專利名稱：異養(yǎng)型硝化細(xì)菌、包含其的生物傳感器、及檢測水體毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及異養(yǎng)型硝化細(xì)菌、包含其的生物傳感器、及檢測水體毒性的方法。
背景技術(shù)：
隨著我國現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，諸多領(lǐng)域會(huì)產(chǎn)生如工業(yè)污水、農(nóng)業(yè)污水、生活污水， 這些污水通常含有有機(jī)污染物、重金屬等直接排放會(huì)對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。其中工業(yè)污水和農(nóng)業(yè)污水含有大量合成有毒有機(jī)物，一般難以被微生物所降解或完全去除，生活污水中也存在多種有毒物質(zhì)，如合成洗滌劑、藥品、內(nèi)分泌干擾物質(zhì)等。因此水環(huán)境中不可避免地存在毒性物質(zhì)。盡管這些污染物在水中濃度低，但毒性危害大，有的還具有致癌、致畸和致突變特性。由于技術(shù)和經(jīng)濟(jì)原因，國內(nèi)很少有對環(huán)境水中的有毒有害污染物進(jìn)行生物毒性監(jiān)測。而在國外，對出流的城市污水進(jìn)行生物毒性監(jiān)測已有不少的報(bào)道。如在美國北卡羅來納州，摻雜了紡織廠廢水的城市污水出流受到了急性毒性和慢性毒性的指標(biāo)限制。目前的毒性測試方法都是基于測定化學(xué)品毒性發(fā)展起來的。生物毒性監(jiān)測不僅能直接反映有毒物質(zhì)聯(lián)合作用對環(huán)境和生態(tài)的綜合影響，還可以直接檢測多種有毒物質(zhì)共存時(shí)水質(zhì)的綜合毒性。近年來國內(nèi)外一直在致力于生物毒性試驗(yàn)新方法的探索。用于毒性檢測的生物傳感器有酶傳感器、微生物傳感器、DNA傳感器和免疫傳感器等。酶、DNA和抗原 /抗體的專一性強(qiáng)，只能特異地檢測某種有毒物質(zhì)的毒性，而微生物傳感器是一類用完整細(xì)胞作為識別元件的傳感器，其體內(nèi)的各種酶系及代謝系統(tǒng)可以檢測和識別相應(yīng)底物，從而達(dá)到測試多種有毒物質(zhì)綜合毒性的目的。因此，微生物傳感器是目前具有很好發(fā)展前途的毒性檢測生物傳感器。硝化菌是專性好氧菌，易受到外界環(huán)境因素的影響，重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)污染物等可以通過抑制硝化作用的酶類(如氨單加氧酶、羥氨氧化酶、亞硝酸氧化酶)而影響這一過程的進(jìn)行，這一特點(diǎn)常被用作毒性測試中。開發(fā)硝化菌毒性檢測系統(tǒng)技術(shù)關(guān)鍵在于硝化菌的選擇，因?yàn)橄趸挠醒鹾粑偷孜锇钡睦檬窍趸饔玫膬蓚€(gè)特征。當(dāng)毒性污染物存在時(shí)，其硝化作用因而受到毒性抑制，因此，將硝化菌制成傳感器，該傳感器使用溶解氧探頭，可以通過測試水樣中溶解氧的變化來評價(jià)水樣毒性的大小。異養(yǎng)型硝化菌在水體毒性檢測生物傳感器上的應(yīng)用關(guān)鍵在于如何篩選、分離、選優(yōu)、組合培養(yǎng)以及生物膜固定化等幾大難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述難點(diǎn)，本發(fā)明經(jīng)過長期的科學(xué)研究與科學(xué)實(shí)驗(yàn)，對異養(yǎng)型硝化菌的篩選、培育、應(yīng)用新技術(shù)等進(jìn)行了研究，并將篩選、培育出的異養(yǎng)型硝化復(fù)合菌。本法明采用原位多點(diǎn)采樣法，采集魚塘、小溪、湖泊等水體中泥樣品，并將其進(jìn)行富集、分離，從而得到的異養(yǎng)型硝化菌菌株，經(jīng)固定化后組合于生物傳感器上，用于水體毒性檢測的目的。
本發(fā)明的目的是提供一種能夠用于檢測水體毒性的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，紫紅紅球菌 (Rhodococcus rhodochrous)0本發(fā)明的再一目的是提供一種能夠用于檢測水體毒性的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，馬紅球菌(Rhodococcus equi)0本發(fā)明的再一目的是提供一種能夠用于檢測水體毒性的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。本發(fā)明的再一目的是提供一種能夠用于檢測水體毒性的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)。本發(fā)明的再一目的是提供一種異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌指示劑。本發(fā)明的再一目的是提供用于水體毒性檢測的生物傳感器。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測水體毒性的方法。本發(fā)明從篩選到能夠效檢測毒性的微生物的目的出發(fā)，采用原位多點(diǎn)采樣法從魚塘、小溪、湖泊等水體中泥樣品，通過用于富集、分離的方法成功的篩選到四株能夠檢測水體中溶解氧的變化，從而檢測水體毒性的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，建立了一種簡單、快速，高效的篩選方法。采用Sherlock 微生物鑒定系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System, Sherlock MlQ對所篩選得到菌種進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定，篩選到的菌株分別是紫紅紅球菌 (Rhodococcus rhodochrous)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、產(chǎn)喊假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，其保藏編號分別是 CGMCC No. 3890、 CGMCC No. 3901、CGMCC No. 3902、CGMCC No. 3903。(中國科學(xué)院微生物研究所，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101保藏日期為2010年6月2日)。根據(jù)本發(fā)明的四種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，其形態(tài)學(xué)特征分別是，紫紅紅球菌 CGMCCNo. 3890 (Rhodococcus rhodochrous)菌落形態(tài)為圓形，表面粘稠，中間凸起，不透明，邊緣不平整，橙紅色；馬紅球菌CGMCC No. 3901 (Rhodococcus equi)菌落形態(tài)為圓形， 表面粘稠，扁平，不透明，邊緣平整，乳白色；產(chǎn)堿假單胞菌CGMCC No. 3902 (Pseudomonas alcaligenes)菌落形態(tài)為圓形，表面粘稠，扁平，半透明，邊緣平整，黃褐色；藤黃微球菌 CGMCC No. 3903 (Micrococcus luteus)菌落形態(tài)為圓形，表面粘稠，扁平，不透明，邊緣平整，亮黃色。根據(jù)本發(fā)明提供的異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌劑指示劑，其包含了上述四種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌之一或多種。優(yōu)選紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)按 1:1:1:1的比例混合制成復(fù)合菌劑指示劑。根據(jù)本發(fā)明提供的檢測水體毒性的方法包括以下步驟1)擴(kuò)大培養(yǎng)上述異養(yǎng)型硝化細(xì)菌；2)將上述異養(yǎng)型硝化細(xì)菌固定于載體上，加入培養(yǎng)基，使異養(yǎng)型硝化細(xì)菌生長形成生物膜；3)將上述生物膜固定于溶解氧電極，然后檢測水體毒性。根據(jù)本發(fā)明提供的方法，其中，異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌劑經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，固定在改進(jìn)了的溶解氧電極上組成傳感器，同時(shí)加入復(fù)合菌劑培養(yǎng)基，將此生物體系投放于待測的水體中，以KCN為毒性參照物，通過檢測硝化細(xì)菌呼吸速率的變化來達(dá)到檢測水體中化學(xué)成分毒性的目的。其中，投加異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌劑和復(fù)合菌劑培養(yǎng)基的比例是1 10，復(fù)合菌劑培養(yǎng)基的成分是牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L, pH 7.0。另外，還要定期補(bǔ)加復(fù)合菌劑培養(yǎng)基，使菌劑在生物系統(tǒng)能良好的生長并形成生物膜，該復(fù)合菌劑生物膜具有穩(wěn)定毒性檢測功能，從而完成對重大環(huán)境污染事件風(fēng)險(xiǎn)源識別與監(jiān)控以及飲用水、污水、河流、湖泊等水體的生物毒性檢測。本發(fā)明篩選到了能有效檢測毒性的微生物，其可用于重大環(huán)境污染事件風(fēng)險(xiǎn)源識別與監(jiān)控技術(shù)及飲用水、污水、河流、湖泊等水體的生物毒性檢測。本法明的優(yōu)勢在于1)原位多點(diǎn)采樣法篩選出多株微生物，克服了單點(diǎn)采樣培養(yǎng)成的菌液穩(wěn)定性差的難點(diǎn)2)通過大量的單因素以及正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了菌株的選優(yōu)并掌握了復(fù)合菌劑最佳的生長條件；3)異養(yǎng)型硝化菌生物傳感器上的成功運(yùn)用解決了生物毒性檢測連續(xù)在線監(jiān)測的難題，實(shí)現(xiàn)了快速檢測水體毒性，從而完成對重大環(huán)境污染事件風(fēng)險(xiǎn)源識別與監(jiān)控以及對飲用水、污水、河流、湖泊等水體的生物毒性檢測。


圖1本發(fā)明的流程圖。圖2紅球菌屬Fl (CGMCC No. 3890)全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜分析色譜圖。圖3紅球菌屬F4 (CGMCC No. 3901)全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜分析色譜圖。圖4假單胞菌屬Y2(CGMCC No. 3902)全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜分析色譜圖。圖5微球菌屬Zl (CGMCC No. 3903)全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜分析色譜圖。圖6硝化菌傳感器對不同濃度HgCl2溶液的響應(yīng)。圖7硝化菌傳感器對不同濃度苯酚溶液的響應(yīng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、異養(yǎng)型硝化細(xì)菌的篩選1、異養(yǎng)型硝化細(xì)菌菌株的分離原位多點(diǎn)采集異養(yǎng)型硝化菌樣品，魚塘8個(gè)點(diǎn)、小溪10個(gè)點(diǎn)、湖泊10個(gè)點(diǎn)等水體中的泥樣品，在富集培養(yǎng)基中經(jīng)過3-10天的富集培養(yǎng)，將富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液在分離培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)，則得到分離單菌株。再將分離得到的單菌株進(jìn)行2-6次純化分離培養(yǎng)，從而得到的異養(yǎng)型硝化菌10株。其中，富集培養(yǎng)基的成分是牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L, pH 7. 0，在25_35°C條件下培養(yǎng)。分離培養(yǎng)基的成分是牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L，pH 7. 0，瓊脂20g/L，在 25-35 °C條件下培養(yǎng)。2、異養(yǎng)型硝化細(xì)菌菌株的篩選及異養(yǎng)型硝化細(xì)菌復(fù)合菌劑的制備將分離得到的異養(yǎng)型硝化菌單一菌10株進(jìn)行逐一篩選，即將每一個(gè)單菌株進(jìn)行硝化速率的測定，并鑒定硝化速率在3. ^ig/(I^d)以上的菌株。硝化速率的測定方法是， 將菌株分別接種在液體培養(yǎng)基中，35°C，黑暗培養(yǎng)21d，并設(shè)立零對照即不加任何細(xì)菌的培養(yǎng)液對照。采用納氏試劑比色法測量培養(yǎng)基中氨氮的量，在420nm下測量其吸光度，按下列公式計(jì)算其硝化速率硝化速率[mg/ (L ·(!)]=(零對照氨氮濃度-實(shí)驗(yàn)組氨氮濃度)/時(shí)間。經(jīng)過21天的培養(yǎng)，菌株Fl、F4、Y2、Zl的硝化速率[mg/(L · d)]分別達(dá)到3. 51、 3.43、3.46、3.52。四株菌按照1 :1:1: 1的比例組合后，處理效果為3. 93，組合后產(chǎn)生了協(xié)同增效的效果。在溫度為35°C，pH值為8. 5，裝瓶量為20mL/250mL，投菌量25%為時(shí)， 復(fù)合菌NH/-N的降解率最高，達(dá)到70. 02%。因此在本研究中最終使用的是由上述四株菌按照1 1 1 1的比例組合而成的復(fù)合菌劑檢測水體毒性，即異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌劑。采用Sherlock 微生物鑒定系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System, Sherlock MIS)對上述四株菌所篩選得到菌種進(jìn)行鑒定，具體鑒定方法如下1)獲菌用無菌接種環(huán)將待分析的微生物從培養(yǎng)皿中取出，放入一個(gè)干凈、干燥 13mmX 100mm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)試管底部，灼燒接種環(huán)重復(fù)上一動(dòng)作，使得菌量不少于40mg。2)皂化向旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)試驗(yàn)管中加入1. 0士0. Iml的試劑1，擰緊試管的Telfon-lined 蓋子，在渦旋儀上震蕩試管5-10秒，然后將樣品試管放入95-100°C的水浴中。5分鐘之后， 從沸騰的水中取出試管并輕微的冷卻，此時(shí)不要打開蓋子，震蕩試管5-10秒后再次將試管放回沸水浴中，繼續(xù)加熱25分鐘。皂化在沸水浴中時(shí)間是30min，可根據(jù)實(shí)際需要設(shè)置兩部分的加熱時(shí)間。3)甲基化向經(jīng)歷過上述步驟的試管中加入2.0士0. Iml的試劑2，擰緊蓋子震蕩液體5-10秒。于80°C水浴加熱試管lOmin，完成水浴加熱后取出冷卻。4)萃取向冷卻的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)試管中加入1. 25士0. Iml的試劑3，蓋緊蓋子，將試管溫和的混合旋轉(zhuǎn)lOmin。打開管蓋，利用干凈的膠頭滴管取出每個(gè)樣品的下層似水部分丟棄。5)基本洗滌最后向完成萃取的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)試管中加入3. 0士0. 21ml試劑4，擰緊蓋子溫和旋轉(zhuǎn)試管5min，靜置待分層。打開每個(gè)試管的蓋子，利用干凈的膠頭滴管吸取上層有機(jī)樣到干凈的GC樣品小瓶。兩層的液面有時(shí)會(huì)不易看見，必須小心不可取出任何似水部份 (下面)部份進(jìn)入自動(dòng)的樣品小瓶。Sherlock Microbial Identification System 為美國 MIDI 公司依據(jù)自 20 世紀(jì)60年代以來對微生物細(xì)胞脂肪酸的研究經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)的一套根據(jù)微生物中特定短鏈脂肪酸(C9-C20)的種類和含量進(jìn)行鑒定和分析的軟件。按照Sierlock Microbial Identification System的程序要求，檢測任何樣品必須將標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣兩次，只有兩次全部合格，系統(tǒng)才會(huì)自動(dòng)運(yùn)行所測樣品，否則測樣程序就會(huì)停止運(yùn)行。經(jīng)鑒定，本發(fā)明篩選得到的菌株，分別為Fl (Rhodococcus-rhodochrous) CGMCCNo. 3890、F4 (Rhodococcus-equi) CGMCC No. 3901 屬于紅球菌屬，Y2 (Pseudomonas alcaligenes)CGMCC No. 3902 屬于假單胞菌屬、Zl (Micrococcus luteus)CGMCCNo. 3903 屬于微球菌屬，其全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜分析色譜圖分別是圖2-5。實(shí)施例2、使用本發(fā)明的硝化細(xì)菌檢測水體毒性1、異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌劑的擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)施例1篩選得到的四株菌，采用復(fù)合菌劑培養(yǎng)基(四株菌按照1:1:1: 1的比例組合)，按所需要的量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。復(fù)合菌劑培養(yǎng)基的成分是牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L，pH 7. 0，在25_35°C條件下培養(yǎng)。2、水體中毒性的檢測將復(fù)合菌劑固定于聚乙烯醇-海藻酸鈉(PVA-CA)載體上，將900mL復(fù)合菌劑7000rpm，4°C離心lOmin，然后加入3mL緩沖液。將聚乙烯醇(PVA)4. 8g和海藻酸鈉 (CA)O. 36g用30mL無氨水溶解，在電爐上加熱，要不斷攪拌。當(dāng)PVA-CA混合液冷卻到室溫時(shí)，將混合液和細(xì)胞濃縮液等體積混合，然后倒入模具，晾干lh，把膜浸入50% w/v NaNO3* 2%w/v CaCl2中，凝固lh，再把膜用無氨水洗兩次。按照1 10的比例投加復(fù)合菌劑培養(yǎng)基，同時(shí)，定期補(bǔ)加復(fù)合菌劑培養(yǎng)基，使菌劑在該系統(tǒng)能良好的生長形成生物膜，將生物膜固定在溶氧電極上，然后投入待測的水體中，檢測水體中的毒性。本實(shí)驗(yàn)以HgCl2和苯酚作為標(biāo)準(zhǔn)毒性物質(zhì)，通過溶氧儀測定水樣中氧濃度的變化分別測試不同毒性物質(zhì)濃度對硝化菌硝化作用的抑制程度。用哈希HQ40d溶氧測定儀來測定由于硝化菌的呼吸而消耗的溶氧量，設(shè)定每k自動(dòng)讀取并存貯DO的數(shù)值。HgCl2濃度梯度設(shè)置為 0. 01mmol/L、0. 03mmol/L、0. 05mmol/L、0. 07mmol/L、0. 09mmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 6。苯酚濃度梯度設(shè)置為 0. 003mmol/L、0. 006mmol/L、0. 009mmol/L、0. 012mmol/L,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，隨著毒性物質(zhì)的濃度的提高，對硝化菌的硝化作用的抑制程度增強(qiáng)，說明本發(fā)明提供的硝化菌測定水體毒性的方法具有可行性。
權(quán)利要求
1.一種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，紫紅紅球菌Oihodococcus rhodochrous)，其特征在于，其保藏編號為 CGMCC No. 3890。
2.一種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，馬紅球菌(Iihodococcus equi)，其特征在于，其保藏編號為 CGMCC No. 3901。
3.一種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，其特征在于，其保藏編號為CGMCC No. 3902。
4.一種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，其特征在于，其保藏編號為 CGMCC No. 3903。
5.一種異養(yǎng)型硝化菌復(fù)合菌劑指示劑，其特征在于，包含選自權(quán)利要求1、2、3、和4所述的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌中一種或多種。
6.權(quán)利要求1、2、3、和4所述的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌用于檢測水體毒性的應(yīng)用。
7.一種用于檢測水體毒性的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器包括溶解氧電極和其上固定的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌生物膜，其中，所述異養(yǎng)型硝化細(xì)菌為權(quán)利要求1、2、3和4 所述的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌中一種或多種。
8.—種檢測水體毒性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)擴(kuò)大培養(yǎng)權(quán)利要求1、2、3和/或4所述的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌；2)將上述異養(yǎng)型硝化細(xì)菌固定于載體上，加入培養(yǎng)基，使異養(yǎng)型硝化細(xì)菌生長形成生物膜；3)將上述生物膜固定于溶解氧電極，然后檢測水體毒性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基成分是牛肉蛋白胨15g/L， NaCL 5g/L, pH 7· O。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及異養(yǎng)型硝化細(xì)菌、包含其的生物傳感器、及檢測水體毒性的方法。根據(jù)本發(fā)明的異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，分別是紫紅紅球菌，保藏編號為CGMCC No.3890、馬紅球菌，保藏編號為CGMCC No.3901、產(chǎn)堿假單胞菌，保藏編號為CGMCC No.3902、藤黃微球菌，保藏編號為CGMCC No.3903。本發(fā)明采用原位多點(diǎn)采樣法篩選得到的四種異養(yǎng)型硝化細(xì)菌組合成復(fù)合菌劑指示劑，固定于載體上制成生物傳感器用于水體毒性的檢測。根據(jù)本發(fā)明的檢測水體毒性的方法，解決了生物毒性檢測連續(xù)在線監(jiān)測的難題，實(shí)現(xiàn)了快速檢測水體毒性，從而完成對重大環(huán)境污染事件風(fēng)險(xiǎn)源識別與監(jiān)控以及對飲用水、污水、河流、湖泊等水體的生物毒性檢測。
文檔編號C12N1/20GK102329744SQ20101023052
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者李捍東 申請人:中國環(huán)境科學(xué)研究院