專(zhuān)利名稱(chēng)：利用微流控芯片連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)容物的裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微流控芯片連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的裝置及方法，屬于 單細(xì)胞分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單細(xì)胞分析對(duì)癌癥等重大疾病早期診斷、治療、藥物篩選和細(xì)胞生理、病理過(guò)程的 研究有重要意義。由于細(xì)胞微小(直徑8μπι 200μπι，體積fL nL)，樣品量極少(zmol fmol)，細(xì)胞內(nèi)組分十分復(fù)雜，分析難度很大。毛細(xì)管電泳技術(shù)是目前進(jìn)行單細(xì)胞多組分分 析使用最多的方法。但毛細(xì)管電泳技術(shù)受毛細(xì)管一維結(jié)構(gòu)的限制，單細(xì)胞進(jìn)入毛細(xì)管電泳 時(shí)需使用玻璃毛細(xì)管拉制成的直徑為微米級(jí)的尖端吸住單個(gè)細(xì)胞，配合以精密的微動(dòng)操作 器，才能完成單細(xì)胞進(jìn)樣操作，因此復(fù)雜耗時(shí)，對(duì)操作人員要求很高。所以分析速度很慢。每 天只能分析幾十個(gè)細(xì)胞。由于微流控芯片的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和微米級(jí)的通道尺寸，以及芯片毛細(xì)管電泳高效分離 的特性，單細(xì)胞的進(jìn)樣、溶膜以及胞內(nèi)物質(zhì)的分離分析可以在一塊微流控芯片上實(shí)現(xiàn)。在十 字和雙T微流控芯片上，通過(guò)電控、液壓結(jié)合電控或激光鑷子，操縱單細(xì)胞從微流控分析芯 片的進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道，使細(xì)胞精確停留在分離通道中進(jìn)樣口管壁上，靜態(tài)溶膜后，通 過(guò)芯片毛細(xì)管電泳分離分析測(cè)定胞內(nèi)物質(zhì)的含量。但固定細(xì)胞在分離通道進(jìn)口管壁上和靜 態(tài)溶膜的操作復(fù)雜，需要時(shí)間也較長(zhǎng)，因此大大限制了單細(xì)胞分析的速率。這種方法分析單 細(xì)胞的速度在每小時(shí)25個(gè)細(xì)胞以下。至今為止，只有三篇文獻(xiàn)報(bào)道了在微流控芯片上進(jìn)行連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì) 含量的方法。但細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣時(shí)細(xì)胞懸浮液中的生理鹽水和單細(xì)胞一起進(jìn)入分離通道，導(dǎo) 致電泳時(shí)焦耳熱增加，分離性能變差。為了避免焦耳熱的增加，需使用昂貴的脈沖交流電 疊加直流電的特殊電源和微量注射泵等設(shè)備(Analytical Chemistry 2003，75，5646 5655)。由于這些原因，在微流控芯片上進(jìn)行連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的方法未得到廣泛 應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單能連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的微流控芯片和操作方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種利用微流控芯片連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)容物的裝置，主要包括微流控芯片、 高壓直流電源和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，所述微流控芯片上設(shè)置有呈十字相交的進(jìn)樣通道和 分離通道，在進(jìn)樣通道兩側(cè)，各設(shè)置有一條鞘流通道，兩條鞘流通道與進(jìn)樣通道沿進(jìn)樣液流 向相交于十字交叉點(diǎn)上游，與十字交叉點(diǎn)距離為10 1000微米，進(jìn)樣通道一端設(shè)置樣品 池、另一端設(shè)置樣品廢液池，分離通道一端設(shè)置緩沖液池、另一端設(shè)置緩沖液廢液池，在兩 條鞘流通道另一端均設(shè)置有鞘流液池。通常，進(jìn)樣通道，鞘流通道寬度和深度需大于或等于和分離通道的寬度和深度。高壓直流電源電壓一般為500 10000V，正極與緩沖液池相連、 負(fù)極與緩沖液廢液池相連，在分離通道內(nèi)形成直流電場(chǎng)。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的檢測(cè)點(diǎn)一 般設(shè)置在緩沖液廢液池與十字交叉點(diǎn)之間的分離通道中，用于檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)在激光誘導(dǎo)下 發(fā)出熒光的光強(qiáng)度。本發(fā)明通過(guò)在十字型微流控芯片進(jìn)樣通道的二側(cè)各加一條鞘流通道，鞘流液由溶 膜劑和電泳緩沖溶液混合配制，提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單能連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的微流控 芯片和操作方法。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品廢液池和其他儲(chǔ)液池之間的液面差，使置于樣品池中的細(xì) 胞懸液和鞘流同時(shí)從樣品池和鞘流液池流出。細(xì)胞懸液中的單細(xì)胞通過(guò)進(jìn)樣通道與鞘流 通道的交叉點(diǎn)后，受到鞘流從二個(gè)側(cè)面的擠壓而自動(dòng)排成一行，細(xì)胞在運(yùn)行過(guò)程中與加在 鞘流液中的溶膜劑接觸并快速溶膜于分離通道入口處，在分離通道兩端電場(chǎng)力作用下，溶 膜后的細(xì)胞內(nèi)容物從進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道，流經(jīng)設(shè)置于分離通道上的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè) 器，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物含量進(jìn)行分析。在本發(fā)明中，進(jìn)入微流控芯片分離通道 中的溶液是鞘流液和細(xì)胞懸液中生理鹽水的混合溶液。它既可以使單細(xì)胞在分離通道入口 處快速溶膜，還可以使進(jìn)入分離通道中細(xì)胞懸液的比例大大縮小，使電泳緩沖液中生理鹽 水的濃度大大降低，顯著減少焦耳熱導(dǎo)致的譜帶增寬。所述兩條鞘流通道分別與進(jìn)樣通道沿進(jìn)樣液流向呈15 75°角相交。參見(jiàn)圖1和圖2本發(fā)明提供的連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的微流控芯片上有緩沖 液池(B)、樣品池(S)、樣品廢液池(SW)、二個(gè)鞘流液池(SF1和SF2)和緩沖液廢液池(BW)以 及進(jìn)樣通道、鞘流通道和分離通道。所述的樣品儲(chǔ)液池和樣品廢液池之間的通道為進(jìn)樣通 道S-SW ；在進(jìn)樣通道的二側(cè)各有一條與鞘流液池相通的鞘流通道，所述的分離通道B-BW和 進(jìn)樣通道垂直相交，進(jìn)樣通道與分離通道十字相交于0點(diǎn)，兩條鞘流通道與進(jìn)樣通道相交 于0點(diǎn)上游。激光點(diǎn)置于0點(diǎn)下游的分離通道下方，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)在激光誘導(dǎo)下發(fā) 出熒光的光強(qiáng)度。本發(fā)明還涉及一種利用所述裝置連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)容物的方法，所述方法包 括在緩沖液池和緩沖液廢液池中加入電泳緩沖液，鞘流液池加入溶有溶膜劑的電泳緩沖 液即鞘流液，樣品池中加入待測(cè)細(xì)胞懸液，使細(xì)胞懸液和鞘流液同時(shí)從樣品池和鞘流液池 流出，細(xì)胞懸液和鞘流液沿通道匯合后形成單細(xì)胞流，細(xì)胞在運(yùn)行過(guò)程中與加在鞘流液中 的溶膜劑接觸并快速溶膜于分離通道入口處，在分離通道兩端電場(chǎng)力作用下，溶膜后的細(xì) 胞內(nèi)容物全部從進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道，流經(jīng)設(shè)置于分離通道上的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器， 通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物含量進(jìn)行分析。通過(guò)改變?nèi)苣┑姆N類(lèi)、濃度以及兩條鞘 流通道與進(jìn)樣通道沿進(jìn)樣液流向相交于十字交叉點(diǎn)上游的距離，可使細(xì)胞在與鞘流溶液接 觸50ms內(nèi)快速溶膜于分離通道入口處，溶膜后的細(xì)胞內(nèi)容物在分離通道二端分離電場(chǎng)所 產(chǎn)生的電場(chǎng)力的作用下，全部進(jìn)入分離通道。本方法的關(guān)鍵在于利用含有溶膜劑的鞘流液對(duì)細(xì)胞懸液側(cè)面進(jìn)行擠壓使之自動(dòng) 排成一行，并使之快速溶膜，具體溶膜劑及電泳緩沖液可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行選擇，本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)，依據(jù)待測(cè)細(xì)胞的不同選擇不同的溶膜劑。通常，細(xì)胞濃度為 0. 5 IOX 105cells/mL，溶膜劑在緩沖液中濃度為0. 1 10% (w/w)。本發(fā)明中微流控芯片單細(xì)胞的分析步驟如下在微流控芯片上緩沖液池B和緩沖液廢液池BW中加入電泳緩沖液，鞘流液池SF1和SF2中加入含溶膜劑的電泳緩沖溶液，在樣品池S中加入細(xì)胞懸液，樣品廢液池SW空置。 在液面差導(dǎo)致的靜壓力的驅(qū)動(dòng)下，樣品池中的細(xì)胞懸液和鞘流同時(shí)從樣品池和鞘流液池流 出，細(xì)胞液流與鞘流通道會(huì)流后，細(xì)胞懸液中的單細(xì)胞受到鞘流的擠壓排成一行繼續(xù)運(yùn)行， 并在運(yùn)行中與鞘流液中的溶膜劑接觸，在分離通道二端分離電場(chǎng)所產(chǎn)生的電場(chǎng)力的作用 下，每分鐘可控制150個(gè)細(xì)胞連續(xù)、單個(gè)地從進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道，并在分離通道入口處 于50ms內(nèi)快速溶膜，溶膜后的細(xì)胞內(nèi)容物全部進(jìn)入分離通道被芯片毛細(xì)管電壓連續(xù)、高速 地地分離檢測(cè)。本發(fā)明方法操作方便，通過(guò)調(diào)節(jié)樣品廢液池和其他儲(chǔ)液池之間的液面差，可以使 細(xì)胞懸液中的單細(xì)胞在鞘流擠壓下自動(dòng)排成一行，大大提高了單細(xì)胞的進(jìn)樣速率，避免了 多個(gè)細(xì)胞同時(shí)從進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道；通過(guò)將溶膜劑加在電泳緩沖液中作為鞘流液，可 以使單細(xì)胞在分離通道入口處快速溶膜，并使溶膜后的細(xì)胞內(nèi)容物全部進(jìn)入分離通道予以 連續(xù)、高速地分離檢測(cè)。由于進(jìn)入微流控芯片分離通道中的溶液是鞘流液和細(xì)胞懸液中生 理鹽水的混合溶液，還可以使細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣時(shí)進(jìn)入分離通道中生理鹽水的濃度大大降低， 顯著減少焦耳熱導(dǎo)致的譜帶增寬。


圖1為鞘流聚焦連續(xù)分析單細(xì)胞的微流控芯片示意圖；圖2為鞘流聚焦連續(xù)分析單細(xì)胞的裝置圖；圖3為微流控芯片鞘流聚焦連續(xù)分析單細(xì)胞示意圖；圖4為單細(xì)胞內(nèi)容物電泳檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 參見(jiàn)圖1，微流控芯片上有緩沖液池⑶、樣品池⑶、樣品廢液池(SW)、二個(gè)鞘流 儲(chǔ)液池(SF1和SF2)和緩沖液廢液池(BW)。進(jìn)樣通道為S-SW，長(zhǎng)度為12mm、通道寬95 μ m， 深35 μ m,通道S-O長(zhǎng)度為6mm ；分離通道為B-BW，長(zhǎng)度為46mm，通道寬65 μ m,深20 μ m，通 道B-O長(zhǎng)度為6mm ；進(jìn)樣通道與分離通道十字相交于0點(diǎn)。在進(jìn)樣通道的二側(cè)各有一條鞘流 通道，與進(jìn)樣通道相交于0點(diǎn)上方200nm處，鞘流通道寬95 μ m,深35 μ m,長(zhǎng)度為6mm。在進(jìn) 樣通道，分離通道和鞘流通道的端點(diǎn)處各打小孔，在小孔上用粘接劑粘合微量塑料儲(chǔ)液池。參見(jiàn)圖2，將電泳緩沖液(如硼酸緩沖液、N-甘氨酰胺緩沖液等)100yL、100 μ L 分別加入儲(chǔ)液池B和BW中，將100 μ L用熒光試劑孵育過(guò)的細(xì)胞懸液(1. 2X105cells/mL) 加入樣品池S。將含有溶膜劑(常規(guī)溶膜劑，如triton X-100，十二烷基磺酸鈉、毛地黃皂 苷等)的電泳緩沖液100 μ L，100 μ L分別加入鞘流儲(chǔ)液池SF1和SF2,儲(chǔ)液池SW中不加溶 液。在分離通道二端的B和BW儲(chǔ)液池中施加2000V直流電壓。參見(jiàn)圖3，由于液面高度不同，細(xì)胞懸液中的細(xì)胞從儲(chǔ)液池S流向SW。同時(shí)含有溶 膜劑電泳緩沖液從鞘流液池SF1和SF2流出。細(xì)胞液流與鞘流通道會(huì)流后，鞘流從二個(gè)側(cè) 面的擠壓細(xì)胞懸液中的細(xì)胞，使細(xì)胞排成一行。細(xì)胞在運(yùn)行中與鞘流液中的溶膜劑接觸，當(dāng)細(xì)胞運(yùn)行到進(jìn)樣通道與分離通道的交叉點(diǎn)0后，被施在分離通道二端分離電場(chǎng)所產(chǎn)生的電 場(chǎng)力的作用下，使單細(xì)胞依次從進(jìn)樣通道拐彎進(jìn)入分離通道并在在分離通道入口處快速溶 膜，溶膜后的細(xì)胞內(nèi)容物全部進(jìn)入分離通道。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品廢液池和其他儲(chǔ)液池之間的液 面差和細(xì)胞懸液中細(xì)胞的濃度，每分鐘可控制150個(gè)細(xì)胞連續(xù)地單個(gè)地從進(jìn)樣通道進(jìn)入分 離通道，并在分離通道入口處于50ms內(nèi)快速溶膜，溶膜后釋放出的細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)被芯片毛 細(xì)管電泳連續(xù)、高速地分離檢測(cè)。實(shí)施例2 單個(gè)血紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和活性氧的測(cè)定本實(shí)施例使用的微流控芯片與實(shí)施例1 一致，樣品為紅細(xì)胞懸液。用萘二甲 醛和雙氫羅丹明123分別標(biāo)記細(xì)胞中谷胱甘肽和活性氧，用生理鹽水稀釋配置密度為 1. 2X IO5ceIlsAiL細(xì)胞懸液后，加入樣品池；將20mmol硼酸緩沖溶液(pH 9. 2)加入儲(chǔ)液 池B和Bff中，將含有溶膜劑(tritonX-100，濃度1%，w/w)電泳緩沖液(20mmol硼酸緩沖 溶液，pH 9. 2)加入鞘流儲(chǔ)液池SF1和SF2中，各儲(chǔ)液池中的加液量與實(shí)施例1 一致。在分 離通道二端的B和BW儲(chǔ)液池中施加2000V直流電壓。由于液面高度不同，紅細(xì)胞懸液中的細(xì)胞從儲(chǔ)液池S流向SW。同時(shí)含有溶膜劑電 泳緩沖液從鞘流液池流出，通過(guò)進(jìn)樣通道與鞘流通道的交叉點(diǎn)后，使紅細(xì)胞排成一行。細(xì)胞 與添加在鞘流液中的溶膜劑triton X-100在運(yùn)動(dòng)中相接觸。當(dāng)細(xì)胞運(yùn)行到進(jìn)樣通道與分 離通道的交叉點(diǎn)0后，在分離通道二端分離電場(chǎng)所產(chǎn)生的電場(chǎng)力的作用下，單細(xì)胞依次從 進(jìn)樣通道拐彎進(jìn)入分離通道并在分離通道入口處快速溶膜，溶膜后的細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和活 性氧全部進(jìn)入分離通道。被芯片毛細(xì)管電泳連續(xù)、高速地分離檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò) 控制單細(xì)胞的進(jìn)樣速度和分離通道的長(zhǎng)度，可以使同一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和活性氧達(dá)到 基線(xiàn)分離，且不同單細(xì)胞間的測(cè)定結(jié)果也不互相干擾。從圖4可見(jiàn)，在19秒內(nèi)測(cè)定了 12個(gè) 細(xì)胞中的谷胱甘肽和活性氧含量。
權(quán)利要求
一種利用微流控芯片連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)容物的裝置，主要包括微流控芯片、直流電源和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，所述微流控芯片上設(shè)置有呈十字相交的進(jìn)樣通道和分離通道，在進(jìn)樣通道兩側(cè)，各設(shè)置有一條鞘流通道，兩條鞘流通道與進(jìn)樣通道沿進(jìn)樣液流向相交于十字交叉點(diǎn)上游，與十字交叉點(diǎn)距離為10～1000微米，進(jìn)樣通道一端設(shè)置樣品池、另一端設(shè)置樣品廢液池，分離通道一端設(shè)置緩沖液池、另一端設(shè)置緩沖液廢液池，兩條鞘流通道另一端均設(shè)置有鞘流液池。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述兩條鞘流通道分別與進(jìn)樣通道沿進(jìn)樣液 流向呈15 75°角相交。
3.一種利用權(quán)利要求1所述裝置連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)容物的方法，所述方法包括 在緩沖液池和緩沖液廢液池中加入電泳緩沖液，鞘流液池加入溶有溶膜劑的電泳緩沖液即 鞘流液，樣品池中加入待測(cè)細(xì)胞懸液，通過(guò)調(diào)節(jié)樣品廢液池和其他儲(chǔ)液池之間的靜壓力差， 使細(xì)胞懸液和鞘流液同時(shí)從樣品池和鞘流液池流出，細(xì)胞懸液和鞘流液沿通道匯合后自動(dòng) 排成一行，形成單細(xì)胞流，細(xì)胞在運(yùn)行過(guò)程中與加在鞘流液中的溶膜劑接觸并快速溶膜于 分離通道入口處，在分離通道二端分離電場(chǎng)所產(chǎn)生的電場(chǎng)力的作用下，溶膜后的細(xì)胞內(nèi)容 物全部進(jìn)入分離通道被連續(xù)、高速地分離，分離后細(xì)胞內(nèi)容物中各組份流經(jīng)設(shè)置于分離通 道上的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物中各組份的含量進(jìn)行分析。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的連續(xù)高速分析單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的微流控芯片和操作方法。本發(fā)明在十字型微流控芯片進(jìn)樣通道的二側(cè)各加一條鞘流通道，通過(guò)調(diào)節(jié)儲(chǔ)液池之間的靜壓力差，使細(xì)胞懸液和鞘流液同時(shí)從樣品池和鞘流液池中流出，在鞘流的作用下，細(xì)胞懸液中的單細(xì)胞排成一行，依次從進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道，并在運(yùn)行過(guò)程中與溶膜劑接觸、在分離通道入口處于快速溶膜，在分離通道二端所產(chǎn)生的電場(chǎng)力的作用下，溶膜后的細(xì)胞內(nèi)容物全部進(jìn)入分離通道被連續(xù)、高速地分離，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)。由于進(jìn)入分離通道中的溶液是鞘流液和細(xì)胞懸液中生理鹽水的混合溶液，本發(fā)明還可以大大降低進(jìn)入分離通道中生理鹽水的濃度，顯著減少電泳時(shí)由焦耳熱導(dǎo)致的譜帶增寬。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101923053SQ20101023027
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者劉金華, 徐春秀, 殷學(xué)鋒 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)