專(zhuān)利名稱：一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧行業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是利用TLR2 (Toll-like rec印tor2)基 因特異啟動(dòng)子鑒別海福(Hereford)特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)2003年出版的《中國(guó)畜禽遺傳資源狀況》的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)黃牛有69個(gè) 品種，其中地方品種52個(gè)，培育品種5個(gè)，引入品種12個(gè)，是世界上牛品種最多的國(guó)家。中 國(guó)本地黃牛曾經(jīng)長(zhǎng)期以役用為主，它具有肉品質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(邱懷等， 1986年)。然而，我國(guó)黃牛品種的絕大部分個(gè)體尚不具備優(yōu)良肉牛品種的體型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，存 在產(chǎn)肉性能較低、生長(zhǎng)速度較慢、飼料報(bào)酬較低、母牛的泌乳性能較低等缺點(diǎn)，為了克服中 國(guó)黃牛的缺陷，幾十年來(lái)，我國(guó)先后引進(jìn)了 28個(gè)國(guó)外肉牛品種與當(dāng)?shù)攸S牛進(jìn)行雜交，均取 得了一定的效果，其中，引進(jìn)的品種有西門(mén)塔爾牛、夏洛來(lái)、利木贊、海福特牛等。然而，許多 地方出現(xiàn)了盲目雜交，輕視選育的現(xiàn)象。企業(yè)和養(yǎng)殖戶為了追求一時(shí)的高產(chǎn)，采取大量、盲 目的雜交改良，致使全國(guó)性牛品種混雜，固有品種的優(yōu)良基因庫(kù)與基因組合體系因雜交而 混亂，甚至解體。此外，近年來(lái)，由于一些品種缺乏肉用選育和導(dǎo)入改良的統(tǒng)一規(guī)劃，進(jìn)行 導(dǎo)入雜交時(shí)引入國(guó)外良種肉牛品種比較雜亂，甚至，在引種時(shí)，可能引入的個(gè)體就是雜種個(gè) 體，而非純種牛個(gè)體。由于一些優(yōu)良種質(zhì)特性的基因資源丟失，從而導(dǎo)致種質(zhì)和產(chǎn)肉性能的 下降。海福特(Hereford)牛原產(chǎn)于英國(guó)，是世界上最古老的早熟中小型肉牛品種，具有 生長(zhǎng)快、早熟易肥、肉質(zhì)好、飼料報(bào)酬高等優(yōu)良的種質(zhì)特性，它在世界肉牛業(yè)發(fā)展中起了重 要作用。我國(guó)于1964、1973和1974年分別從英國(guó)引進(jìn)，1995-1996年又從北美引進(jìn)大型海 福特牛品種(許尚忠等，2009)。純種海福特牛具有典型的“六白”(四肢下部、腹下部、頸下 部、耆甲和尾帚呈白色)的外貌特征，海福特牛與我國(guó)黃牛雜交效果較好，然而，半數(shù)一代 雜種海福特牛還具有“六白”特征，因此，僅依據(jù)其外貌特征，很難鑒別純種海福特牛和雜種 的海福特牛。那么，如何識(shí)別純種海福特牛和雜種海福特牛，是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，其在 品種的引進(jìn)、品種的雜交改良與選育，以及牛肉貿(mào)易的標(biāo)示等方面，具有非常重要的作用。 特有等位基因是指品種在所研究的座位上特有，而其它品種沒(méi)有的等位基因。它在畜禽的 遺傳多樣性、品種起源、品種識(shí)別、產(chǎn)品追溯中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。TLR2 (Toll-like receptor2)基因是 Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLR)蛋 白基因家族重要成員之一，TLR2能夠識(shí)別多種病原微生物及其產(chǎn)物，介導(dǎo)天然免疫，通過(guò)細(xì) 胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)獲得性免疫(Stevens等，2008)。牛TLR2基因定位在17號(hào)染色體上， 含有2個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)約13. 2kb，其mRNA長(zhǎng)度約為3. 5kb，編碼784個(gè)氨基酸(White 等，2003)。目前，已有相關(guān)研究報(bào)道了 TLR2基因的外顯子和3’非翻譯區(qū)的遺傳變異在在中 國(guó)荷斯坦牛、渤海黑牛、魯西黃牛、挪威紅牛、瘤牛等群體中的遺傳多樣性，單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)及其單倍型與牛乳腺炎的關(guān)系(馬騰壑等，2007 ；Opsal等，2008 ；張翠霞等，2009 ； 劉利等，2009 ；Mariotti等，2009 ；Seabury等，2010)。但是，以上研究與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，還沒(méi)有關(guān)于TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)的相關(guān)研究，更沒(méi)有利用LTR2基因啟動(dòng)子區(qū)的特異等位基因 來(lái)鑒別海福特純種牛、海福特雜種牛及其它品種牛的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用TLR2 (Toll-like receptor2)基因特異啟動(dòng)子鑒別海福特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的鑒別海福特(Hereford)純種 牛和雜種牛的方法，是先獲得目標(biāo)測(cè)試牛的基因，設(shè)計(jì)該基因TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)基因的 上游引物和下游引物，建立PCR反應(yīng)體系，通過(guò)PCR方法來(lái)擴(kuò)增TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)片段， 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)鑒定TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)的300bp 307bp位點(diǎn)的基因型，來(lái) 鑒別海福特純種牛和雜種牛，還是其它品種的牛。當(dāng)TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段為627bp，且 300bp 307bp位點(diǎn)為AATGAATG/AATGAATG的純合子時(shí)，則為純種的海福特牛；當(dāng)TLR2基 因啟動(dòng)子區(qū)片段為627bp，且300bp 307bp位點(diǎn)為AATGAATG/AATGCTTC雜合子時(shí)，則為雜 種的海福特牛；當(dāng)TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段為623bp，且300bp 307bp位點(diǎn)為AATGAATG/ AATGCTTC的純合子時(shí)，則為其它品種的牛。所述的擴(kuò)增TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)的上游引物序列為SEQ ID NO. 4，下游引物序列 為SEQ ID NO. 5。所述的PCR反應(yīng)體系是總體系為20 μ 1，其中包括10 IOOng的基因組DNA、 Ι.Ομ 1濃度為lOpmol/μ 1的上游引物、1. 0μ 1濃度為IOpmol/μ 1的下游引物，2.0μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 濃度為 0. 25mM 的 dNTPs、2. OU 酶活單位的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所述的PCR方法擴(kuò)增TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)的反應(yīng)程序是94°C預(yù)變性4min ；94°C 變性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是海福特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的TLR2基因的啟動(dòng)子存在多態(tài)性差 異，通過(guò)對(duì)相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè)，即利用鑒定品種特異的TLR2基因啟動(dòng)子，可以鑒別海福特純 種牛、海福特雜種牛和其它品種的牛。本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確、方便地鑒別海福特純種牛和雜種牛，并且易于實(shí)驗(yàn)室操作， 污染少，成本低，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。本發(fā)明的方法在海福特牛的品種引進(jìn)、海福特牛肉的進(jìn)出口貿(mào)易、與本地牛的雜 交改良、肉牛新品系的培育、牛肉產(chǎn)品溯源等方面具有很好的應(yīng)用前景，能夠產(chǎn)生可觀的經(jīng) 濟(jì)效益和良好的社會(huì)效益。


附圖1是本發(fā)明的實(shí)施例一的測(cè)序圖；附圖2是本發(fā)明的實(shí)施例二的測(cè)序圖；附圖3是本發(fā)明的實(shí)施例三的測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法作以 下詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明是通過(guò)對(duì)不同牛品種TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)序列和單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 分析來(lái)揭示海福特純種牛、海福特雜種牛及它品種牛的TLR2基因的啟動(dòng)子的遺傳多樣性 差異。研究對(duì)象包括，海福特牛純種牛、海福特雜交1代牛、西門(mén)塔爾牛、利木贊牛、夏洛來(lái) 牛、娟姍牛、利木贊與魯西黃牛的雜交牛、魯西黃牛、渤海黑牛、海南黑牛、南陽(yáng)牛、荷斯坦牛 奶牛等品種牛共425個(gè)體。采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從牛的血液中提取基因組DNA，用分光光度計(jì)或1 %的 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA的濃度和純度。從UCSC網(wǎng)站下載牛TLR2基因上游的2kb以及 5’-UTR(非翻譯區(qū))的序列作為參考序列，使用Matlnspector軟件預(yù)測(cè)序列的啟動(dòng)子區(qū)域， 利用Primerf. 0軟件設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增牛TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)片段(627bp)。之后，采 用PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列結(jié)果利用ChromasPro vl. 41軟件進(jìn)行 分析，然后采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，尋找品種間的重要SNPs和品種特異的啟動(dòng) 子區(qū)。結(jié)果表明海福特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn) 存在多樣性，并且存在品種特異的啟動(dòng)子。實(shí)施例1采用酚-氯仿抽提法從第一目標(biāo)牛血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物用于 擴(kuò)增TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段，所用的引物序列為上游引物序列為=SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3，；下游引物序列為=SEQ ID NO. 5 TLR2-promoter_R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反應(yīng)體系如下總體系為20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基 因組 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. 0 μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所用的PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID N0. 1，測(cè)序峰圖如附 圖1，片段長(zhǎng)度為627bp，該序列中300bp 307bp的基因是AATGAATG的表現(xiàn)型為AA的純 合子，鑒定結(jié)果為海福特純種牛。實(shí)施例2采用酚-氯仿抽提法從第二目標(biāo)牛血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物用于 擴(kuò)增TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段，所用的引物序列為上游引物序列為SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3‘；下游引物序列為=SEQ ID N0. 5 TLR2-promoter-R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反應(yīng)體系如下總體系為20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基因組 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. O μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所用的PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID NO. 2，測(cè)序峰圖如附 圖2，片段長(zhǎng)度為627bp，測(cè)序峰圖中自300bp往后的測(cè)序峰程套峰，此現(xiàn)象說(shuō)明該序列中 300bp 307bp的正鏈基因是AATGAATG，其互補(bǔ)鏈?zhǔn)乔八奈换蚴荰TAC且后四位基因缺失 的互補(bǔ)鏈的基因型，主鏈長(zhǎng)度為627bp，互補(bǔ)鏈長(zhǎng)度為623bp的表現(xiàn)型為AB的雜合子，鑒定 結(jié)果為海福特雜種牛。實(shí)施例3采用酚-氯仿抽提法從第三目標(biāo)牛血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物用于 擴(kuò)增TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段，所用的引物序列為上游引物序列為=SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3，；下游引物序列為=SEQ ID N0. 5 TLR2-promoter-R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反應(yīng)體系如下總體系為20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基 因組 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. 0 μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所用的PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1 %瓊脂糖電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID N0. 3，測(cè)序峰圖如附圖 3，片段長(zhǎng)度為623bp，該序列中300bp 307bp位點(diǎn)為AATGAATG/AATGCTTC的表現(xiàn)型為BB 的純合子時(shí)，則為其它品種的牛。實(shí)施測(cè)序序列結(jié)果利用ChromasPro vl. 41軟件進(jìn)行分析，然后采用DNAMAN軟件 進(jìn)行序列比對(duì)分析，尋找品種間的重要SNPs和品種特異的啟動(dòng)子區(qū)。表1.不同牛品種TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)的測(cè)序結(jié)果與300bp 307bp位點(diǎn)的基因型
權(quán)利要求
一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于先獲得目標(biāo)測(cè)試牛的基因，設(shè)計(jì)該基因TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)的上游引物和下游引物，建立聚合酶鏈反應(yīng)PCR體系，通過(guò)PCR方法來(lái)擴(kuò)增TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)鑒定TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)的300bp～307bp位點(diǎn)的基因型，來(lái)鑒別海福特純種牛和雜種牛，還是其它品種的牛。當(dāng)TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段為627bp，且300bp～307bp位點(diǎn)為AATGAATG/AATGAATG的純合子時(shí)，則為純種的海福特牛；當(dāng)TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段為627bp，且300bp～307bp位點(diǎn)為AATGAATG/AATGCTTC雜合子時(shí)，則為雜種的海福特牛；當(dāng)TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段為623bp，且300bp～307bp位點(diǎn)為AATGAATG/AATGCTTC的純合子時(shí)，則為其它品種的牛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于所述的 擴(kuò)增TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)的上游引物序列為=SEQ ID NO. 4，下游引物序列為=SEQ ID NO. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于所述 的PCR反應(yīng)體系是總體系為20 μ 1，其中包括10 IOOng的基因組DNA、1. 0 μ 1濃度為 IOpmol/μ 1 的上游引物、Ι.Ομ 1 濃度為 IOpmol/μ 1 的下游引物，2. Ομ 1 IOXPCR Buffer, 2 μ 1濃度為0. 25mM的dNTPs、2. OU酶活單位的Taq DNA聚合酶和滅菌水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于所述的 PCR方法擴(kuò)增TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)的反應(yīng)程序是94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退 火30s，72°C延伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其檢測(cè)牛的TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)627bp的300bp～307bp位點(diǎn)來(lái)鑒定是海福特純種?；蛘呤请s種牛，還是其它品種的牛。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、成本低等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。本發(fā)明的方法在海福特牛的品種引進(jìn)、海福特牛肉的進(jìn)出口貿(mào)易、與本地牛的雜交改良、肉牛新品系的培育、肉牛產(chǎn)品的分子標(biāo)識(shí)與溯源等方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101955999SQ20101023358
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者仲躋峰, 侯明海, 劉利, 李建斌, 李秋玲, 李榮嶺, 王澤英, 王長(zhǎng)法, 鞠志花, 黃金明 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心