心管中，并以13000Xg在4°C離心10分鐘。棄上清液，將裝 有沉淀的微離心管置于冰上。根據(jù) Jefferson 方法(Jefferson, R. Α.，Kavanagh, Τ. A. and Bevan, Μ. W. (1987) Gus fusions β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6，3901-3907)進(jìn)行熒光反應(yīng)。將100 μ 1蛋白質(zhì)提取物加入到 100 μ 1甲醇和300 μ 1底物MUG(4-甲基傘形酮酰β -D-葡糖苷酸)中。吸取100 μ 1等分 試樣，并且立即在時(shí)間0點(diǎn)進(jìn)行熒光測(cè)定。將余下的400 μ 1在37°C水浴中孵育，并且在30、 60和120分鐘時(shí)移出100 μ 1等分試樣。為了終止反應(yīng)，使用0.9ml 0. 2MNa2C03。熒光反應(yīng) 的數(shù)值根據(jù)RFU曲線圖以每分鐘的產(chǎn)物(pmol)/總蛋白(mg)表示為產(chǎn)物4_MU(7_羥基-4 甲基傘形酮)的濃度的函數(shù)。使用Bio-Rad的設(shè)備VersaFuor 熒光系統(tǒng)、在Iml的圓盤內(nèi)進(jìn)行熒光測(cè)定。I.總蛋白的定量通過使用Sedmak 和 Grossberg 公開的方法(Sedmak，J. and Grossberg,S. (1977) A rapid,sensitive,and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G-250. Anal. Biochem. 79，544-552)測(cè)定蛋白提取物中可溶性蛋白質(zhì)的濃度。牛血清白蛋白 (BSA)用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。J.序列的測(cè)定和分析為了測(cè)定獲得的構(gòu)建體的DNA序列，使用市售的裝置T7測(cè)序試劑盒(Amersham Biosciences),該方法基于桑格方法(Sanger，F(xiàn).，Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467)、并結(jié)合在僅一步中的DNA延伸/終止。此外，以自動(dòng)測(cè)序儀(Service given High Complexity Laboratory, INTA, Castelar, Bs. As. Argentina)核實(shí)這些序列。為了鑒定啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)的調(diào)控序列，使用數(shù)據(jù)庫PLACE(Higo，K.，Ugawa, Y.， Iwamoto,M. and Korenaga,Τ. (1999)Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE) database :1999. Nucleic Acids Res. 27，297—300)禾口 PlantCARE(Rombauts， S. ，Dehais, P. , Van Montagu, M. and Rouze, P. (1999)PlantCARE, a plant cis-acting regulatory element database. Nucleic Acids Res. 27,295-296)。當(dāng)未指定所用的技術(shù)時(shí)，使用由Sambrook，J.、Fritsch，E. F.和Maniatis， Τ. ((1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)以及 Ausubel, F. Μ.、Brent, R.、
20Kingston, R. Ε.、Moore, D. D.、Seidman, J. G.、Smith, J. A.禾口 Struhl, K. ((1983) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N. Y.)所公開的經(jīng)典方法。
盡管已經(jīng)說明和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然可以 對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改，而不偏離由附加的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
一種選自以下核酸分子中的分離的核酸分子(a)具有核苷酸序列SEQ ID No.3的核酸分子；(b)具有核苷酸序列SEQ ID No.10的核酸分子；和(c)具有與(a)或(b)的核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子，其中，所述核酸分子能夠促進(jìn)異源核酸分子在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織中表達(dá)，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織選自細(xì)菌、真菌、昆蟲、動(dòng)植物細(xì)胞、胚胎組織、植物愈傷組織和植物種子中。
2.一種核酸構(gòu)建體，包括選自以下核酸分子中的第一核酸分子(a)具有核苷酸序列SEQID No. 3的核酸分子；(b)具有核苷酸序列SEQID No. 10的核酸分子；和(c)具有與(a)或(b)的核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子，其中，所述第一核酸分子可操作地連接于編碼目的蛋白的第二核酸分子和3’非翻譯區(qū)域。
3.權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述第一核酸分子為SEQIDNo. 3。
4.權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述第一核酸分子為SEQIDNo. 10。
5.一種已用權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和動(dòng)物 細(xì)胞中。
7.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
8. 一種在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)至少一種目的蛋白的方法，該方法包括向宿主細(xì)胞內(nèi)引入權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體并且使所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和動(dòng)物細(xì)胞中。
10. 一種獲得表達(dá)至少一種目的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括 用權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物； 使該細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物再生為表達(dá)至少一種蛋白的完整植株。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物選自單子葉和雙子葉植物中。
全文摘要
本發(fā)明確定了一種向日葵中的由缺水或脫落酸誘導(dǎo)、具有與亮氨酸拉鏈相關(guān)的同源域的新的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的特征。該轉(zhuǎn)錄因子在用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和植物的DNA構(gòu)建體中被克隆是有利的。包括該轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)如水脅迫和高鹽的不利環(huán)境條件具有耐受性和抗性。本發(fā)明也提供了一種核酸啟動(dòng)序列，其中缺水和脫落酸誘導(dǎo)該序列。本發(fā)明提供了包括該轉(zhuǎn)錄因子基因的構(gòu)建體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101914549SQ201010229130
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月2日
發(fā)明者丹尼爾·赫克托·岡薩雷斯, 利亞·拉克爾·尚, 加芙列拉·馬里沙·加戈, 卡洛斯·阿爾貝托·德扎爾 申請(qǐng)人:百塞生技公司