專利名稱：一種大體積水樣中濃縮病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從大體積水樣中濃縮病毒的方法。
背景技術(shù)：
水是傳播疾病的重要媒介，水質(zhì)安全與人體的健康息息相關(guān)。通過水傳播的致病 因子覆蓋病毒、細菌、真菌、原生動物和蠕蟲等所有類群的病原體，還包括藻類、細菌等產(chǎn)生 的毒素。與飲用水污染有關(guān)的主要病毒類群包括脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲肝病毒，柯薩奇病毒， Echo病毒(屬細小RNA病毒科);N0r0Virus (屬杯狀病毒科)；人腺病毒多種血清型(屬腺病 毒);輪狀病毒(屬呼腸孤病毒科);戊肝病毒(屬戊肝病毒科)等。這些病毒多是體積微小，具 有穩(wěn)定的二十面體結(jié)構(gòu)，是污染水中最常見的病毒，且較難清除。它們可引起腸道炎、肝炎， 也可感染神經(jīng)系統(tǒng)。直接檢測病毒的方法通常有分子生物學檢測及細胞培養(yǎng)檢測，或兩者互相結(jié)合的 ICC-PCR (整合細胞培養(yǎng)PCR)方法。間接檢測病毒的方法通常是利用噬菌斑檢測來指示水 中病毒的含量。噬菌體作為感染細菌的病毒，其與人類致病性病毒，特別是水體中常見的 二十面體結(jié)構(gòu)病毒粒子具有相似的結(jié)構(gòu)、大小和化學組成。理論上能很好代表水處理過程 中病毒顆粒被清除情況。此外，水體中噬菌體量遠遠多于致病病毒，故可作為病毒指示物。無論是直接檢測病毒，還是間接檢測噬菌體，都需要對水中的病毒或噬菌體進行 濃縮。由于病毒體積微小、種類繁多，同時由于病毒在宿主外的水中無法繁殖，因而數(shù)量往 往較少。因單個病毒足以引起感染，故都給飲用水中病毒的檢測帶來挑戰(zhàn)。因此，對水體中 病毒檢測來講，最重要的是從大體積水樣中快速濃縮病毒?，F(xiàn)在常用的濃縮水樣中病毒的 方法有以下幾種
1.超速離心法，通過超速離心來濃縮病毒，適合小量樣品濃縮。2.超濾法，可截留水中膠體大小的顆粒，而水和低分子量溶質(zhì)則允許透過膜。只 適合于小于IL的樣品的濃縮。3.陰離子膜吸附，需要預先調(diào)節(jié)pH，通過調(diào)節(jié)pH至3. 5及加入金屬離子，改變病 毒帶電性，使其吸附于陰離子膜上。4.陽離子膜吸附，無需預先調(diào)節(jié)pH，直接過濾。因此，大體積水樣中的病毒濃縮時，通過陽離子膜吸附來濃縮水樣中病毒的方法 用的最多，主要有如下幾種
1)玻璃棉(glass wool)，利用玻璃棉帶正電荷的特點，吸附在自然狀態(tài)下帶負電荷的 病毒，不需要預先調(diào)節(jié)pH。2) IMDS Zetapor,由帶正電荷的纖維素和離子交換樹脂等混合物構(gòu)成膜，折疊 后面積增大，利于吸附病毒。3)納米陶瓷纖維(nanoceram)，利用納米鋁帶正電荷的特點，無需預先調(diào)節(jié)pH， 由無數(shù)根長度為50-300nm，直徑2nm的AlO (OH)纖維構(gòu)成過濾材料。因其有較高的zeta 電位(正電荷)特性，故能快速而牢固地吸附溶液中具有負電性的微小物質(zhì)。同時，該材料具有巨大的比表面積350-600m2 / g，使其對顆粒物還具有較高的荷載能力，不管它是十幾微 米還是幾個納米。理想的水樣中病毒濃縮方法應包括以下幾點(1)操作簡單，適合日常使用；(2) 能對大體積水樣品進行收集，不易堵塞；(3)效果穩(wěn)定，回收率高。相對污水而言，上水源含 有病毒含量較少，必須通過濃縮大體積水樣，才能收集到可用于檢測的病毒數(shù)量，因此，濃 縮時水流速度快，防止堵塞，及后續(xù)操作簡單，濃縮效率高等特點。根據(jù)這些要求，本發(fā)明中在現(xiàn)有納米陶瓷纖維濃縮方法(Karim et al. , Appl. Envir. Microbiol. , 2009; 75: 2393 - 2399)的基礎(chǔ)上進行了改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供快速、高效的收集大體積水樣中病毒的方法。本發(fā)明提供的關(guān)于大體積水樣中病毒的收集方法，是先用納米陶瓷纖維對水體中 的病毒進行吸附，再經(jīng)牛肉浸膏洗脫后，不經(jīng)過硅藻土的二次濃縮，直接用聚二醇進行沉 淀。具體步驟如下
步驟一，用納米陶瓷纖維濾芯對大體積水樣進行過濾；
步驟二，對吸附在納米陶瓷纖維濾芯上的病毒用牛肉浸膏及甘氨酸混合液體進行洗
脫；
步驟三，離心去除洗脫液中的細菌；
步驟四，加入聚二醇(PEG)及氯化鈉母液，絮凝過夜；
步驟五，離心，使病毒沉淀，用PBS溶解。步驟三中所述離心去除細菌可采用IOO-IOOOml的離心杯低速(3000-6000rpm)離 心。步驟四中，溶液的終濃度為7—10% (w/v) PEG 8000 和 0. 1-1. OM NaCl。步驟五中，PBS的 pH 為 7. 0 — 7. 5 本發(fā)明具有以下優(yōu)點
(一)本發(fā)明可以快速，高效收集大體積水樣中的病毒；
(二)本發(fā)明所收集的對象是病毒，因此收集后的樣品中病毒的檢測可以很好的評估水 質(zhì)安全；
(三)本發(fā)明不通過硅藻土的二次濃縮，避免了二次洗脫的損失，也同時使洗脫液的后 續(xù)處理步驟更為簡便；
(四)本發(fā)明在濾芯經(jīng)過牛肉浸膏與甘氨酸混合液洗脫后，增加了離心的步驟，去除細 菌，利于后面的噬菌斑的分析。


圖1為不同梯度噬菌體的PCR檢測結(jié)果。其中，Lane 1: DNA maker I ；Lane 2: IO4；Lane 3: IO3；Lane 4: IO2 ；Lane 5: IO1；Lane 6: Negative。圖2為本方法流程圖。
具體實施例方式實驗步驟如下
(一)用納米陶瓷纖維濾芯吸附病毒。1)將濾芯(Argonide，USA)裝在過濾裝置中，通過蠕動泵將水樣運到過濾裝置中； 一般流速為每分鐘2L。對懸浮物較多的水需要先進行預過濾。(二)牛肉浸膏洗脫。1)1. 5%(w/v)的牛肉浸膏及0. 04-0. 06M甘氨酸洗脫液沿濾芯外壁倒入濾器中。使 其從外向里洗脫。分兩次洗脫，第一次為500ml，洗脫lmin，第二次為250ml，洗脫20min。2)再次用蠕動泵將牛肉浸膏洗脫液抽出。(三)離心去除細菌。1) 4500 rmp離心10分鐘，將細菌去除，減少病毒檢測或噬菌斑檢測時細菌的干 擾。(四)聚二醇(PEG)絮凝。1)加入 250ml 32% (w/v)PEG 8000 和 0· 8M NaCl 的母液，使 PEG 終濃度為 8% (w/ ν)，NaCl終濃度為0. 2Μ，置于4°C，沉淀16小時。2) 7900 g 離心 40min。3)轉(zhuǎn)移上清，沉淀用pH為7. 2的磷酸緩沖液將沉淀溶解。采用MS2噬菌體為病毒的模型，對回收效率進行測定，過程如下
將已知效價的噬菌體加入水體中，分別用納米陶瓷纖維及玻璃棉進行過濾濃縮，及分 別用硅藻土和PEG進行二次濃縮，通過噬菌斑檢測其濃縮效率。評估收集效率結(jié)果
納米陶瓷纖維與玻璃棉相比，至洗脫步驟，收集效率納米陶瓷纖維大于50%，玻璃棉小 于3%。而在采用牛肉浸膏與甘氨酸洗脫液洗脫后，分別用硅藻土和PEG進行濃縮，硅藻 土濃縮效率小于10%，PEG濃縮效率為60%以上，故PEG濃縮效率大大高于硅藻土的濃縮效率。同時我們檢測了以納米陶瓷纖維濃縮，牛肉浸膏洗脫，再經(jīng)PEG 二次濃縮之后的 收集液，以MS2為模型用PCR方法對病毒進行檢測的情況，具體實施方式
為
1)IiTlO4 MS2梯度加入PEG絮凝后的收集液中；
2)提取RNA,采用 QIAGEN 病毒提取試劑盒(QIAamp viral RNA Mini kit, cat. No.52904)；
3)反轉(zhuǎn)錄，采用的是生工的MMLVsingle step RT-PCR Kit ；
4)以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進行PCR，MS2引物為正向引物 (5，-atgaggattacccatgtcgaag-3，)，反向弓丨物(5，- tccctacaacgagcctaaattc-3，)；
5)電泳檢測。經(jīng)收集后用分子手段檢測MS2的下限為10個(圖1)。本發(fā)明還對自來水廠的不同處理階段的水進行了采樣檢測，樣品取自某自來水廠 的不同處理階段的水。水樣最后濃縮到的體積為5ml，分別取了 5，50，500 ul體積做檢 測，每個梯度做了平行檢測，Phix 174和MS2的檢測結(jié)果如下
表一自來水廠不同水處理過程單元噬菌斑檢測結(jié)果
5 在自來水廠樣品的檢測過程中發(fā)現(xiàn)步驟(三)中離心去除細菌是很重要的，如果缺 少此步，噬菌斑的觀察會受很大影響。
權(quán)利要求
大體積水樣中濃縮病毒方法，其特征在于具體步驟如下步驟一，用納米陶瓷纖維濾芯對大體積水樣進行過濾；步驟二，對吸附在納米陶瓷纖維濾芯上的病毒用牛肉浸膏及甘氨酸混合液體進行洗脫；步驟三，離心去除洗脫液中的細菌；步驟四，加入聚二醇及氯化鈉母液，絮凝過夜；步驟五，離心，使病毒沉淀，用PBS溶解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟三中所述離心去除細菌采用 IOO-IOOOml 的離心杯 3000-6000rpm 離心。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟四中，溶液的終濃度為7-10%(w/v) PEG 8000 和 0. 1-1. OM NaCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟五中PBS的pH為7.0-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)方法領(lǐng)域，具體是從大體積水樣中濃縮病毒的方法。該方法包括如下步驟用納米陶瓷纖維濾芯使病毒濃縮;用牛肉浸膏及甘氨酸的混合液體洗脫；離心除去細菌；加入PEG及NaCl進行過夜沉淀;離心后沉淀經(jīng)PBS緩沖液溶解。本發(fā)明無需硅藻土進行二次濃縮，避免了二次濃縮帶來的損失。本方法回收效率高，操作較硅藻土二次濃縮法簡便，濃縮后樣品可進一步用于病毒的細胞培養(yǎng)(包括噬菌斑檢測)和分子生物學分析，為高效檢測水體中的病毒提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/70GK101892327SQ20101023134
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者全哲學, 屈衛(wèi)東, 曾丹寧, 范震宇 申請人:復旦大學