專利名稱：丙酮丁醇產生菌發(fā)酵菊芋生產丁醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及丁醇的生產方法，特別是利用丙酮丁醇產生菌發(fā)酵菊芋生產丁醇的技術。
背景技術：
與乙醇相比，丁醇具有能量密度高、親水性弱、腐蝕性小、更易與汽油或柴油混合等優(yōu)點，更適宜于作為發(fā)動機燃料，因此被認為是第二代生物燃料[Dtore P. Biobutanol an attractive biofuel. Biotechnol J，2007，2 1525-1534]。目前丁醇主要以淀粉質原料如玉米、小麥、黍米等和糖質原料如糖蜜生產[Jones DT, Woods DR. Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiol Rev, 1986,50 :484-524]，原料成本高的問題十分突出。此外，與燃料乙醇一樣，以糧食類淀粉質原料大規(guī)模生產丁醇作為燃料，也會產生影響糧食安全的社會問題。開發(fā)廉價的、非糧生物質原料，是發(fā)展丁醇作為生物燃料的必然出路。生產丁醇的傳統(tǒng)方法為ABEacetone-butanol-ethanol)發(fā)酵，使用丙酮丁醇梭菌生產丙酮和丁醇。上個世紀20年代許多國家都能夠以ABE發(fā)酵商業(yè)運行生產丙酮和丁醇。二戰(zhàn)后，隨著石油化工和化學合成技術的快速發(fā)展，ABE發(fā)酵生產丁醇在成本上逐漸失去競爭優(yōu)勢，走向衰退?，F(xiàn)今隨著石油資源短缺以及石油化工原料成本的升高，ABE發(fā)酵生產丁醇重新恢復了生機。但是，傳統(tǒng)ABE發(fā)酵采用糧食類淀粉質原料造成丁醇成本高的問題十分突出。菊芋(Jerusalem artichoke)，又名洋姜或鬼子姜，為菊科向日葵屬多年生宿根性草本植物，其生態(tài)適應性強，耐旱、耐寒、耐鹽堿，能夠在不適宜于糧食和經濟作物生長的鹽堿地、灘涂地等邊際土地上種植，生物量產量高[隆小華，劉兆普，王琳，等.半干旱地區(qū)海涂海水灌溉對不同品系菊芋產量構成及離子分布的影響.土壤學報，2007,44 :300-306]。 鮮菊芋塊莖中含水70 80%，碳水化合物15 20%，以菊粉的形式存在。菊粉(Inulin)， 又稱菊糖，是由D-果糖經β _2，1糖苷鍵連接的聚合度不高的聚果糖，末端為一個葡萄糖殘基[Khodzhaeva MA, Kondratenko ES. The structure of the inulin from inula grandis. Chem Nat Compd，1982，3 :394-395]。與目前國內外普遍關注的以農作物秸稈為代表的木質纖維素類生物質原料相比，菊芋易被酸或菊粉酶水解而生成果糖和葡萄糖的混合物，是生產果糖、果糖基產品和微生物發(fā)酵生產生物燃料和生物基化學品等的良好原料 [Denoroy P.The crop physiology of helianthus tuberosus L. :a model orientated view. Biomass and Bioenergy，1996，11 :11-32]。以菊芋塊莖為原料生產乙醇的研究工作在國內外均有報道[Nakamura T， Ogata Y， Hamada S， et al.Ethanol production from Jerusalem artichoke tubers by Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae. J Ferment Bioeng，1996，81 564—566 ；Caserta G，Cervigni T.The use of Jerusalem artichoke stalks for the production of fructose or ethanol. Bioresource Technol，1991，35 :247-250.]，然而鮮
3菊芋塊莖含水量高，直接水解獲得的糖難以滿足乙醇發(fā)酵對高濃度底物的要求，但卻可以很好地滿足丁醇發(fā)酵的要求。由于丁醇發(fā)酵梭菌沒有菊粉酶生產能力，不能水解菊芋中的菊粉多糖，因此生產丁醇時需要對菊芋原料進行水解。本發(fā)明以菊芋汁或菊芋漿酸水解糖為底物，可以有效開辟丁醇發(fā)酵生產中的廉價原料來源。

發(fā)明內容
本申請的目的在于提供一種丁醇發(fā)酵生產方法，該方法包括用丙酮丁醇產生菌發(fā)酵菊芋原料的步驟。在一個具體實施例中，所述方法包括(1)提供菊芋原料；(2)用酸水解該菊芋材料，獲得菊芋水解液；(3)向步驟( 所得的菊芋酸水解液添加無機鹽營養(yǎng)成分制備成丙酮丁醇產生菌發(fā)酵培養(yǎng)基；和(4)將丙酮丁醇產生菌接種到步驟C3)所得的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行厭氧發(fā)酵，從而產生丁醇。在一個具體實施例中，所述菊芋材料選自菊芋的塊莖。在一個具體實施例中，所述步驟(2)包括，將菊芋材料制備成菊芋汁或菊芋漿后， 用酸將該菊芋汁或菊芋漿的PH調節(jié)至2 3后，在100 105°C條件下將該菊芋汁或菊芋漿保溫60 80分鐘，然后加入堿，將菊芋汁或菊芋漿水解液的pH調節(jié)為5. 5 6. 0之間。在一個具體實施例中，所述丙酮丁醇產生菌為Clostridium acetobutylicum。在一個具體實施例中，所述步驟C3)還包括，在將無機鹽營養(yǎng)成分添加到菊芋水解液之前，將該水解液的糖濃度稀釋到45 100g/L。在一個具體實施例中，所述無機鹽營養(yǎng)成分包括=K2HPO4、KH2PO4和MgSO4 · 7H20。在一個具體實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基不含有外源氮源和生長因子。本申請另一方面提供一種生產丁醇用的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有(1)菊芋水解液；和(2)無機鹽營養(yǎng)成分；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基不含有外源的氮源和生長因子。在一個具體實施例中，所述菊芋水解液經酸水解制得，且其中所述菊芋水解液中的糖濃度范圍為45 100g/L。在一個具體實施例中，所述菊芋水解液如下制備得到將菊芋材料制備成菊芋汁或菊芋漿后，用酸將該菊芋汁或菊芋漿的PH調節(jié)至2 3，然后在100 105°C條件下將該菊芋汁或菊芋漿保溫60 80分鐘，加入堿，將菊芋汁或菊芋漿水解液的pH調節(jié)為5. 5 6. 0之間。在一個具體實施例中，可使用自來水將經堿調節(jié)pH的水解液的糖濃度范圍調節(jié)為 60 70g/L。在一個具體實施例中，所述發(fā)酵液的pH為5. 3 5. 8。本申請還提供一種制備生產丁醇用的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，該方法包括(a)提供菊芋水解液；和
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(b)向所述菊芋水解液中添加無機鹽營養(yǎng)成分；從而制備得到生產丁醇用的發(fā)酵培養(yǎng)基。在一個具體實施例中，所述步驟(a)包括將菊芋材料制備成菊芋汁或菊芋漿后， 用酸將該菊芋汁或菊芋漿的PH調節(jié)至2 3，然后在100 105°C條件下將該菊芋汁或菊芋漿保溫60 80分鐘，加入堿，將菊芋汁或菊芋漿水解液的pH調節(jié)為5. 5 6. 0之間。在一個具體實施例中，所述步驟(a)還包括，使用自來水將經堿調節(jié)PH的水解液的糖濃度范圍調節(jié)為45 100g/L。在一個具體實施例中，所述步驟(b)包括向步驟(a)的菊芋水解液中添加Κ2ΗΡ04、 KH2PO4 和 MgSO4 · 7H20。在一個具體實施例中，所述方法還包括步驟(C)用酸將步驟(b)所得的添加了無機鹽營養(yǎng)成分的菊芋水解液的PH調節(jié)為5. 3 5. 8之間。本申請也包括本申請的發(fā)酵培養(yǎng)基在生產丁醇中的用途。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示丙酮丁醇梭菌發(fā)酵過程殘?zhí)菨舛鹊淖兓?。圖2顯示丙酮丁醇梭菌發(fā)酵過程生物量濃度的變化。圖3顯示丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產丁醇。圖4顯示丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產丙酮。圖5顯示丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產乙醇。
具體實施例方式本申請第一方面提供一種丁醇生產方法，該方法包括用丙酮丁醇產生菌發(fā)酵菊芋原料的步驟。用于本申請的丙酮丁醇產生菌包括本領域使用的各種用于生產丙酮丁醇的菌， 包括但不限于Clostridium saccharoacetobutylicum(中國工業(yè)微生物菌種目錄編號 8004)、Clostridium acetobutylicum(中國工業(yè)微生物菌種目錄編號 8008)、Clostridium pasteurianum(中國工業(yè)微生物菌種目錄編號8017) ,Clostridium tetryl (中國工業(yè)微生物菌種目錄編號8020)等。在一個具體實施例中，可使用丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.70進行發(fā)酵。獲得菊芋原料后，可直接將其壓榨成汁或者漿。所述菊芋原料是菊芋塊莖。向菊芋原料(包括壓榨得到的汁或漿)中加入酸，使溶液的PH在2 3之間。然后將所得溶液于100 105°C條件下保溫60 80分鐘，使其水解。之后，加入堿將水解液的PH值調節(jié)到5. 5 6. 0之間，得到菊芋水解液?？墒褂酶鞣N無機酸，包括但不限于鹽酸和硫酸。對酸的濃度無特別限制，只要其可使加入后所得溶液的PH在2 3之間即可。通常，使用濃酸。所用的堿可以是各種堿，例如KOH和NaOH等，其濃度并無特殊限制，只要可將水解液的PH調節(jié)到5. 5 6. 0之間即可。在一個具體實施例中，使用堿金屬的堿將水解液的pH調節(jié)到5. 8 6.0左右。獲得的菊芋水解液可于121°C加熱滅菌，之后即可冷卻使用或冷卻后保存?zhèn)溆?。在使用前，可先用自來水將菊芋水解液的糖濃度稀釋?5 100g/L。在一個優(yōu)選實施例中，所述糖濃度范圍為50 80g/L。在其它優(yōu)選實施例中，所述糖濃度范圍為60 70g/L。然后可將無機鹽營養(yǎng)成分添加到該調節(jié)了糖濃度的菊芋水解液中。添加到本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽營養(yǎng)成分可包括K2HPO4, KH2PO4和MgSO4 · 7H20。所添加的無機鹽營養(yǎng)成分的量，以制成的發(fā)酵培養(yǎng)基計，為K2HPO4O. 35 0. 65g/ L、KH2PO4O. 35 0. 65g/L、MgSO4 · 7Η20 0· 1 0. 3g/L。在一個優(yōu)選的實施例中，K2HPO4的濃度為0. 4 0. 55g/L。在其它優(yōu)選實施例中， K2HPO4 的濃度為 0. 45 0. 5g/L。在一個優(yōu)選的實施例中，KH2PO4的濃度為0. 4 0. 55g/L。在其它優(yōu)選實施例中， KH2PO4 的濃度為 0. 45 0. 5g/L。在一個優(yōu)選的實施例中，MgSO4 ·7Η20的濃度為0. 15 0. 25g/L。在其它優(yōu)選實施例中，MgSO4 · 7H20 的濃度為 0. 15 0. 2g/L。在一個具體實施方式
中，所使用的無機鹽營養(yǎng)成分的濃度為=K2HPO4O. 5g/L， KH2PO4O. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L。添加完無機鹽營養(yǎng)成分之后，可用酸將所得到的菊芋水解液的pH調節(jié)到5. 3 5. 8之間，優(yōu)選5. 5左右。由此可獲得本申請的發(fā)酵培養(yǎng)基。因此，在一個具體實施例中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基含有菊芋水解液和無機鹽營養(yǎng)成分，該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 3 5. 8，糖濃度為45 100g/L，無機鹽營養(yǎng)成分包括 K2HPO4O. 35 0. 65g/L, KH2PO4O. 35 0. 65g/L、MgSO4 · 7Η200· 1 0. 3g/L。應理解，本申請的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH、糖濃度以及無機鹽營養(yǎng)成分的范圍可為上文所述的任一范圍。例如，在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基含有菊芋水解液和無機鹽營養(yǎng)成分，該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 3 5. 8，糖濃度為60 70g/L，無機鹽營養(yǎng)成分包括 K2HPO4O. 4 0. 55g/L、KH2PO4O. 4 0. 55g/L、MgSO4 · 7H20 0. 15 0. 25g/L。菊芋水解液中的糖以果糖為主，但含有少量葡萄糖。所述糖濃度為葡萄糖和果糖的濃度之和。在一個具體實施例中，本申請的發(fā)酵培養(yǎng)基不含有/添加外源氮源和生長因子?！巴庠吹春蜕L因子”指來源于菊芋水解液之外的氮源和生長因子。換言之，本申請的發(fā)酵培養(yǎng)基不含有來源于菊芋水解液之外的氮源和/或生長因子。生長因子可以是，例如鄰氨基苯甲酸和生物素。氮源可以是，例如乙酸銨等。因此，在一個具體實施方式
中，本申請的發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有/添加外源乙酸銨、鄰氨基苯甲酸和生物素。丙酮丁醇產生菌的培養(yǎng)采用常規(guī)方法。例如，可將丙酮丁醇產生菌接種到前述添加了各種培養(yǎng)基成分的菊芋水解液中，進行發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)中，可采用批式或連續(xù)發(fā)酵的方式進行培養(yǎng)。以下將以具體實施例的方式描述本發(fā)明。應理解，本發(fā)明并不限于下述具體實施
6方式。實施例中所使用的成分及其單位，除非另有說明，否則都是可以從市場上購得的常規(guī)物品，其單位也是本領域的常規(guī)單位。
具體實施例方式1材料與方法1. 1實驗材料1. 1. 1 菌種采用的菌種為丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株編號1. 70。1. 1. 2實驗原料菊芋汁或漿鮮菊芋塊莖直接壓榨制得。1. 2實驗方法1.2. 1培養(yǎng)基配制葡萄糖培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖50，乙酸銨 2. 3，K2HPO4O. 5，KH2PO4O. 5，MgSO4 · 7H20 0. 2，鄰氨基苯甲酸0. 01，生物素0. 01，初始pH 5. 5。果糖培養(yǎng)基(g/L)果糖50，乙酸銨 2. 3，K2HPO4O. 5，KH2PO4O. 5，MgSO4 · 7H20 0. 2， 鄰氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，初始pH 5.5。菊芋汁用硫酸調節(jié)至pH值2. 0 3. 0，沸水浴保溫維持60min使菊粉水解，用NaOH 調節(jié)水解液至PH 6.0，即得菊芋汁水解液(HJA)，于121°C蒸汽滅菌20min，冷卻后保存?zhèn)溆?。將準備好的菊芋汁水解液稀釋到所需的糖濃度，添加K2HPO4O. 5，KH2PO4O. 5，MgSO4 ·7H20 0.2 (g/L)，用少量硫酸調節(jié)其初始pH 5.5。以上培養(yǎng)基接種前均在121°C下蒸汽滅菌15min。1. 2. 2培養(yǎng)方法菌種活化培養(yǎng)將ImL冷凍保藏的菌種接種于20mL玉米醪試管培養(yǎng)基中，沸水浴下處理1 2min，在溫度37. 5 °C下厭氧活化培養(yǎng)，自然pH值。搖瓶培養(yǎng)將活化好菌種以體積比10%的接種量接種于IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中，充無菌氮氣lOmin，于溫度37. 5°C，150r/min搖床培養(yǎng)，初始pH為5. 5。發(fā)酵罐培養(yǎng)在2.5L發(fā)酵罐(KF-2.5)中進行，裝液量為1L，接種量10% (V/V)，攪拌轉速150r/min，發(fā)酵溫度37.5°C，初始pH 5. 5。接種后向發(fā)酵罐中通入無菌氮氣30min， 以保證發(fā)酵罐內的厭氧環(huán)境。1.2. 3糖的測定糖濃度測定采用DNS法[欒雨石，包永明.生物工程實驗技術手冊.北京化學工業(yè)出版社，2005，1-7]。對葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基和發(fā)酵液，其標準曲線使用葡萄糖標準溶液繪制；以果糖和菊芋汁水解液為碳源的培養(yǎng)基和發(fā)酵液，其標準曲線使用果糖標準溶液繪制。樣品離心處理后，取適當稀釋的上清液lmL，加入ImL水，再加入1. 5mL DNS試劑，搖勻，沸水浴5min，立即冷卻至室溫，加蒸餾水至25mL，搖勻，540nm測吸光度，根據相應的標準曲線計算樣品糖濃度。接種后立即取樣，測定初始糖濃度；發(fā)酵過程中或發(fā)酵結束后取樣，測定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛取?br> 7
1. 2. 3生物量的測定搖瓶發(fā)酵由于菌體濃度低，且發(fā)酵液中含有的少量固形物對生物量測定干擾嚴重，因此嚴格控制實驗組與對照組接種量和其他實驗條件，比較添加氮源和維生素對溶劑生產的影響。發(fā)酵罐培養(yǎng)過程生物量測定方法如下取2. 5mL發(fā)酵液離心，12000r/min離心5min后，用去離子水洗滌2次，在85°C下干燥至恒重。1.2.4溶劑測定方法用氣相色譜HP-INN0WAX(19091N-233)測定溶劑各組分，F(xiàn)ID檢測器。色譜條件 毛細管色譜柱(30mX0. 25mmX0. 50 μ m)，柱溫100°C ；進樣溫度250°C ；FID檢測器溫度 3000C，H2 流速 40mL/min,空氣流速 400mL/min ；載氣 N2 流速 30mL/min ；進樣量 0. 2 μ L,分流比50 1。采用內標法定量，內標物為異丁醇。2.結果發(fā)酵培養(yǎng)基組成對C.acetobutylicum生長和溶劑生產各個環(huán)節(jié)的調控至關重要。目前以玉米為原料生產丁醇，按照發(fā)酵要求濃度調配的粉漿蒸煮后，冷卻到發(fā)酵溫度即可使用，無需添加任何營養(yǎng)組分。與玉米原料相比，菊芋塊莖灰分偏高，磷含量足以滿足需求，但蛋白含量很低，因此以菊芋汁為發(fā)酵底物是否需要補充氮源，需要通過實驗來確定。此外，已有研究工作表明生物素和氨基苯甲酸是C.acetobutylicum菌體生長和溶劑生產必需的維生素[Soni BK, Soucaille P, Goma G. Continuous acetone-butanol fermentation influence of vitamins on the metabolic activity of Clostridium acetobutylicum. Appl Microbiol Biotechnol, 1987,27 :1-5]，但菊芋汁水解液作為發(fā)酵底物是否需要添加這兩種維生素尚未見報道。2. 1氮源對菊芋汁丁醇生產的影響添力口乙酸鹽有助于溶劑生產[Chen CK,Blaschek HP. Acetate enhances solvent production and prevents degeneration in Clostridum beijerinckii BA 101. Appl Microbiol Biotechnol, 1999，52 :170-173]，因此乙酸銨是 C. acetobutylicum 培養(yǎng)的良好氮源。表1所示為向培養(yǎng)基中添加2. 3g/L乙酸銨時批式發(fā)酵的實驗結果。可見，與對照組相比，添加乙酸銨沒有明顯促進溶劑，特別是丁醇的生產，表明菊芋汁水解液作為底物培養(yǎng) C. acetobutylicum生產丁醇不需要添加氮源。表1培養(yǎng)基中氮源對菊芋汁丁醇發(fā)酵的影響
權利要求
1.一種丁醇發(fā)酵生產方法，其特征在于，該方法包括用丙酮丁醇產生菌發(fā)酵菊芋原料的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供菊芋原料；(2)用酸水解該菊芋原料，獲得菊芋水解液；(3)向步驟( 所得的菊芋酸水解液添加無機鹽營養(yǎng)成分制備成丙酮丁醇產生菌發(fā)酵培養(yǎng)基；和(4)將丙酮丁醇產生菌接種到步驟C3)所得的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行厭氧發(fā)酵，從而產生丁醇。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括，將菊芋材料制備成菊芋汁或菊芋漿后，用酸將該菊芋汁或菊芋漿的PH調節(jié)至2 3后，在100 105°C條件下將該菊芋汁或菊芋漿保溫60 80分鐘，然后加入堿，將菊芋汁或菊芋漿水解液的PH調節(jié)為 5. 5 6. 0之間。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇產生菌為 Clostridium acetobutylicum。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)還包括，在將無機鹽營養(yǎng)成分添加到菊芋水解液之前，將該水解液的糖濃度調節(jié)到45 100g/L。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述無機鹽營養(yǎng)成分為K2HP04、KH2PO4和 MgSO4 · 7H20。
7.—種生產丁醇用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有(1)菊芋水解液；和(2)無機鹽營養(yǎng)成分；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 3 5. 8，且其中所述菊芋水解液經酸水解，其糖濃度范圍為45 100g/L。
8.如權利要求7所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述無機鹽營養(yǎng)成分包括Κ2ΗΡ04、 KH2PO4 和 MgSO4 · 7H20。
9.如權利要求6所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基不含有外源氮源和生長因子。
10.一種制備權利要求7-9中任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，該方法包括(a)提供的菊芋水解液；和(b)向所述菊芋水解液中添加無機鹽營養(yǎng)成分；從而制備得到生產丁醇用的發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，提供一種丙酮丁醇產生菌發(fā)酵菊芋生產丁醇的方法，該方法包括以菊芋塊莖為原料，制備成菊芋汁或菊芋漿，用酸將菊芋汁或菊芋漿水解，制得菊糖水解液；以菊糖水解液為碳源，向其中加入無機鹽營養(yǎng)成分，接入丙酮丁醇產生菌，厭氧發(fā)酵生產丁醇的步驟。采用本發(fā)明所述原料和發(fā)酵方法，可以替代我國現(xiàn)有丁醇工業(yè)生產中所采用的玉米粉、小麥粉等糧食類原料，為丁醇作為生物燃料大規(guī)模生產奠定了基礎。
文檔編號C12P7/16GK102337305SQ20101023470
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者白鳳武, 辛程勛, 陳麗杰 申請人:九環(huán)菊芋生物產業(yè)股份有限公司, 大連理工大學