專利名稱：一種檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核酸恒溫擴增試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于Bt基因CrylAc序列和核酸免疫試紙條的一種快速檢測轉(zhuǎn)Bt基 因作物的方法，尤指在反應(yīng)結(jié)束后無需任何儀器、而直接用核酸免疫試紙條簡單快速的對 結(jié)果進行判定的檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核酸恒溫擴增方法和試劑盒。已有的專利是基于蛋 白免疫試紙條對Bt蛋白進行檢測，在一定程度上具有局限性，而且靈敏度也不高。我們通 過選擇Bt基因的CrylAc序列設(shè)計引物，利用恒溫擴增方法，而且采用核酸免疫試紙條對結(jié) 果進行檢測，反應(yīng)結(jié)束后無需任何特殊儀器，結(jié)果判讀直觀明確快速，采用基因檢測不僅大 大提高了檢測的靈敏度，而且操作簡單、快速。適用于對轉(zhuǎn)Bt基因作物的簡單、快速檢測， 可用于檢測機構(gòu)實驗室對于進出口商品的標識復驗，轉(zhuǎn)基因育種研究單位對轉(zhuǎn)基因作物田 間快速篩查等，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)使開發(fā)農(nóng)作物新品種的時間大為縮短，研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育 出了抗除草劑、抗干旱、耐鹽堿、抗重金屬和抗病蟲害、營養(yǎng)價值高的品種，這對于提高糧食 產(chǎn)量、減少收獲后損失以及增加農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)價值具有重要作用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，越 來越多的轉(zhuǎn)Bt基因作物新品種被培育出來。美國、巴西等國家和地區(qū)相繼批準了轉(zhuǎn)Bt基 因作物進入商業(yè)化生產(chǎn)，種植面積急劇擴大。然而轉(zhuǎn)Bt基因作物在帶來巨大社會和經(jīng)濟效 益的同時也存在許多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性及對生態(tài)環(huán)境的安全性方面。轉(zhuǎn)基因食品對人類健康及生態(tài)環(huán)境的潛在影響日益受到人們的普遍關(guān)注，轉(zhuǎn)基因 食品的安全性不容忽視。世界各國都在加強對轉(zhuǎn)基因食品的管理，歐盟、日本、加拿大都已 制定了對轉(zhuǎn)基因食品進行標簽標識管理的法規(guī)，歐盟(EC)49/2000號條例規(guī)定食品中含有 超過的轉(zhuǎn)基因成分時，必須在標簽上做出標識。為了加強對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷售 行為，引導和保護消費者的知情權(quán)，2002年中國農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦 法》，2006年通過了《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》，明確規(guī)定在中國境內(nèi)銷售列入標 識的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進行是否含有轉(zhuǎn)基因成分的標識。因此，建立針對轉(zhuǎn)Bt基 因作物快速檢測方法具有十分重要的現(xiàn)實意義。目前國際上，對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品采取的主要檢測方法是建立在核酸水平上的PCR檢 測，包括競爭 PCR (competitive PCR)、實時定量 PCR (real-time PCR)、PCR-ELISA 方法；建 立在蛋白質(zhì)水平上的Western印記、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和免疫試紙條的檢測方 法。由于這些方法存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長；不適合于現(xiàn)場實時檢測和跟蹤檢測； 檢測成本過高；對檢驗人員的知識、操作水平和儀器水平要求過高等不足之處，方法較難普 及。Notomi等在2000年首次報道一種新的DNA擴增方法即DNA環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。LAMP 法不需要常規(guī) PCR 必 需的反復升溫解鏈過程，可在60 65°C恒溫條件下持續(xù)擴增，擴增效率高，幾十分鐘可達IO9 IOki個拷貝，因此不需特殊設(shè)備，檢測時間更短、敏感性更高；同時6條特異性引物識 別靶基因的8個特定區(qū)域，特異性更高，因此在轉(zhuǎn)基因檢測上明顯優(yōu)于PCR。本發(fā)明首次基于Bt基因序列和核酸試紙條建立LAMP技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bt基因作物 的檢測，提供了針對轉(zhuǎn)Bt基因作物的Bt引物序列、試劑盒和檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核 苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準確、便于結(jié)果判定，易于控制污染的檢測轉(zhuǎn)Bt 基因作物的檢測試劑盒(基于核酸試紙條)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇Bt基因特定保守序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對的基礎(chǔ)上，進行引物設(shè) 計。一組檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核苷酸序列，如下1)5，-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3，(SEQ ID NO 1)2)5，-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3，(SEQ ID NO 2)3)5，-GAATACGCATTTCCTCGCTTAGAGAGCTTCAGAGAGTGG-3，(SEQ ID NO 3)4)5，-CTAATCTTCACCTCAGCGTGTTCTATTGATGGTTGCAGCATC-3，(SEQ ID NO 4)5)5，-GAGCTGGGTTAGTAGGAT-3，(SEQ ID NO 5)6)5，-CTTCGAGACGTTAGCGTG-3，(SEQ ID NO 6)其中序列1)和2)分別為Bt檢測的外引物F3和B3，序列3)和4)為Bt檢測的內(nèi) 引物FIP和BIP，序列5)和6)為Bt檢測的探針Df和Db，分別標記熒光素和生物素。我們采用LAMP檢測技術(shù)建立了轉(zhuǎn)Bt基因作物檢測方法，對反應(yīng)的各種條件進行 了優(yōu)化，其中包括引物的篩選，主要組分使用濃度的優(yōu)化，以及對反應(yīng)后產(chǎn)物直接用核酸試 紙條進行檢測，得到以下試劑盒。檢測轉(zhuǎn)Bt基因的核酸恒溫擴增試劑盒，由以下組分組成1) LAMP反應(yīng)液，表1為LAMP反應(yīng)液配方。表ILAMP反應(yīng)液配方 Betaine 購自 SIGMA 公司，IOX 緩沖液，0. lmol/L MgS04 購自 NEB 公司，IOmmol/LdNTP購自Promega公司；引物委托大連寶生物生物工程有限公司合成，其中IOX緩沖液 的組成為500mM KClUOOmM Tris-HCl (pH9. 025°C ) U. 0% Triton X-100。2) Bst DNA 聚合酶，8U/ μ L，購自 NEB 公司。3)陰性對照滅菌雙蒸水。4)陽性對照為含有Bt基因片段的質(zhì)粒?；厥辙D(zhuǎn)Bt基因作物Bt基因PCR擴增 產(chǎn)物，與PGEM-T easy載體(購自Promega公司)進行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，堿裂 解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為PGEM-Bt。用滅菌雙蒸 水將純化質(zhì)粒進行稀釋，至質(zhì)粒拷貝數(shù)調(diào)整為IO6拷貝/ μ 1，即為檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的陽 性對照品。301bp Bt目的片段基因序列如下1 GAAGGTTTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT61 CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCGCC121TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGTC CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG181TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA241AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATC30IG對合成的引物做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計測定 0D260nm/0D280nm的比值在1. 6-2. 0之間，即視為合格引物。從轉(zhuǎn)Bt基因大豆中提取的DNA 為模板進行擴增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的弓I物對擴增效果較好。用CTAB法提取轉(zhuǎn)Bt基因作物的DNA。由于引物、MgS04，Betaine，dNTP的濃度以 及反應(yīng)時間和溫度對LAMP反應(yīng)效率有一定影響，通過逐一優(yōu)化，確定了如下反應(yīng)體系和條 件(表2)，分別對轉(zhuǎn)Bt基因大米核酸、轉(zhuǎn)Bt基因玉米核酸以及轉(zhuǎn)Bt基因棉花核酸進行檢 測。反應(yīng)條件為60°C /lh，然后用核酸試紙條檢測。表2建立的LAMP反應(yīng)體系 1)樣本的處理取待檢樣品0. 2mg置于研缽中，用液氮磨至粉狀，加入700μ L65°C 水浴預熱的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動，將磨碎液倒入1. 5ml的滅菌離心管中，65°C水浴30min，編號備用。處理的樣本在2V 8°C條件下保存應(yīng)不超過24h ；若需長期保存，須 放置-70°C冰箱，但應(yīng)避免反復凍融(最多凍融2次)。2) DNA的提取在樣本處理區(qū)進行。1.1取η個1.5ml滅菌離心管(η=樣本數(shù))，作好標記。首先加入600yL氯仿-異 戊醇(24 1)，然后加入600 μ L處理好的待測樣本(一份樣本換用一個吸頭)，混勻器上 振蕩混勻5sec (不宜過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。陰性對照、陽性對照 無需處理，直接使用。1.2 12，OOOg離心IOmin (如有條件，于4°C進行離心)。取與上步中相同數(shù)量的 1.5ml滅菌離心管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預冷)，作好標記。1. 3吸取步驟1. 2各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。1. 4 12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品 應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(_20°C預冷)，顛倒洗滌。1. 5 12，OOOg離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg 離心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換 用一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過于干燥，以免DNA不 溶)。1.6加入50 μ L 0. IX TE (含RNase)緩沖液，輕輕混勻，溶解管壁上的DNA，2，OOOg 離心5sec，4°C保存?zhèn)溆?，若需長期保存，請保存于-20°C。3) LAMP擴增從試劑盒中取出LAMP反應(yīng)液、8U/ μ L Bst DNA聚合酶，在室溫下融 化后，2，OOOg離心5sec。設(shè)所需LAMP管數(shù)為η (η =樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)， 每個測試反應(yīng)體系需要17 μ L LAMP反應(yīng)液和1 μ L Bst DNA聚合酶。計算好各試劑的使用 量，加入一適當體積試管中，向每個管中各分裝18 μ L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的管中 分別加入制備的DNA溶液各2 μ L，蓋緊管蓋，于4，OOOg離心5sec。60°C /Ih04)結(jié)果的判定可用核酸試紙條對產(chǎn)物進行檢測。也可對產(chǎn)物進行電泳進行結(jié)果 判定。核酸試紙條判定陰性對照只有一條紫色的線；陽性對照有兩條紫色的線。檢測 樣品顯示兩條紫線的為陽性，否則為陰性。電泳判定需要用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，如出現(xiàn)特定的梯狀條帶，判為陽 性，否則判為陰性。本發(fā)明的優(yōu)點和創(chuàng)新之處在于1)快速檢測時間僅為1-1. 5小時；2)特異由于采用了針對8個區(qū)域的4條特異性引物和2條特異性探針，引物多 聚體及非特異性擴增幾率大大降低，從而使結(jié)果準確性大大提高；與其他轉(zhuǎn)基因作物未發(fā) 現(xiàn)交叉反應(yīng)；3)靈敏該方法的擴增效率非常高，比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100-1000倍；用 所建立的方法對以10倍梯度稀釋的PGEM-Bt質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果表明稀釋到10個拷貝仍 為陽性；4)反應(yīng)成本低采用一次性核酸試紙條進行檢測，不需任何特殊設(shè)備，而直接根 據(jù)核酸試紙條顯色進行判斷，結(jié)果更加直觀，比PCR簡單，且成本大大降低，因此極易推廣；
5)穩(wěn)定重復性試驗結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為轉(zhuǎn)Bt基因作物核酸恒溫擴增檢測方法陰陽性核酸試紙條判定(左邊2根 試紙條為陽性，右邊2根試紙條為陰性)。圖2為轉(zhuǎn)Bt基因作物核酸恒溫擴增檢測方法陰陽性電泳判定(左邊2個泳道為 陽性，右邊2個泳道為陰性)。
具體實施例方式實施例1、試劑盒的配制和使用1、試劑盒的配制組成，見表3。表3試劑盒配制組成 2、試劑盒的使用方法2. IDNA 提取1.1取η個1.5ml滅菌離心管(η=樣本數(shù))，作好標記。首先加入600yL氯仿-異 戊醇(24 1)，然后加入600 μ L處理好的待測樣本(一份樣本換用一個吸頭)，混勻器上 振蕩混勻5sec (不宜過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。陰性對照、陽性對照 無需處理，直接使用。1.2 12，OOOg離心IOmin (如有條件，于4°C進行離心)。取與上步中相同數(shù)量的 1.5ml滅菌離心管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預冷)，作好標記。1. 3吸取步驟1. 2各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。1. 4 12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品 應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(_20°C預冷)，顛倒洗滌。1. 5 12，OOOg離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg 離心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換 用一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過于干燥，以免DNA不 溶)。1.6加入50 μ L 0. IX TE (含RNase)緩沖液，輕輕混勻，溶解管壁上的DNA，2，OOOg 離心5sec，4°C保存?zhèn)溆?，若需長期保存，請保存于-20°C。3) LAMP擴增從試劑盒中取出LAMP反應(yīng)液、8U/ μ L Bst DNA聚合酶，在室溫下融 化后，2，OOOg離心5sec。設(shè)所需LAMP管數(shù)為η (η =樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)， 每個測試反應(yīng)體系需要17 μ L LAMP反應(yīng)液和1 μ L Bst DNA聚合酶。計算好各試劑的使用 量，加入一適當體積試管中，向每個管中各分裝18 μ L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的管中分別加入制備的DNA溶液各2 μ L，蓋緊管蓋，于4，OOOg離心5sec。60°C /Ih04)結(jié)果的判定可用核酸試紙條對產(chǎn)物進行檢測。也可對產(chǎn)物進行電泳進行結(jié)果 判定。核酸試紙條判定陰性對照只有一條紫色的線；陽性對照有兩條紫色的線。檢測 樣品顯示兩條紫線的為陽性，否則為陰性。電泳判定需要用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，如出現(xiàn)特定的梯狀條帶，判為陽 性，否則判為陰性。
權(quán)利要求
一組基于核酸試紙條的檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核苷酸序列，如下1)5’ GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC 3′(SEQ ID NO1)2)5’ CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’(SEQIDNO2)3)5’ GAATACGCATTTCCTCGCTTAGAGAGCTTCAGAGAGTGG 3’(SEQ ID NO3)4)5’ CTAATCTTCACCTCAGCGTGTTCTATTGATGGTTGCAGCATC 3’(SEQ ID NO4)5)5’ GAGCTGGGTTAGTAGGAT 3’(SEQ ID NO5)6)5’ CTTCGAGACGTTAGCGTG 3’(SEQ ID NO6)其中序列1)和2)分別為Bt檢測的外引物F3和B3，序列3)和4)為Bt檢測的內(nèi)引物FIP和BIP，序列5)和6)為Bt檢測的探針Df和Db，分別標記熒光素和生物素。
2.一種基于核酸試紙條可簡單快速進行結(jié)果判定的轉(zhuǎn)Bt基因作物檢測試劑盒， 48tests/盒，由以下組分組成1)LAMP反應(yīng)液，分別為850yLXl管，含有IX緩沖液、Betaine、MgS04、dNTP、引物F3 和B3、引物FIP和BIP以及探針Db和Df ；2)Bst DNA 聚合酶 8U/μ L，50 μ LXl 管；3)滅菌雙蒸水，lmLX2管；4)陰性對照=ImLXl管，滅菌雙蒸水；5)陽性對照lmLX2管，為含有Bt基因片段的質(zhì)粒。回收轉(zhuǎn)Bt基因作物Bt基因PCR 擴增產(chǎn)物，與PGEM-T easy載體(購自Promega公司)進行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞， 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為PGEM-Bt。用滅菌 雙蒸水將純化質(zhì)粒進行稀釋，至質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)整為106拷貝/ μ 1，即為檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物 的陽性對照品。6)核酸試紙條48tests。301bp Bt目的片段基因序列如下1 GAAGGTTTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT61 CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCGCC121TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGTC CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG181TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA241AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATC301G
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)Bt基因作物檢測試劑盒，其特征在于所述檢測Bt基因 引物序列為1)5，-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3‘(SEQ ID NO 1)2)5，-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3，(SEQIDN02)3)5，-GAATACGCATTTCCTCGCTTAGAGAGCTTCAGAGAGTGG-3’(SEQ ID NO 3)4)5，-CTAATCTTCACCTCAGCGTGTTCTATTGATGGTTGCAGCATC-3’(SEQ ID NO 4)5)5，-GAGCTGGGTTAGTAGGAT-3，(SEQID NO 5)6)5，-CTTCGAGACGTTAGCGTG-3，(SEQID NO 6)其中序列1)和2)分別為Bt檢測的外引物F3和B3，序列3)和4)為Bt檢測的內(nèi)引物 FIP和BIP，序列5)和6)為Bt檢測的探針Df和Db，分別標記熒光素和生物素。
全文摘要
一種檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核酸恒溫擴增試劑盒及方法公開了一組檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的核苷酸序列，如下1)5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’(SEQ ID NO1)，2)5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’(SEQ ID NO2)，3)5’-GAATACGCATTTCCTCGCTTAGAGAGCTTCAGAGAGTGG-3’(SEQID NO3)，4)5’-CTAATCTTCACCTCAGCGTGTTCTATTGATGGTTGCAGCATC-3’(SEQIDNO4)，5)5’-GAGCTGGGTTAGTAGGAT-3’(SEQ ID NO5)，6)5’-CTTCGAGACGTTAGCGTG-3’(SEQID NO6)并提供了一種基于核酸恒溫擴增及核酸試紙條，可簡單、快速進行結(jié)果判定的轉(zhuǎn)Bt基因作物檢測試劑盒，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。適用于對轉(zhuǎn)Bt基因作物的簡單、快速檢測，可用于檢測機構(gòu)實驗室對進出口商品的標識復驗，轉(zhuǎn)基因育種研究單位對轉(zhuǎn)基因作物田間快速篩查等。本發(fā)明優(yōu)點是1)快速檢測時間僅為1-1.5小時；2)特異；3)靈敏；4)反應(yīng)成本低僅需一個普通的水浴鍋；5)穩(wěn)定。
文檔編號C12Q1/68GK101906475SQ20101023336
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者喬彩霞, 凌鳳俊, 劉輝, 吳丹, 周琦, 張偉, 張利峰, 張向東, 張瑞宏, 李東燕, 柏亞鐸, 段向英, 汪琳, 羅英, 蒲靜, 谷強, 賴平安, 高志強, 齊瑋 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局;物思科技發(fā)展(北京)有限公司