專利名稱：一種快速鑒定四種海參品種的多重pcr方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學中鑒定海參品種的方法，特別是涉及一種快速鑒定四 種海參品種的多重PCR方法。
背景技術：
海參為棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothrioider)動物的總稱，全世 界有海參約900多種，我國有約140多種。全世界約有40種海參可供食用。近年來，隨著 國內外運用現(xiàn)代科學技術對海參的生理與生化，海參生物活性物質的分離、鑒定及其生物 醫(yī)學作用等研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)海參含有許多具有重要生物學活性和藥理活性的物 質，這也使得海參產品得到越來越多的關注。近幾年國內市場上出現(xiàn)了各種各樣的海參產 品，巨大的商業(yè)利益催生了一些造假、摻假等不法行為，譬如偽造產地、以次充好等等。因 此，急需建立一種快速有效的方法對海參產品進行鑒別和質量控制。借助于物種的形態(tài)學特征、生理性狀及生態(tài)地理分布狀況是研究生物分類的主要 手段，傳統(tǒng)的海參鑒別主要依據(jù)海參的外部形態(tài)和解剖特征。由于市場上銷售的海參產品 均經過一系列加工處理，外部形態(tài)變化較大，利用外部形態(tài)特征很難準確識別海參種類。骨 片是位于海參真皮表層的海參內骨骼，具有種間差異，是進行海參分類及鑒別的重要特征。 廖玉麟等曾對我國的134種海參進行過形態(tài)學的分類，并對其骨片進行了詳細的描述?？?以以此作為海參分類鑒定的依據(jù)。但是，利用骨片進行鑒定需要對每只海參的骨片類型及 其比例進行辨認和統(tǒng)計，鑒定過程工作量非常大，耗時也比較長，人為因素比較明顯，不能 作為一種快速準確的海參種類鑒定的方法。線粒體DNA(mitochondrial DNA ；mtDNA)用作分子標記的理論基礎，有分子結構 簡單、嚴格的母系遺傳、無重組、與核基因組無共同序列、進化速率快、多拷貝及分子鐘理論 等優(yōu)點。因此用線粒體DNA技術進行種屬鑒定的方法具有特異性好、可檢測經加工后無法 用形態(tài)學方法鑒定的樣品等優(yōu)點。已有報導采用聚合酶鏈式反應(PCR)對多種海參的線粒 體細胞色素氧化酶亞基I (CO I)序列進行擴增。經過克隆、測序及序列在線比對，用于海參 種類的鑒定。但是，這種PCR測序法成本比較高、所需時間也較長(5-7天)。海參的品種紛 繁復雜，如果采用單純的測序方法對大量的海參加工產品進行種類鑒定費時費力，成本也 很 I^J。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種快速鑒定四種海參品種的多重PCR方法，它能克服現(xiàn)有 技術的上述缺點，實現(xiàn)海參品種的快速鑒定。一種快速鑒定四種海參品種的多重PCR方法，其特征在于先將干海參泡發(fā)；再對 泡發(fā)的干海參進行DNA模板提??；然后對CO I基因的特異性片段進行多重PCR擴增；最后 對多重PCR擴增產物進行電泳檢測，得到202bp、301bp、261bp和358bp的目的條帶，對應的 海參分別是仿刺參、梅花參、加州擬刺參和冰島參。
本發(fā)明的優(yōu)點1、多重PCR鑒定海參品種，克服了傳統(tǒng)的形態(tài)學方法鑒定海參時 存在的工作量大，耗時長等缺點。采用本發(fā)明方法，只需一次PCR反應和一次瓊脂糖凝膠電 泳，即能分辨出四種海參，具有節(jié)省時間、降低成本、提高效率等優(yōu)點；2、具有較高的特異性 和較好的靈敏度；3、具有較好的重現(xiàn)性。


圖1為多重PCR鑒定四種海參的特異性實驗結果M-DNA Marker (50bp) ；1-冰島 參；2-梅花參；3-加州擬刺參；4-日本刺參；5-暗色刺參；6-玉足海參；7-輻肛參；8-墨西 哥刺參；9-蛇目白尼參；10-水。圖2為多重PCR靈敏度測定M-DNA Marker (50bp) ； 1-4為冰島參模板DNA依次 稀釋10、100、1000和10000倍；5-8為梅花參模板DNA依次稀釋10、100、1000和10000倍； 9-12為加州擬刺參模板DNA依次稀釋10、100、1000和10000倍；13-16為仿刺參模板DNA 依次稀釋10、100、1000和10000倍；17為水。檢測結果證明多重PCR的靈敏度為ng級。圖3為多重PCR重復性實驗圖A為冰島參實驗結果；圖B為梅花參實驗結果；圖 C為加州擬刺參實驗結果；圖D為仿刺參實驗結果。1-10為10個不同的海參個體；Y為陰 性對照；M =DNAMarker (50bp)。
具體實施例方式本發(fā)明快速鑒定四種海參品種的多重PCR方法，其特征在于先將干海參泡發(fā)；再 對泡發(fā)的干海參進行DNA模板提取；然后對CO I基因的特異性片段進行多重PCR擴增；最 后對多重PCR擴增產物進行電泳檢測，得到202bp、301bp、261bp和358bp的目的條帶，對應 的海參分別是仿刺參、梅花參、加州擬刺參和冰島參。本發(fā)明所述的多重PCR擴增反應總體系為50 μ L，包括水6. 5 μ L ； 10XPCR Buffer 5 μ L ；25mM MgCl2 2 μ L ； IOmM dNTP 1 μ L ;A japEF (10 μ mol/ L)0. 5 μ L ；AjapER(10 μ mol/L)0. 5 μ L ；TnasEF(10 μ mol/L)0. 5 μ L ；TnasER(10 μ mol/ L)0. 5 μ L ；PcalEFdO μ mol/L)0. 5 μ L ；PcalER(10 μ mol/L)0. 5 μ L ；CfroEF (10 μ mol/ L) 0· 5 μ L ；CfroER (10 μ mol/L) 0. 5 μ L ；模板 DNA 1 μ L ；Tap DNA 聚合酶 0. 5 μ L ； 使用的特異性引物分別為仿刺參(Apostichopus japonicus)引物為=AjapEF 5' -CTCCCTCCTTCATTCTTCTTCTTG-3，；AjapER 5 ‘ -TATCCC[T/C]GGAGTCCGCATTTTA-3，；梅 花參(Thelenota ananas)引物為TnasEF 5 ‘ -GGAACAGGATGACCATCTACCA-3，；TnasER 5' -CAGGGTCGAAGAAGGTTGTTTTT-3，；加州擬刺參(Parastichopuscalifornicus)引物為 PcalEF 5' -TGAACAATCTACCCTCCCCTCTCG-3’；PcalER 5‘ -GTCCTTAATAACATTGTTATTGCACC G-3，；冰島參(Cucumaria frondosa)引物為CfroEF :5' -AGTAGAAAAAGGGGCAGGAACC-3，； CfroER 5‘ -GCAGAATAGGTGTTGGAAGAGTATAGA-3’。實施例干海參品種的鑒定(1)海參樣品的預處理干海參用自來水沖洗干凈，55°C蒸餾水中泡發(fā)過夜；(2)DNA模板的提?、俜Q取IOOmg海參肌肉柱，沖洗干凈，用無菌紙吸干，切碎或 置液氮研碎。然后加入 400 μ L裂解液(50mM Tris-HCl pH 7. 5 ；1. 5% CTAB ；IM NaCl ；15mMEDTA)和12 μ L 20mg/mL蛋白酶K，置于55°C中5-8小時直至樣品溶解。②將過夜的肌肉柱 加入600 μ L氯仿，混合3min,靜置7min, 12000g離心2min。③取上清，加入500 μ L氯仿，顛 倒混合211^11，1200(^離心21^11。@取上清，加入50(^1^沉淀液(1%CTAB ；50mMTris-HCl PH 7. 5 ；IOmM EDTA)混勻，靜置2min。12000g離心10_20min，棄上清，留沉淀。⑤加入200 μ L 1.2Μ NaCl，輕輕混勻至DNA完全溶解，再加入6μ L RNase，置于37°C下30_60min。⑥加入 ImL冰乙醇和100 μ L 3M NaAc，冰上放置lOmin，中間混勻一次，15000g離心lOmin，所得沉 淀即為DNA。⑦棄除上清，再加入ImL 70%冰乙醇清洗，12000g離心5min。⑧將DNA沉淀 于無菌空氣中晾干，加入20 μ L無菌水溶解沉淀，置于4°C備用。(3)多重PCR擴增CO I基因的特異性片段，鑒定海參品種，具體步驟如 下反應體系總體系 50 μ L，包括水 6. 5 μ L ;10XPCR Buffer 5 μ L ；25mM MgCl2 2 μ L ； IOmM dNTP 1 μ L ；AjapEF(10μmol/L)0. 5 μ L ；AjapER(10μmol/L)0. 5 μ L ； TnasEFdOy mol/L)0. 5 μ L ；TnasER (10 μ mol/L)0. 5 μ L ；PcalEF (10 μ mol/L)0. 5 μ L ； PcalERdOy mol/L)0. 5 μ L ；CfroEF (10 μ mol/L)0. 5 μ L ；CfroER (10 μ mol/L)0. 5 μ L ； 模板DNA 1 μ L ；Tap DNA聚合酶0. 5 μ L ；特異性引物分別為仿刺參(Apostichopus japonicus)弓| 物 % =AjapEF 5 ‘ -CTCCCTCCTTCATTCTTCTTCTTG-3‘ ；AjapER 5' -TATCCC[T/C]GGAGTCCGCATTTTA-3‘；梅花參(Thele-nota ananas)引物為TnasEF 5' -GGAACAGGATGACCATCTACCA-3，；TnasER 5' -CAGGGTCGAAGAAGGTTGTTTTT-3，；加州擬刺 參(Parastichopus californicus)引物為PcalEF :5' -TGAACAATCTACCCTCCCCTCTCG-3，； PcalER 5' -GTCCTTAATAACATTGTTATTGCACCG-3，；冰島參(Cucumaria frondosa)引物為 CfroEF 5 ‘ -AGTAGAAAAAGGGGCAGGAACC-3’ ；CfroER 5 ‘ -GCAGAATAGGTGTTGGAAGAGTATAGA-3，。PCR反應循環(huán)參數(shù)如下94°C預變性5min ；后經過25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C50sec， 60°C lmin，72°C 45sec ；最后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。(4)電泳檢測鑒定對多重PCR反應產物進行電泳檢測。以1 X TBE緩沖液配制2 % (w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶解，冷卻至50-60°C，倒入膠槽中，待膠凝固后，移去梳子，將 膠放入含1 X TBE緩沖液的電泳槽中；再將5 μ L PCR產物與1 μ L加樣緩沖液混勻，依次加 入加樣孔內；控制電壓保持在100V電泳，當溴酚藍條帶泳動到距凝膠前沿約2cm時，停止電 泳；取出瓊脂糖凝膠，置于1 μ g/mL的溴化乙錠中浸泡10-15min，取出置于紫外凝膠成像系 統(tǒng)中觀察分析結果。電泳圖中含有202bp、301bp、261bp和358bp的目的條帶，對應的海參 分別是仿刺參、梅花參、加州擬刺參和冰島參。本發(fā)明所涉及的海參購自于市場，經中國科學院海洋研究所廖玉麟教授采用 形態(tài)學方法鑒定，確定其種類仿刺參(Apostichopus japonicus)、梅花參(Thelenota ananas)、力口州 J以朿 Ij # (Parastichopus californicus)禾口(Cucumaria frondosa)。本發(fā)明所用主要試劑=TapDNA聚合酶、dNTP、50bp DNA Ladder(大連寶生物有限公 司)，引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)，瓊脂糖(BBI)。本發(fā)明所用主要儀器Mastercycler personal PCR儀(Eppendorf AG,Germany) > 天能數(shù)碼凝膠成像儀(Tanon科技上海有限公司)、紫外反射投射儀(上海精科實業(yè)有限公 司)、DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)。本發(fā)明根據(jù)四種海參線粒體CO I基因的特異性，設計合成了四對特異性引物，引 物信息見表1。
表1特異性引物信息
權利要求
一種快速鑒定四種海參品種的多重PCR方法，其特征在于先將干海參泡發(fā)；再對泡發(fā)的干海參進行DNA模板提??；然后對CO I基因的特異性片段進行多重PCR擴增；最后對多重PCR擴增產物進行電泳檢測，得到202bp、301bp、261bp和358bp的目的條帶，對應的海參分別是仿刺參、梅花參、加州擬刺參和冰島參。
2.如權利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述的多重PCR擴增使用 的特異性引物分別為仿刺參引物AjapEF 5 ‘ -CTCCCTCCTTCATTCTTCTTCTTG-3‘； AjapER 5 ‘ -TATCCC[T/C]GGAGTCCGCATTTTA-3，；梅花參弓I 物 TnasEF 5 ‘ -GGAACAGGATGAACCATCTACCA-3’ ；TnasER 5 ‘ -CAGGGTCGAAGAAGGTTGTTTTT-3’ ；加州擬 刺參引物 PcalEF 5' -TGAACAATCTACCCTCCCCTCTCG-3' ;PcalER 5' -GTCCGTTAATAACATTGT TATTGCACCG-3，；冰島參引物 CfroEF 5‘ -AGTAGAAAAAGGGGCAGGAACC-3‘；CfroER 5' -GCAG AATAGGTGTTGGAAGAGTATAGGA-3‘。
全文摘要
一種快速鑒定四種海參品種的多重PCR方法，屬于分子生物學領域。本發(fā)明以四種海參的線粒體CO I基因為靶DNA，通過序列比對，分別設計出針對四種海參的種特異性引物。提取海參CO I基因，進行多重PCR檢測，根據(jù)PCR產物分子量大小即可判斷海參種類。仿刺參、梅花參、加州擬刺參和冰島參經過多重PCR后，其特征性電泳條帶分子量大小依次為202bp、301bp、261bp和358bp。本發(fā)明鑒定方法操作簡單、成本低、檢驗周期短、特異性和重復性好、靈敏度高，克服了傳統(tǒng)海參形態(tài)學鑒定方法所具有的工作量大、耗時長、成本高等缺點，能夠實現(xiàn)海參品種的快速準確鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK101942510SQ20101023101
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權日2010年7月15日
發(fā)明者唐慶娟, 左濤, 律迎春, 李兆杰, 段高飛, 薛勇, 薛長湖 申請人:中國海洋大學