專利名稱：一株人支氣管上皮細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株人支氣管上皮細胞，特別涉及一種通過α粒子輻射誘發(fā)人支氣 管上皮細胞惡性轉化得到的人支氣管上皮成瘤細胞。
背景技術：
據(jù)估計，人類所受天然輻射中50%的劑量來自于氡及子體衰變時發(fā)出的α粒子， 流行病學研究表明暴露于高水平的氡及子體可導致肺癌的發(fā)病率增高，因此，研究氡或者 說α粒子與人類肺癌的關系是輻射致癌研究領域的熱點。目前研究輻射致癌的主要途徑有1.流行病學調查，包括病例-對照研究、定群研 究等，即對不同劑量受照人群長時間健康的調查，確定接觸放射線以及輻射劑量與癌癥發(fā) 生的關系。2.動物實驗研究。這是確定某種因素是否具有致癌性所必須做的實驗研究，同 時可用于癌變的相關機理研究。3.體外細胞及分子生物學研究。是體外模擬細胞癌變并觀 察癌變過程中細胞學行為、分子學變化和發(fā)生機理的重要的手段和技術途徑，具有不可替 代的優(yōu)勢。體外細胞轉化實驗是指在體外培養(yǎng)的條件下，細胞自發(fā)或在處理因素的作用下發(fā) 生生長、增殖和分化等方面的失控性變化，進而表現(xiàn)出一系列惡性轉化表型并最終表現(xiàn)在 動物體內的致瘤性，是一項有效的研究致癌過程的方法，能模擬體內靶細胞向腫瘤細胞演 變的多階段過程。另外，在離體細胞培養(yǎng)條件下進行癌變觀察，可以在沒有其它因素的干擾 情況下研究癌變的過程與影響條件。因此，為了闡明輻射致癌的細胞和分子機理，采用體外 細胞惡性轉化的方法建立輻射誘發(fā)的體外癌變模型具有重要意義。體外細胞的轉化研究始于1963年，此后這方面的研究得到了迅速發(fā)展。多家實驗 室先后建立了 α粒子體外照射誘發(fā)的SHE、C3H10T1/2、BALB/3T3、大鼠肺成纖維細胞的惡 性轉化模型，上述細胞皆為嚙齒類動物的成纖維細胞。八十年代后期以來，細胞轉化體系 出現(xiàn)了從嚙齒類動物細胞向人類細胞、從成纖維細胞向上皮細胞轉變的趨勢，特別是運用 無血清培養(yǎng)技術建立的數(shù)株永生化人上皮細胞株，為體外癌變研究提供了更貼近人類的模 型。與嚙齒類動物細胞相比，人類細胞具有更好的基因穩(wěn)定性，較少的自發(fā)轉化和對致癌原 較強的抗性。人類腫瘤的80%鄒游起源于上皮組織，上皮組織的代謝、修復、分化等與成纖 維細胞明顯不同。因此，采用人的上皮細胞所建立的惡性轉化實驗模型更接近于人類腫瘤 的演進過程。BEP2D為永生化的人支氣管上皮細胞株，是由Harris CC及同事轉染人乳頭瘤病 毒18 (Human Papillomaviruses 18，HPV18)于正常人支氣管上皮細胞(NHBE)后永生化建 系，染色體核型為近二倍體，體外連續(xù)傳代100次以上未發(fā)生衰老和死亡，接種裸鼠飼養(yǎng)12 個月以上未觀察到具有成瘤性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一株人支氣管上皮細胞及其應用。
本發(fā)明所提供的人支氣管上皮細胞，是通過α粒子輻射誘發(fā)人支氣管上皮細胞 BEP2D惡性轉化得到的人支氣管上皮成瘤細胞系，名稱為人支氣管上皮細胞BERP35T4-Ta。人支氣管上皮細胞BERP35T4_Ta已于2010年4月21日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為=CGMCC No . 3748。本發(fā)明采用1.5Gy的238Pu α粒子照射永生化的人支氣管上皮細胞BEP2D，照后細 胞體外傳至35代建立細胞系BERP35，該細胞出現(xiàn)惡性轉化表型特征，接種裸鼠體內形成高 分化鱗狀上皮癌。分離培養(yǎng)BERP35在裸鼠體內所形成腫瘤的瘤組織細胞，體外連續(xù)傳代后 建立細胞系BERP35T4。將該細胞再次接種裸鼠，成瘤后將瘤組織在裸鼠體內連續(xù)傳代三次， 采用組織塊培養(yǎng)法，再次從裸鼠腫瘤組織中分離、培養(yǎng)、并建立細胞系BERP35T4-Ta。人支氣 管上皮細胞BERP35T4-Ta生長速度快，軟瓊脂克隆形成率高，對血清分化產生的抗性強，染 色體的多倍體發(fā)生率高，遷移能力強，認為該細胞具有較為典型的惡性腫瘤細胞的表型，并 且還具有較高的轉移潛能。細胞系BERP35T4-Ta與其親本細胞系BERP35、BERP35T4的對比分析，在一定 程度上可以從體外模擬的方式反映輻射致癌過程的三個階段啟動、促進及惡性進展。 BERP35T4-Ta，是研究輻射因素誘發(fā)細胞癌變過程中的分子變化事件、癌細胞轉移機制、尋 找腫瘤標記物和惡性腫瘤實驗治療的理想細胞模型系，具有十分重要的價值。


圖1為BERP35T4_Ta細胞角蛋白免疫組化分析(DAB顯色，X 100)圖 2 為 BEP2D、BERP35T4、BERP35T4_Ta 生長曲線圖3為光鏡觀察Transwell膜上從BERP35T4_Ta中分離的轉移細胞(X 100)
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施中所述的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1、人支氣管上皮細胞BERP35T4_Ta的建立1、α粒子輻射誘發(fā)永生化人支氣管上皮惡性轉化細胞BERP35T4的致瘤性采用BALB/c無胸腺裸鼠，鼠齡為5_6周，體重ll_15g，由中國醫(yī)學科學院實驗動物 研究所提供(許可證編號為京動許字017號)。第25代BEP2D細胞BEP2D為永生化的人支氣管上皮細胞株，是由Harris CC及 同事轉染人乳頭瘤病毒18 (Human Papillomaviruse 18，HPV18)于正常人支氣管上皮細 胞(NHBE)后永生化建系，染色體核型為近二倍體，體外連續(xù)傳代100次以上未發(fā)生衰老 和死亡，接種裸鼠飼養(yǎng)12個月以上未觀察到具有成瘤性。Harris教授將該細胞饋贈于 本實驗室，文獻 Willey JC, Broussoud A，Sleemi A，et al. Immortalization of normal human bronchial epithelial cells by human papillomavirus 16 or 18. Cancer Res., 1991,51 (19) :5370-77已公開該細胞，申請人已經保存該細胞。實驗室將該細胞培養(yǎng)在底 面積為75cm2的培養(yǎng)瓶中，三天換一次液(培養(yǎng)液為LHC-8，購自Biosource公司，貨號為 P141-500)，待細胞長至80%融合(大約一周時間)傳代，傳代比例為1 3，該細胞稱為第2代BEP2D細胞。如此傳25代，即為第25代BEP2D細胞。第15代BERP35T4細胞用1. 5Gy的238Pu α粒子照射BEP2D細胞，照后細胞正常 培養(yǎng)、傳代，將照后35代細胞接種裸鼠，將成瘤裸鼠的瘤組織無菌分離后，培養(yǎng)得到瘤組織 細胞BERP35T4。該細胞連續(xù)傳代15次即為第15代BERP35T4。該過程中所用的培養(yǎng)液均 為 LHC-8。將該裸鼠分為2組，每組9只，雌雄兼半實驗組接種第15代BERP35T4細胞；對 照組接種第25代BEP2D細胞。每只裸鼠接種約2-3Χ106細胞。經過三周潛伏期，接種 BERP35T4細胞的9只裸鼠中，1只出現(xiàn)腫瘤，隨后陸續(xù)有3只出現(xiàn)腫瘤，而接種BEP2D細 胞的9只裸鼠無一出現(xiàn)腫瘤。選取一只帶瘤裸鼠，拉斷脊髓處死，摘除皮下移植瘤，切成 0.2X0.2X0. 2cm3的小塊，置于套管針內接種于新裸鼠皮下，繼續(xù)傳代，共連續(xù)傳代3次，接 種裸鼠14只，移植瘤均能成活并生長，鼠間腫瘤傳代成瘤率達到100%，成瘤潛伏期明顯縮 短，約為7-14天，傳代間隔時間約為3. 5周(表1)。表1BERP35T4裸鼠原代接種及鼠間傳代 2、α粒子輻射誘發(fā)永生化人支氣管上皮成瘤細胞BERP35T4_Ta的建立采用組織塊培養(yǎng)法在無菌條件下，取新鮮腫瘤組織仔細剝除膜和血管成分，避開 腫瘤組織中心退變和壞死區(qū)，挑取活力較好部位，以無菌PBS緩沖液(PH 7. 2)沖洗三次，移 至小培養(yǎng)皿中，滴加數(shù)滴LHC-8培養(yǎng)基(Gibco公司)潤濕組織塊，用眼科剪剪成2-3mm3小 塊，用眼科鑷將小塊移置到25cm2培養(yǎng)瓶瓶底上，小塊間距離為0. 5cm左右，將培養(yǎng)瓶輕輕 翻轉過來，令瓶底朝上，加入LHC-8培養(yǎng)基5ml，擰上瓶蓋，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中放置2 小時。緩慢翻轉培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)基覆蓋瓶底組織塊，注意避免組織塊被培養(yǎng)基沖起。往后幾 周內觀察細胞爬出情況，每三天換LHC-8培養(yǎng)基一次。待爬出細胞生長至70-80%融合后， 用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)向細胞上加入2ml 0.25%胰酶(購自Gibco公司，貨號為 25200-056)，37°C消化5_7分鐘，待細胞全部變圓并從瓶壁上脫落后，加入2ml終止液(含 有10% (體積百分含量)血清(購自PAA公司，貨號為A15-101)的DMEM培養(yǎng)基(購自 Gibco公司，貨號為12800-017)，用吸管將細胞懸液轉移至離心管中，1500轉/分鐘離心5 分鐘，將上清吸走，再向細胞沉淀中加入5ml PBS緩沖液(pH 7. 2)，用吸管輕輕地將細胞沉 淀吹散，再次離心，1500轉/分鐘離心5分鐘，將上清吸走，加入2ml LHC-8培養(yǎng)基將細胞 沉淀吹散，均勻分到三個25cm2培養(yǎng)瓶中，再向每個培養(yǎng)瓶中加入5ml LHC-8培養(yǎng)基，即完 成傳代，完成傳代的腫瘤細胞即為BERP35T4-T。當該細胞在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)(培養(yǎng)基為 LHC-8培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37°C、5% CO2培養(yǎng)箱，每代的培養(yǎng)時間為72小時)20代后，將此細 胞以1 X IO3/皿的密度接種于60mm培養(yǎng)皿中使之為單細胞生長，當單細胞分裂成上千個細
5胞成為克隆時，挑選生長狀態(tài)良好的單克隆，用去頭的槍尖挑取單克隆并培養(yǎng)建立α粒子 輻射誘發(fā)永生化人支氣管上皮成瘤細胞BERP35T4-Ta。人支氣管上皮細胞BERP35T4_Ta已于2010年4月21日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為=CGMCC No . 3748。3、腫瘤細胞BERP35T4_Ta生物學特性的研究3. 1BERP35T4-Ta細胞免疫化學分析蓋玻片培養(yǎng)細胞BERP34T4_Ta，用預冷的甲醇固定10分鐘，丙酮固定5分鐘后，用 0. 3%過氧化氫作用20分鐘以消除內源性過氧化物酶；10%胎牛血清作用20分鐘，封閉非 特異結合位點；加入兔抗人角蛋白多抗(購自北京中山生物技術公司)(1 50)，4°C孵育 過夜；PBS(pH 7.2)沖洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(購自北京中山生物 技術公司)(1 50)，4°C孵育4小時；PBS緩沖液(pH 7. 2)沖洗3次，DAB顯色液(0. 1% H2O2)顯色5-10分鐘，結果顯示，胞漿深染(圖1)，證實了腫瘤細胞BERP35T4-Ta的上皮來 源。3. 2BERP35T4-Ta細胞生長曲線的測定分別將BERP35T4、BERP35T4-Ta和BEP2D細胞以1 X IO4/孔的密度接種于12孔細 胞培養(yǎng)板上(培養(yǎng)基LHC-8 ；培養(yǎng)條件37°C、5% CO2)，24小時后每天消化3孔細胞并計 數(shù)，持續(xù)8天，根據(jù)測定結果繪制細胞生長曲線(圖2)，并計算細胞生長指數(shù)(η)，從而進一 步計算細胞倍增時間(PDT)。計算公式如下η = (InN1-InN0)/(t-t0)PDT (h) = 0. 693/nN為細胞計數(shù)；t為測定時間計算出細胞倍增時間依次為BEP2D 66小時、BERP35T430小時、BERP35T4_Tal8小 時?？梢姡[瘤細胞BERP35T4-Ta的生長速度明顯增快。3. 3軟瓊脂克隆實驗細胞在瓊脂中的集落形成率(colony forming efficiency，CFE)是細胞惡性程度 高低的重要標志。用PBS緩沖液配制濃度為3. 5%的瓊脂，高壓滅菌10分鐘。用LHC-8培 養(yǎng)基將3. 5%瓊脂稀釋5倍至0. 7%作為下層瓊脂，在6孔板中以3ml/孔鋪制底層瓊脂，凝 固后備用。再用LHC-8培養(yǎng)基將0. 7%瓊脂稀釋一倍至0. 35%作為上層瓊脂，放在40°C水 浴中備用。將BERP35T4、BERP35T4-Ta和BEP2D細胞按常規(guī)方法消化并計數(shù)后，與0. 35% 上層瓊脂混勻，3ml/孔鋪于0.7%的下層瓊脂上，細胞的接種量為IXlO4/孔。待上層瓊脂 凝固后，表面加上2ml LHC-8培養(yǎng)基，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每三天換液一次。表2列 出了各類細胞的CFE，可以看出，BERP35T4、BERP35T4_Ta細胞的CFE均明顯高于對照細胞 BEP2D (ρ < 0. 05)，而 BERP35T4-Ta 的 CFE 也高于 BERP35T4。表明，BERP35T4_Ta 細胞的惡 性程度較BERP35T4有很大的提高。表2.BEP2D、BERP35T4及BERP35T4-Ta細胞的軟瓊脂克隆形成率(x 土 s) “ * ” 表示 ρ < 0. 053. 4血清抗性檢測在血清的誘導分化作用下，正常的上皮細胞會發(fā)生鱗狀分化，而惡性轉化細胞和 腫瘤細胞則具有抵抗能力。接種1000個指數(shù)生長期的細胞于6孔板中，加入3ml含10% (體積百分含量)胎牛血清的LHC-8培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天后，對照組BEP2D細胞出現(xiàn)鱗狀分化， 生長迅速減慢，細胞變扁大并逐漸死亡。而BERP35T4和BERP35T4_Ta細胞培養(yǎng)14天后逐 漸形成集落(表3)，由表中可見，腫瘤細胞BERP35T4-Ta對血清誘導的終末分化的抵抗力明 顯增強(P < 0. 05)。表3. BEP2D、BERP35T4及BERP35T4_Ta細胞對血清促分化能力的抗性( 士 s) “ * ” 表示 ρ < 0. 053. 5Transwell技術測定細胞的遷移率在Transwell裝置中下層加入LHC-8培養(yǎng)基2. 6ml，上層加入培養(yǎng)基1. 2ml，置于 37°C孵箱中過夜。第二天，將BEP2D、BERP35T4和BERP35T4_Ta細胞以3 X IO4/孔的密度接 種于Transwell裝置的膜上，該裝置的參數(shù)如下聚碳酯膜直徑為24mm，厚為10 μ m,孔徑為 0. 8 μ m，孔的密度為lX105/cm3。置于37°C、5% CO2孵箱中孵育約6小時，將膜取出進行常 規(guī)Giemsa染色。染色結果顯示BEP2D細胞沒有發(fā)生遷移，而BERP35T4_Ta的遷移率高于 BERP35T4細胞(如圖3)。
權利要求
人支氣管上皮細胞，其名稱為BERP35T4 Ta，保藏登記號為CGMCC №.3748。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株人支氣管上皮細胞。該人支氣管上皮細胞，其名稱為BERP35T4-Ta，保藏登記號為CGMCC №.3748。人支氣管上皮細胞BERP35T4-Ta生長速度快，軟瓊脂克隆形成率高，對血清分化產生的抗性強，染色體的多倍體發(fā)生率高，遷移能力強，認為該細胞具有較為典型的惡性腫瘤細胞的表型，并且還具有較高的轉移潛能。該細胞研究輻射因素誘發(fā)細胞癌變過程中的分子變化事件、癌細胞轉移機制、尋找腫瘤標記物和惡性腫瘤實驗治療的理想細胞模型系，具有十分重要的價值。
文檔編號C12R1/91GK101892197SQ201010233630
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權日2010年7月19日
發(fā)明者吳德昌, 周平坤, 胡迎春, 陳忠民 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所